Ултразвукова фрагментация на ДНК за секвениране от следващо поколение
Секвенирането от следващо поколение (NGS) изисква надеждно срязване и фрагментиране на геномната ДНК, за да се секвенират веригите на геномната ДНК и да се създадат геномни библиотеки. Контролираното фрагментиране на ДНК в ДНК фрагменти е съществен етап от подготовката на пробите, необходим преди секвенирането на ДНК. Ултразвуковата обработка е доказано ефективна и надеждна техника за фрагментиране на ДНК до определена дължина. Протоколите за ултразвукова фрагментация на ДНК постигат възпроизводими резултати от фрагментацията. Ултразвуковите апарати на Hielscher могат да създават широк диапазон от разпределения по размер на фрагментите на геномната ДНК, които могат да се контролират прецизно чрез работните параметри. Тъй като системите на Hielscher за ултразвуково срязване на ДНК се предлагат за единични и множество флакони, както и за микроплаки, подготовката на пробите става високоефективна.
Ултразвуковият апарат за плаки UIP400MTP за подготовка на проби с висок капацитет обработва равномерно с ултразвук проби в многогнездови плаки, микротитърни плаки и плаки с 96 гнезда
- повторяеми / възпроизводими резултати
- прецизно регулиране за получаване на определена дължина на фрагментите
- бърза обработка
- еднакви резултати от фрагментацията на ДНК
- апарати за всякакви обеми на пробите (напр. множество флакони или микроплаки)
- висок капацитет за обработка на проби
- прецизен контрол на температурата
- лесна, удобна за потребителя работа
Секвениране от следващо поколение: ултразвукова фрагментация на ДНК за подготовка на библиотеки
За извършване на секвениране от следващо поколение трябва да се изпълнят трите основни етапа: (1) подготовка на библиотеки, (2) секвениране и (3) анализ на данните. По време на подготовката на библиотеките ДНК се фрагментира, след което краищата на фрагментите се поправят (изглаждат) чрез добавяне на една аденинова база и целевите фрагменти се превръщат в двуверижна ДНК. Накрая чрез лигиране, PCR или тагментация се прикрепят т.нар. адаптери, така че крайният ДНК продукт на библиотеката да може да бъде количествено определен за секвениране.
Фрагментация на ДНК чрез ултразвукова обработка: Особено при използване на технологии за секвениране с къси прочити, като Illumina, които не могат лесно да разчитат по-дълги ДНК фрагменти, веригите на ДНК трябва да се фрагментират до определен размер, което може надеждно да се постигне чрез ултразвукова обработка.
Ултразвуковата обработка може надеждно да се използва за фрагментация на ДНК, РНК и хроматин.
Секвениране от следващо поколение – подготовка на библиотеки
Ултразвуковата фрагментация на ДНК често се използва при подготовката на библиотеки за секвениране на ДНК за платформи за секвениране от следващо поколение (NGS). Тази техника се използва за разкъсване на ДНК молекулите на по-малки фрагменти в желания диапазон от размери, което улеснява следващите етапи от подготовката на библиотеките. Ултразвуковата фрагментация на ДНК обикновено е необходима на етапа на подготовка на библиотеки в работните процеси за NGS, за да се фрагментира геномната ДНК на по-малки части, подходящи за последваща обработка и секвениране. Тя играе решаваща роля за осигуряване на успеха на експеримента по секвениране чрез създаване на ДНК фрагменти в подходящия диапазон от размери за конкретната използвана платформа за секвениране.
Електрофоретични анализи на геномна ДНК на E. coli EDL933, подложена на ултразвукова обработка за 0 – 15 min. L обозначава ДНК маркера за размер. (Basselet et al. 2008)
Секвениране от следващо поколение – етапи на процеса:
- Ултразвукова фрагментация на ДНК: Преди конструирането на библиотеката геномната ДНК се фрагментира на по-малки, по-лесни за обработка части. Ултразвуковата фрагментация включва използване на високочестотни звукови вълни за срязване на ДНК молекулите на фрагменти в желания диапазон от размери. Този етап е решаващ, тъй като помага да се гарантира, че прочитите, генерирани по-късно при секвенирането, ще бъдат с подходяща дължина за използваната платформа за секвениране. Диапазонът от размери на фрагментите може да се регулира според конкретните изисквания на експеримента по секвениране.
- Клонална амплификация чрез PCR: След ултразвуковата фрагментация ДНК фрагментите преминават през поправка на краищата, лигиране на адаптери и PCR амплификация, за да се получат крайните библиотеки за секвениране на ДНК. Тези етапи подготвят фрагментираните ДНК молекули за процеса на секвениране чрез добавяне на адаптерни последователности, необходими за свързване с платформата за секвениране и осигуряващи места за свързване на праймерите за PCR амплификация.
- Секвениране на ДНК чрез синтез: След като библиотеките за секвениране са подготвени, започва процесът на секвениране на ДНК чрез синтез (SBS). При SBS последователността на ДНК се определя чрез последователно добавяне на нуклеотиди към комплементарната верига. Този етап включва циклични реакции на включване на нуклеотиди, получаване на изображения и отцепване, което позволява определяне на последователността на ДНК въз основа на флуоресцентните сигнали, излъчвани от включените нуклеотиди.
- Масово паралелно секвениране: В последния етап пространствено разделените, амплифицирани ДНК матрици се секвенират едновременно чрез масово паралелен подход. Този подход за секвениране с висок капацитет позволява генерирането на милиони до милиарди прочити в един цикъл на секвениране, което осигурява ефективно и бързо определяне на ДНК последователностите.
Как работи ултразвуковата фрагментация на ДНК?
Ултразвуковата обработка, известна също като акустична обработка на проби, е широко използван метод за фрагментиране на ДНК. За ултразвуково срязване на ДНК пробите се подлагат на ултразвукови вълни при контролирани условия. Принципът на действие на ултразвуковата фрагментация на ДНК се основава на вибрациите и кавитацията, генерирани от ултразвуковите вълни. Силите на срязване, възникващи вследствие на ултразвуковата (акустична) кавитация, разкъсват ДНК молекулите с високо молекулно тегло. Настройките на ултразвуковата обработка, като интензитет (амплитуда, продължителност), импулсен режим и температура, позволяват прецизно фрагментиране на ДНК до определена желана дължина на ДНК фрагментите. Докато чрез ултразвукова обработка ДНК често се скъсява до 100 до 600 bp, при прилагане на по-меки условия на ултразвукова обработка могат да се получат по-дълги ДНК фрагменти с дължина до 1300 bp.
Ултразвуково срязване на ДНК при ChIP – имунопреципитация на хроматин
Адаптирано от Jkwchui съгласно CC-BY-SA.03
Контрол на температурата за предотвратяване на разграждането на ДНК
Двуверижната молекулна структура на ДНК е силно чувствителна към повишени температури, така че точният контрол на температурата по време на етапите на подготовка на пробите е решаващ фактор за надеждни резултати от анализа.
Независимо дали използвате сондовите ултразвукови апарати на Hielscher, VialTweeter или UIP400MTP – непрекъснатото наблюдение и контрол на температурата са осигурени благодарение на включваем температурен сензор и интелигентния софтуер на апарата. За да поддържате температурата в определен диапазон, можете да зададете горна и долна температурна граница. Съответно ултразвуковият апарат ще прекъсне работа веднага щом тази температурна граница бъде превишена и автоматично ще продължи ултразвуковата обработка, когато температурата спадне със зададена стойност ∆T.
Усъвършенстваният софтуер на ултразвуковите апарати на Hielscher осигурява надеждно поддържане на идеалните условия за обработка на пробите.
Фрагментация на ДНК в голям брой проби с ултразвуковия апарат за многогнездови плаки UIP400MTP
Броят на пробите в науките за живота се е увеличил значително през последното десетилетие. Това означава, че при подготовката и анализа на пробите трябва да се обработват много голям брой проби (напр. 384, 1536 или 3456 гнезда на микроплака) при постоянно еднакви условия, за да се получат сравними и валидни резултати. С UIP400MTP Hielscher Ultrasonics следва тенденцията за обработка на голям брой проби. UIP400MTP е ултразвуков апарат за подготовка на проби в микроплаки. UIP400MTP може да обработва плаки с 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 или 3456 гнезда. В зависимост от типа на микроплаката всяко гнездо обикновено може да побере обем на пробата от десетки нанолитри до няколко милилитра. Широко използван в изследванията в науките за живота, UIP400MTP много често се използва за подготовка на проби преди анализи като ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен анализ) или PCR, преди анализи на протеини, както и за подготовка на хроматин преди CHiP и CHiP-seq, идентифициране на хистонови модификации и други аналитични обработки (напр. гел електрофореза, масспектрометрия).
Прочетете повече за обработката на PCR плаки с висок капацитет!
VialTweeter за подготовка на проби в до 10 флакона
VialTweeter е широко използван лабораторен ултразвуков апарат VialTweeter, който позволява ефективна и удобна ултразвукова обработка на до 10 флакона едновременно. Тъй като флаконите и епруветките (напр. флакони Eppendorf, криофлакони, центрофужни епруветки) се обработват с ултразвук непряко, се избягва всякакво кръстосано замърсяване. Тъй като към всяка проба се предава ултразвук с еднакъв интензитет, всички резултати от ултразвуковата обработка са еднородни и възпроизводими. VialTweeter предлага всички интелигентни функции като другите ни цифрови апарати (напр. интелигентно меню, програмируеми настройки, контрол на температурата, дистанционно управление и др.), така че е осигурено най-високо удобство за потребителя.
Многопръстови сонди за плаки с микрогнезда
Предлагани за сондовите ултразвукови хомогенизатори UP200Ht и UP200St, многопръстовите сонди с 4 или 8 пръста са удобна възможност за ултразвукова обработка на множество проби едновременно при еднакви условия. Например сонотродът MTP-24-8-96 е осемпръстова сонда, която е идеална за интегриране в автоматизирани системи или за ефективна ръчна подготовка на пробите в гнездата на многогнездови плаки. Многопръстовият сонотрод е идеален за автоматизация в лаборатории, в които се обработват предимно проби в бехерови чаши и епруветки със стандартен ултразвуков сонотрод. Многопръстовите и стандартните сонди могат бързо да се сменят в рамките на няколко минути, превръщайки едносондовия ултразвуков апарат в многосондов ултразвуков разрушител.
Ултразвукови апарати на Hielscher за фрагментация на ДНК
Hielscher Ultrasonics предлага различни платформи, основани на ултразвук, за фрагментация на ДНК, РНК и хроматин. Тези различни платформи включват ултразвукови сонди (сонотроди), решения за непряка ултразвукова обработка за едновременна подготовка на проби в множество епруветки или многогнездови плаки (напр. плаки с 96 гнезда, микротитърни плаки), сонореактори и ултразвукови чашкови сонотроди CupHorn. Всички платформи за срязване на ДНК се задвижват от настроени по честота, високопроизводителни ултразвукови процесори, които могат да се контролират прецизно и осигуряват възпроизводими резултати.
Ултразвукови процесори за всякакъв брой и размер на пробите
С ултразвуковите апарати за множество проби на Hielscher VialTweeter (за до 10 епруветки) и UIP400MTP (за микроплаки/ многогнездови плаки) може да се намали времето за обработка на пробите благодарение на интензивната и прецизно контролируема ултразвукова обработка, като същевременно се получават желаното разпределение по размер на ДНК фрагментите и желаният добив. Ултразвуковата фрагментация на ДНК прави подготовката на пробите ефективна, надеждна и мащабируема. Протоколите могат да се мащабират линейно от една до множество проби чрез прилагане на постоянно контролиран ултразвук.
Сондовите ултразвукови апарати с един до пет пръста са идеални за подготовка на по-малък брой проби. Лабораторните ултразвукови апарати на Hielscher се предлагат в различни размери, така че можем да ви препоръчаме идеалния апарат за вашето приложение и изисквания.
Прецизен контрол на процеса
Прецизно контролируемите настройки на ултразвуковата обработка са решаващи, тъй като прекомерната ултразвукова обработка може да разруши ДНК, РНК и хроматина, а недостатъчното ултразвуково срязване води до прекалено дълги фрагменти на ДНК и хроматина. Цифровите ултразвукови апарати на Hielscher могат лесно да се настройват за точни параметри на ултразвуковата обработка. Конкретни настройки на ултразвуковата обработка могат също да се запазват като програмирана настройка за бързо повторение на същата процедура.
Всички ултразвукови обработки се протоколират автоматично и се съхраняват като CSV файл на вградена SD карта. Това позволява точно документиране на проведените опити и лесен преглед на циклите на ултразвукова обработка.
Чрез дистанционно управление през браузър всички цифрови ултразвукови апарати могат да се управляват и наблюдават през всеки стандартен браузър. Не е необходимо инсталиране на допълнителен софтуер, тъй като LAN връзката позволява много лесна настройка от типа „включи и използвай“.
Най-високо удобство за потребителя при ултразвукова подготовка на проби
Всички ултразвукови апарати на Hielscher са проектирани да осигуряват високопроизводителен ултразвук, като същевременно винаги са много удобни за потребителя и лесни за работа. Всички настройки са добре структурирани в ясно меню, до което има лесен достъп чрез цветен сензорен дисплей или дистанционно управление през браузър. Интелигентният софтуер с програмируеми настройки и автоматично записване на данните осигурява оптимални настройки на ултразвуковата обработка за надеждни и възпроизводими резултати. Изчистеният и лесен за използване интерфейс на менюто превръща ултразвуковите апарати на Hielscher в удобни за потребителя и ефективни устройства.
Таблицата по-долу дава представа за приблизителния капацитет за обработка на нашите лабораторни ултразвукови апарати, които са идеални за задачи по подготовка на проби като фрагментация на ДНК и РНК, клетъчен лизис, както и извличане на протеини:
| Апарат | Мощност [W] | Тип | Обем [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | за микроплаки | 6 – 3456 гнезда | VialTweeter | 200 | за до 10 флакона плюс възможност за притискане със скоба | 0,5 – 1,5 |
| UP50H | 50 | сондов тип | 0,01 – 250 |
| UP100H | 100 | сондов тип | 0,01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | сондов тип | 0,1 – 1000 |
| UP200St | 200 | сондов тип | 0,1 – 1000 |
| UP400St | 400 | сондов тип | 5,0 – 2000 |
| CupHorn | 200 | CupHorn, сонореактор | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | проточна клетка без замърсяване |
Свържете се с нас! / Попитайте ни!
Ултразвуковият модул за подготовка на множество проби VialTweeter позволява едновременна ултразвукова обработка на до 10 флакона. С приспособлението за притискане VialPress до 4 допълнителни епруветки могат да се притиснат към предната страна за интензивна ултразвукова обработка.
Сонотродът MTP-24-8-96 има осем ултразвукови сонди за ултразвукова обработка на гнездата на микротитърни плаки.
Литература / Източници
- Qiyun Liang, Christoph Ratzke (2025): Lysing diverse bacteria with the Hielscher UIP400MTP for DNA sequencing. Protocol Uni Tübingen 2025.
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Wang Y., Joshu C.E., Curtis S.D., Douville C., Burk V.A., Ru M., Popoli M., Ptak J., Dobbyn L., Silliman N., Coresh J., Boerwinkle E., Prizment A., Bettegowda C., Kinzler K.W., Papadopoulos N., Platz E.A., Vogelstein B. (2025): Detection of cancers three years prior to diagnosis using plasma cell-free DNA. Cancer Discovery 2025 May.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Полезни факти
Какво представлява секвенирането от следващо поколение?
Секвенирането от следващо поколение, наричано също NGS, секвениране с висок капацитет или секвениране от второ поколение, означава подхода на масово паралелно секвениране, при който много големи (огромни) количества ДНК от милиони фрагменти се секвенират едновременно и паралелно в рамките на един цикъл.
За извършване на секвениране от следващо поколение трите основни етапа:
- подготовка на библиотеки,
- секвениране и
- анализ на данните
са необходими.
По време на подготовката на библиотеките веригите на ДНК трябва да се фрагментират в ДНК фрагменти с определена дължина. Ултразвуковата обработка е една от предпочитаните техники за фрагментиране на ДНК.
По време на процеса на секвениране на ДНК се определя редът на нуклеотидите в ДНК – известен като нуклеотидна последователност. Нуклеотидната последователност се състои от четири нуклеотидни бази – аденин, цитозин, гуанин, тимин – които кодират информация.
Секвенирането от следващо поколение стимулира изследванията в науките за живота и персонализираната медицина, тъй като секвенирането на ДНК и РНК се използва широко в геномните изследвания, изследванията на рака, изследванията на редки и сложни заболявания, микробиологичните изследвания, агрогеномиката и много други изследователски области.
Секвениране от следващо поколение спрямо секвениране по Сангър
Докато със секвенирането от следващо поколение (NGS) е възможно да се секвенират огромен брой геномни проби, секвенирането по Сангър (известно също като метод на терминиране на веригата или секвениране от първо поколение) има възможност да секвенира само малък брой проби. Секвенирането по Сангър секвенира само един ДНК фрагмент наведнъж и може да бъде извършено в рамките на един ден. Поради своята точност секвенирането по Сангър се счита също за технологията „златен стандарт“, която се използва за проверка на резултатите, получени чрез секвениране от следващо поколение.
Секвенирането по Сангър постига дължини на прочитите от приблизително 800bp (обикновено 500–600bp при необогатена ДНК). По-големите дължини на прочитите при секвенирането по Сангър показват значителни предимства спрямо други методи за секвениране, особено по отношение на секвенирането на повтарящи се участъци от генома. Предизвикателствата, свързани с данните от секвениране с къси прочити, са особено проблематични при секвениране на нови геноми (de novo) и при секвениране на силно пренаредени геномни сегменти, обикновено наблюдавани в ракови геноми или в области на хромозомите, които проявяват структурна вариация. [срв. Morozova and Marra, 2008]
ДНК – дезоксирибонуклеинова киселина – нейните форми и функции
Всяка форма на ДНК има уникални характеристики и приложения, които допринасят за широк спектър от изследователски области, включително онкология, генетика, криминалистика и еволюционна биология. Ултразвуковите апарати на Hielscher са високоефективно и надеждно решение за изолиране и фрагментиране на ДНК и РНК за вашите аналитични цели. В списъка по-долу обясняваме конкретните форми на ДНК и ги категоризираме според техния биологичен контекст и функции:
- Геномна ДНК (gDNA)
Геномна ДНК (gDNA): Пълният набор от ДНК в един организъм, включително както кодиращите (гени), така и некодиращите участъци. - Извънклетъчна ДНК
Циркулираща туморна ДНК (ctDNA): Фрагменти от ДНК, освобождавани в кръвния поток от туморни клетки.
Безклетъчна ДНК (cfDNA): ДНК фрагменти, които циркулират свободно в кръвния поток и произхождат от различни тъкани. - Екстрахромозомна кръгова ДНК (eccDNA): Кръгови ДНК молекули, намиращи се извън хромозомите в еукариотните клетки.
Вирусна ДНК: ДНК, произхождаща от вируси, която е интегрирана в генома на гостоприемника или е под формата на епизомна ДНК. - Митохондриална ДНК
Митохондриална ДНК (mtDNA): ДНК, разположена в митохондриите, наследявана по майчина линия и участваща в производството на енергия. - Плазмидна ДНК
Плазмидна ДНК: Малки, кръгови ДНК молекули, които се репликират независимо от хромозомната ДНК, често се срещат в бактерии и се използват в генното инженерство. - Ядрена ДНК
Ядрена ДНК (nDNA): ДНК, съдържаща се в ядрото на еукариотните клетки, която представлява по-голямата част от генетичния материал в един организъм. - ДНК от единична клетка
ДНК от единична клетка (scDNA): ДНК, извлечена от единична клетка, използвана за подробен геномен анализ на ниво отделна клетка. - Рекомбинантна ДНК
Рекомбинантна ДНК (rDNA): ДНК молекули, образувани чрез лабораторни методи за генетична рекомбинация с цел обединяване на генетичен материал от множество източници. - Специализирани форми
ДНК от околната среда (eDNA): ДНК, събрана от проби от околната среда (почва, вода), без изолиране на организмите, от които произхожда
Древна ДНК (aDNA): ДНК, извлечена от древни образци, която предоставя сведения за еволюционната биология и древните популации. - Хромозомна ДНК
Хромозомна ДНК: ДНК, която изгражда хромозомите в клетъчното ядро и обхваща както кодиращи, така и некодиращи участъци. - Вирусни и синтетични форми
Вирусна ДНК: ДНК, произхождаща от вируси, която може да бъде интегрирана в геномите на гостоприемниците или да съществува като самостоятелни единици.
Синтетична ДНК: Изкуствено синтезирани ДНК последователности, създадени чрез химични процеси, често използвани в изследванията и биотехнологиите.
Hielscher Ultrasonics произвежда високопроизводителни ултразвукови хомогенизатори от лабораторен до промишлен размер.