Ултразвукова фрагментация на ДНК за секвениране от следващо поколение
Секвенирането от следващо поколение (NGS) изисква надеждно срязване и фрагментиране на геномна ДНК, за да се секвенират геномните ДНК вериги и да се създадат геномни библиотеки. Контролираната фрагментация на ДНК фрагменти е съществена стъпка за подготовка на пробата, необходима преди секвенирането на ДНК. Ултразвукът е доказано ефективен и надежден метод за фрагментация на ДНК с определена дължина. Ултразвуковите протоколи за фрагментация на ДНК постигат възпроизводими резултати от фрагментацията. Ултразвуковите апарати на Hielscher са способни да произвеждат широк спектър от разпределения на размера на геномните ДНК фрагменти, прецизно контролирани чрез работните параметри. Тъй като ултразвуковите системи за срязване на ДНК на Hielscher се предлагат за единични и многократни флакони, както и за микроплаки, подготовката на пробите става високоефективна.
Соникаторът за UIP400MTP плочи за високопроизводителна подготовка на проби равномерно ултразвук в многоямкови, микротитрни плаки и 96-ямкови плаки
- Повтарящи се / възпроизводими резултати
- прецизно регулируем, за да се получи определена дължина на фрагмента
- Бърза обработка
- последователни резултати от фрагментация на ДНК
- устройства за всякакви обеми проби (напр. множество флакони или микроплаки)
- висока производителност
- прецизен контрол на температурата
- Лесна и лесна работа
Секвениране от следващо поколение: ултразвукова фрагментация на ДНК за подготовка на библиотеката
За да се извърши секвениране от следващо поколение, трябва да се извършат трите основни стъпки на (1) подготовка на библиотеката, (2) секвениране и (3) анализ на данните. По време на подготовката на библиотеката ДНК се фрагментира, след което краищата на фрагментите се възстановяват (полират) чрез добавяне на една аденинова основа и целевите фрагменти се превръщат в двуверижна ДНК. Накрая така наречените адаптери се прикрепят чрез лигиране, PCR или маркиране, така че крайният библиотечен ДНК продукт да може да бъде количествено определен за секвениране.
Фрагментация на ДНК с помощта на соникация: Особено когато технологиите за секвениране с кратко четене като Illumina, които не могат лесно да разчитат по-дълги ДНК фрагменти, ДНК стойките трябва да бъдат фрагментирани до определен размер, който може да бъде постигнат надеждно чрез ултразвук.
Ултразвукът може надеждно да се използва за фрагментация на ДНК, РНК и хроматин.
Следващо поколение секвениране – Подготовка на библиотеката
Ултразвуковата фрагментация на ДНК обикновено се използва при подготовката на библиотеки за секвениране на ДНК за платформи за секвениране от следващо поколение (NGS). Тази техника се използва за разбиване на ДНК молекулите на по-малки фрагменти с желания диапазон от размери, което улеснява следващите стъпки в подготовката на библиотеката. Ултразвуковата фрагментация на ДНК обикновено се изисква по време на етапа на подготовка на библиотеката на работните потоци на NGS, за да се фрагментира геномната ДНК на по-малки парчета, подходящи за обработка и секвениране надолу по веригата. Той играе решаваща роля за гарантиране на успеха на експеримента за секвениране, като генерира ДНК фрагменти с подходящ диапазон от размери за конкретната платформа за секвениране, която се използва.
Електрофоретични анализи на геномна ДНК на E. coli EDL933, подложени на 0 – 15 мин ултразвук. L показва ДНК стълбата. (Basselet et al. 2008)
Следващо поколение секвениране – Стъпки на процеса:
- Ултразвукова фрагментация на ДНК: Преди изграждането на библиотеката, геномната ДНК е фрагментирана на по-малки, по-управляеми части. Ултразвуковата фрагментация включва използване на високочестотни звукови вълни за срязване на ДНК молекулите на фрагменти с желания диапазон на размери. Тази стъпка е от решаващо значение, защото помага да се гарантира, че четенията на секвенирането, генерирани по-късно, ще бъдат с подходяща дължина за използваната платформа за секвениране. Диапазонът от размери на фрагментите може да се коригира въз основа на специфичните изисквания на експеримента за секвениране.
- Клонална амплификация чрез PCR: След ултразвукова фрагментация ДНК фрагментите се подлагат на крайно възстановяване, лигатура на адаптера и PCR амплификация, за да се генерират окончателните библиотеки за секвениране на ДНК. Тези стъпки подготвят фрагментираните ДНК молекули за процеса на секвениране чрез добавяне на адаптерни последователности, необходими за свързване с платформата за секвениране и осигуряване на места за зареждане за PCR амплификация.
- Секвениране на ДНК чрез синтез: След като библиотеките за секвениране са подготвени, започва процесът на секвениране на ДНК чрез синтез (SBS). По време на SBS ДНК последователността се определя чрез последователното добавяне на нуклеотиди към комплементарната верига. Тази стъпка включва циклични реакции на нуклеотидно включване, изобразяване и разцепване, което позволява определянето на ДНК последователността въз основа на флуоресцентните сигнали, излъчвани от включените нуклеотиди.
- Масивно паралелно секвениране: В последната стъпка пространствено разделените, амплифицирани ДНК шаблони се секвенират едновременно по масово паралелен начин. Този високопроизводителен подход за секвениране позволява генерирането на милиони до милиарди четения на секвениране в едно секвениране, което позволява ефективно и бързо определяне на ДНК последователностите.
Как работи ултразвуковата фрагментация на ДНК?
Соникацията, известна още като акустична обработка на проби, е широко използван метод за фрагментиране на ДНК. За ултразвуково срязване на ДНК пробите се излагат на ултразвукови вълни при контролирано състояние. Принципът на работа на ултразвуковата фрагментация на ДНК се основава на вибрациите и кавитацията, генерирани от ултразвуковите вълни. Силите на срязване, които са резултат от ултразвукова (акустическа) кавитация, разбиват молекулите на ДНК с високо молекулно тегло. Настройката на ултразвука като интензитет (амплитуда, продължителност), режим на пулсация и температура позволяват прецизна фрагментация на ДНК до определена желана дължина на ДНК фрагментите. Докато ДНК често се редуцира до 100 до 600 bp с помощта на ултразвук, по-дълги ДНК фрагменти до 1300 bp могат да бъдат получени, когато се прилагат по-леки ултразвукови условия.
Ултразвуково срязване на ДНК по време на ChIP – Хроматин имунопреципитация
Адаптирано от Jkwchui под CC-BY-SA.03
Контрол на температурата за предотвратяване на разграждането на ДНК
Двуверижната молекулярна форма на ДНК е силно чувствителна към повишени температури, така че точният контрол върху температурата по време на етапите на подготовка на пробата е решаващ фактор за надеждни резултати от анализа.
Независимо дали използвате ултрасонаторите на сондата на Hielscher, VialTweeter или UIP400MTP – Непрекъснатият мониторинг и контрол на температурата се осигурява благодарение на щепселния температурен сензор и софтуера на смарт устройството. За да поддържате температурата в определен диапазон, можете да зададете горна и долна температурна граница. Следователно, ултразвукораздвижителят ще спре веднага щом тази температурна граница бъде надвишена и автоматично ще продължи да излъчва звук, когато температурата се понижи със зададен ∆T.
Усъвършенстваният софтуер на ултразвуковите апарати Hielscher гарантира надеждно поддържане на идеални условия за обработка на проби.
Масова фрагментация на ДНК проба с ултразвуков ултразвук с много ямки UIP400MTP
Броят на извадките в науките за живота се е увеличил значително през последното десетилетие. Това означава, че много голям брой проби (напр. 384, 1536 или 3456 ямки на микроплаки) трябва да бъдат обработени по време на подготовката и анализа на пробите при постоянно равни условия, за да се получат сравними и валидни резултати. С UIP400MTP Hielscher Ultrasonics следва тенденцията за масова обработка на проби. UIP400MTP е ултразвуков апарат за подготовка на проби с помощта на микроплаки. UIP400MTP може да обработва плочи с 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 или 3456 кладенеца. В зависимост от вида на микроплочата, всяка ямка обикновено може да побере обеми на проби между десетки нанолитри до няколко милилитра. Широко използван в научните изследвания в областта на живота, UIP400MTP много често се използва за подготовка на проби преди анализи като ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен анализ) или PCR, преди анализ на протеини, както и за приготвяне на хроматин преди CHiP и CHiP-seq, идентификация на хистонова модификация и други аналитични обработки (напр. гел електрофореза, масспектрометрия).
VialTweeter за проби до 10 флакона
VialTweeter е широко използван лабораторен ултразвуков VialTweeter, който позволява ефективна и удобна ултразвукова обработка на до 10 флакона едновременно. Тъй като флаконите и епруветките (напр. флакони Eppendorf, крио флакони, центрофужни епруветки) се озвучават индиректно, се избягва кръстосано замърсяване. Тъй като към всяка проба се доставя един и същ ултразвуков интензитет, всички резултати от ултразвука са хомогенни и възпроизводими. VialTweeter предлага всички интелигентни функции като другите ни цифрови устройства (напр. интелигентно меню, програмируеми настройки, контрол на температурата, дистанционно управление и т.н.), така че да се осигури най-висок комфорт на потребителя.
Многопръстови сонди за микроямкови плочи
Налични за ултразвуковите хомогенизатори на сонди UP200Ht и UP200St, многопръстовите сонди с 4 или 8 пръста са удобна опция за ултразвукова проба едновременно при едни и същи условия. Например, сонотрод MTP-24-8-96 е сонда с осем пръста, която е идеална за интегриране в автоматизирани системи или ефективна ръчна подготовка на проби на ямки на многоямкови пластини. Многопръстовият сонотрод е идеален за автоматизирани лаборатории, където се обработват предимно чаши и епруветки, използващи стандартен ултразвуков сонотрод. Многопръстовите и стандартните сонди могат бързо да се сменят помежду си в рамките на няколко минути, превръщайки ултразвуковия звук с една сонда в ултразвуков разрушител с много сонди.
Ултразвукови апарати Hielscher за фрагментация на ДНК
Hielscher Ultrasonics предлага различни ултразвукови платформи за фрагментация на ДНК, РНК и хроматин. Тези различни платформи включват ултразвукови сонди (сонотроди), индиректни решения за ултразвук за едновременна подготовка на проби от множество епруветки или многолункови плочи (напр. 96-ямкови плочи, микротитърни плаки), сонореактори и ултразвукови куперни. Всички платформи за срязване на ДНК се захранват от честото-настроени, високопроизводителни ултразвукови процесори, които са прецизно контролируеми и осигуряват възпроизводими резултати.
Ултразвукови процесори за всякакъв брой и размер на пробата
С ултразвуковите апарати на Hielscher VialTweeter (за до 10 епруветки) и UIP400MTP (за микроплаки/многоямкови плаки) става лесно възможно да се намали времето за обработка на пробата благодарение на интензивна и прецизно контролирана ултразвукова обработка, като същевременно се получи желаното разпределение на размера на ДНК фрагмента и добива. Ултразвуковата фрагментация на ДНК прави подготовката на пробата ефективна, надеждна и мащабируема. Протоколите могат да бъдат линейно мащабирани от една до множество проби чрез прилагане на постоянно контролиран ултразвук.
Ултразвуковите сонди с един до пет пръста са идеални за приготвяне на по-малки проби. Лабораторните ултразвукови уреди на Hielscher се предлагат в различни размери, така че можем да ви препоръчаме идеалното устройство за вашето приложение и изисквания.
прецизен контрол на процеса
Прецизно контролираните настройки на ултразвука са от решаващо значение, тъй като изчерпателната сонификация може да унищожи ДНК, РНК и хроматин, но неадекватното ултразвуково срязване води до твърде дълги ДНК и хроматинови фрагменти. Цифровите ултразвукови апарати на Hielscher могат лесно да бъдат настроени на прецизен параметър за ултразвук. Специфичните настройки за ултразвук също могат да бъдат запазени като програмирана настройка за бързо повторение на една и съща процедура.
Всички ултразвуки се протоколират автоматично и се съхраняват като CSV файл на вградена SD-карта. Това позволява точно документиране на извършените опити и дава възможност за лесно преразглеждане на ултразвука.
Чрез дистанционното управление на браузъра всички цифрови ултразвукови уреди могат да се управляват и наблюдават чрез всеки стандартен браузър. Не се изисква инсталиране на допълнителен софтуер, тъй като LAN връзката позволява много проста настройка на plug-n-play.
Най-висока лекота на използване при ултразвукова подготовка на проби
Всички ултразвукови апарати Hielscher са проектирани да осигуряват високоефективен ултразвук, като в същото време винаги са много лесни за използване и лесни за работа. Всички настройки са добре структурирани в ясно меню, което може лесно да бъде достъпно чрез цветен сензорен дисплей или дистанционно управление на браузъра. Интелигентният софтуер с програмируеми настройки и автоматичен запис на данни осигурява оптимални настройки за ултразвук за надеждни и възпроизводими резултати. Изчистеният и лесен за използване интерфейс на менюто превръща ултразвуковите апарати Hielscher в удобни за потребителя и ефективни устройства.
Таблицата по-долу ви дава представа за приблизителния капацитет за обработка на нашите лабораторни ултразвукови апарати, които са идеални за задачи за подготовка на проби като фрагментация на ДНК и РНК, клетъчен лизис, както и екстракция на протеини:
| Устройство | Мощност [W] | Вид | Сила на звука [ml] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | за микроплаки | 6 – 3456 кладенци | ФлаконВисокоговорител за високи честоти | 200 | за до 10 флакона плюс възможност за захващане | 0.5 – 1.5 |
| UP50H | 50 | тип сонда | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | тип сонда | 0.01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | тип сонда | 0.1 – 1000 |
| UP200St | 200 | тип сонда | 0.1 – 1000 |
| UP400St | 400 | тип сонда | 5.0 – 2000 |
| Cuphorn | 200 | CupHorn, sonoreactor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | Клетка без замърсяване |
Свържете се с нас! / Попитайте ни!
Ултразвуковият модул за подготовка на няколко проби ФлаконВисокоговорител за високи честоти Позволява едновременно ултразвук на до 10 флакона. Със затягащото устройство VialPress могат да се притиснат до 4 допълнителни тръби отпред за интензивно ултразвук.
Сонотродът MTP-24-8-96 има осем ултразвукови сонди за ултразвук на ямките на микротитърните плочи.
Литература / Препратки
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Факти, които си струва да знаете
Какво е секвениране от следващо поколение?
Секвенирането от следващо поколение, също секвениране от следващо поколение (NGS), секвениране с висока производителност или секвениране от второ поколение, се отнася до подхода на масивно паралелно секвениране, при което много големи (масивни) количества ДНК от милиони фрагменти се секвенират едновременно паралелно на пускане.
За да се извърши секвениране от следващо поколение, трите основни стъпки на
- подготовка на библиотеката,
- последователността и
- Анализ на данни
са задължителни.
По време на подготовката на библиотеката ДНК веригите трябва да бъдат фрагментирани на ДНК фрагменти с определена дължина. Соникацията е една от предпочитаните техники за фрагментиране на ДНК.
По време на процеса на секвениране на ДНК, редът на нуклеотидите в ДНК – известен като последователност на нуклеинова киселина – определя се. Последователността на нуклеиновата киселина е съставена от четири нуклеотидни основи – аденин, цитозин, гуанин, тимин – кой код за информация.
Секвенирането от следващо поколение стимулира изследванията в областта на науките за живота и персонализираната медицина, тъй като секвенирането на ДНК и РНК се използва широко в геномните изследвания, изследванията на рака, изследванията на редки и сложни заболявания, микробните изследвания, агригеномиката и много други изследователски области.
Секвениране от следващо поколение срещу секвениране на Sanger
Докато при секвенирането от следващо поколение (NGS) е възможно да се секвенират огромен брой геномни проби, секвенирането на Sanger (известно също като метод на верижно прекратяване или секвениране от първо поколение) има способността да секвенира само малки числа проби. Секвенирането на Сангър секвенира само един ДНК фрагмент наведнъж и може да бъде извършено за един ден. Поради своята точност, секвенирането на Sanger също се счита за златен стандарт технология, която се използва за проверка на резултатите, получени чрез секвениране от следващо поколение.
Секвенирането на Sanger постига дължина на четене от приблизително 800bp (обикновено 500-600bp с необогатена ДНК). По-дългите дължини на четене при секвенирането на Sanger показват значителни предимства пред другите методи за секвениране, особено по отношение на секвенирането на повтарящи се региони на генома. Предизвикателството на кратките данни за секвенции е особено проблем при секвенирането на нови геноми (de novo) и при секвенирането на силно пренаредени сегменти на генома, обикновено тези, наблюдавани при ракови геноми или в региони на хромозоми, които показват структурни вариации. [ср. Морозова и Мара, 2008]
ДНК – Дезоксирибонуклеинова киселина – Неговите форми и функции
Всяка форма на ДНК има уникални характеристики и приложения, допринасящи за широк спектър от изследователски области, включително онкология, генетика, криминалистика и еволюционна биология. Ултразвуковите апарати на Hielscher са високоефективно и надеждно решение за изолиране и фрагментиране на ДНК и РНК за целите на вашия анализ. В списъка по-долу ви обясняваме специфичните форми на ДНК и ги категоризираме въз основа на техния биологичен контекст и функции:
- Геномна ДНК (gDNA)
Геномна ДНК (гДНК): Пълният набор от ДНК в организма, включващ както кодиращи (гени), така и некодиращи региони. - Извънклетъчна ДНК
Циркулираща туморна ДНК (ctDNA): Фрагменти от ДНК, освободени в кръвта от туморни клетки.
Безклетъчна ДНК (cfDNA): ДНК фрагменти, открити свободно циркулиращи в кръвния поток, произхождащи от различни тъкани. - Извънхромозомна кръгова ДНК (eccDNA): Кръгови ДНК молекули, открити извън хромозомите в еукариотните клетки.
Вирусна ДНК: ДНК, произхождаща от вируси, интегрирани в генома на гостоприемника или като епизодна ДНК. - митохондриална ДНК
Митохондриална ДНК (мтДНК): ДНК, разположена в митохондриите, наследена от майката и участваща в производството на енергия. - плазмидна ДНК
Плазмидна ДНК: Малки, кръгови ДНК молекули, които се репликират независимо от хромозомната ДНК, често срещани в бактериите и използвани в генното инженерство. - ядрена ДНК
Ядрена ДНК (nDNA): ДНК, съдържаща се в ядрото на еукариотните клетки, съставляваща по-голямата част от генетичния материал в организма. - Едноклетъчна ДНК
Едноклетъчна ДНК (scDNA): ДНК, извлечена от една клетка, използвана за подробен геномен анализ на индивидуално клетъчно ниво. - Рекомбинантна ДНК
Рекомбинантна ДНК (рДНК): ДНК молекули, образувани чрез лабораторни методи на генетична рекомбинация за обединяване на генетичен материал от множество източници. - Специализирани формуляри
ДНК на околната среда (eDNA): ДНК, взета от проби от околната среда (почва, вода), без да се изолират изходните организми
Древна ДНК (аДНК): ДНК, извлечена от древни екземпляри, предоставяйки представа за еволюционната биология и древните популации. - Хромозомна ДНК
Хромозомна ДНК: ДНК, която съставлява хромозомите в клетъчното ядро, обхващаща както кодиращи, така и некодиращи региони. - Вирусни и синтетични форми
Вирусна ДНК: ДНК, получена от вируси, които могат да бъдат интегрирани в геномите на гостоприемника или да съществуват като независими единици.
Синтетична ДНК: Изкуствено синтезирани ДНК последователности, създадени чрез химични процеси, често използвани в изследванията и биотехнологиите.
Hielscher Ultrasonics произвежда високоефективни ултразвукови хомогенизатори от лаборатория да индустриален размер.