Срязване на хроматина чрез ултразвукова обработка
Срязването на хроматина е критична стъпка в много работни процеси в епигенетиката и молекулярната биология, особено при имунопреципитация на хроматина (ChIP), ChIP-seq и свързаните с тях анализи. Целта е хроматинът да се фрагментира до възпроизводими ДНК–протеинови комплекси, като се запази целостта на епитопите и се сведат до минимум загубите на проба. Сред наличните методи ултразвуковото фрагментиране на хроматина се е превърнало в широко използван подход, тъй като осигурява надеждно фрагментиране без реагенти с отлична възпроизводимост.
Какво трябва да взема предвид при срязване на хроматина?
Ефективното срязване на хроматина изисква внимателен контрол на експерименталните параметри. Неправилното фрагментиране може да компрометира последващите ChIP експерименти, като образува фрагменти, които са твърде големи, прекомерно разградени или нееднородни между пробите.
Един от най-важните фактори е желаното разпределение на фрагментите по размер. За повечето приложения на ChIP и ChIP-seq оптимални са хроматиновите фрагменти с дължина между 100 и 600 базови двойки. Този диапазон на размерите позволява ефективна имунопреципитация, като същевременно осигурява достатъчна разделителна способност за геномно картографиране.
Друг ключов фактор е ефективността на кръстосаното свързване преди ултразвуковата обработка. Повечето работни процеси за ChIP включват фиксация с формалдехид за стабилизиране на взаимодействията между протеините и ДНК. Прекомерното кръстосано свързване обаче може да направи хроматина по-устойчив на фрагментиране, което изисква по-продължителна ултразвукова обработка и потенциално увеличава топлинното въздействие.
Контролът на температурата също е от решаващо значение. Ултразвуковата обработка генерира локализирана енергия, която може да повиши температурата на пробата. Повишените температури могат да увредят ДНК или да денатурират протеините, като повлияят на разпознаването от антителата по време на ChIP. Затова много изследователи извършват импулсни цикли на ултразвукова обработка, съчетани с интервали за охлаждане, за да поддържат стабилността на пробата.
Концентрацията и обемът на пробата също влияят на ефективността на фрагментирането. Силно концентрираните хроматинови суспензии може да изискват по-продължителна ултразвукова обработка, докато малките обеми на пробите изискват прецизно подаване на енергия, за да се предотврати прекомерната обработка.
Накрая, изборът на устройство за ултразвукова обработка оказва силно влияние върху възпроизводимостта на експериментите. Устройствата, предназначени за срязване на хроматина, обикновено осигуряват контролирана ултразвукова енергия и стандартизирано боравене с пробите, което позволява еднородно фрагментиране на множество проби.
Ултразвуково срязване на ДНК по време на ChIP – имунопреципитация на хроматина
Кой ултразвуков апарат да избера за срязване на хроматина?
Различните лабораторни работни процеси изискват различни конфигурации за ултразвукова обработка. Оптималната система зависи до голяма степен от капацитета за обработка на проби, обема и експерименталния формат.
Ултразвуков апарат със сонда
Ултразвуковият апарат със сонда подава ултразвукова енергия директно в пробата чрез титанова сонда. Тази конфигурация осигурява много висока енергийна плътност и затова е подходяща за интензивно разрушаване на хроматина в отделни проби.
Ултразвуковите апарати със сонда са особено полезни за:
- Малък до среден брой проби
- Труден за фрагментиране хроматин
- Гъвкави експериментални протоколи
Ултразвуков апарат за множество епруветки – VialTweeter
За лаборатории, които обработват множество проби едновременно, ултразвуковият апарат за множество епруветки VialTweeter осигурява решение с висока възпроизводимост. Системата предава ултразвукова енергия непряко чрез държача за флакони, като позволява фрагментиране на съдържанието на няколко затворени епруветки при идентични условия.
Тази конфигурация предлага важни предимства:
- Паралелно срязване на хроматина в множество проби
- Елиминиране на замърсяването от сондата
- Висока възпроизводимост между епруветките
- Опростен работен процес за подготовка на проби за ChIP
Такива системи за множество епруветки са подходящи за рутинни ChIP експерименти и изследвания със среден капацитет за обработка на проби.
Ултразвуков апарат за микроплаки – UIP400MTP
Епигенетичните изследвания с висок капацитет за обработка на проби все повече разчитат на обработка на проби в микроплаки. Ултразвуковият апарат за микроплаки UIP400MTP е предназначен да фрагментира хроматина директно в стандартни микроплаки без прехвърляне на пробите.
Този подход позволява:
- Едновременна обработка на десетки или стотици проби
- Работни процеси, подходящи за автоматизация
- Равномерно разпределение на ултразвуковата енергия между ямките
- Значително намаляване на стъпките за боравене с пробите
За мащабни скринингови проекти с ChIP-seq или епигенетични изследвания с висок капацитет за обработка на проби ултразвуковата обработка в микроплаки осигурява изключителна мащабируемост и ефективност. Ултразвуковият апарат за плаки с множество ямки UIP400MTP е подходящ за интегриране в системи за работа с течности и автоматизирани лабораторни работни процеси.
Защо да изберем ултразвукова обработка пред други техники за срязване на хроматина?
В сравнение с ензимните подходи ултразвуковата обработка за ChIP осигурява фрагментиране без селективност, тъй като процесът не зависи от специфична за последователността ензимна активност. Това е особено важно за епигенетични изследвания на целия геном, при които равномерното покритие е съществено.
Друго голямо предимство е мащабируемостта. Ултразвуковите системи могат да обработват единични проби, множество епруветки или цели микроплаки, което позволява на лабораториите да изберат най-подходящата конфигурация за своя експериментален капацитет за обработка на проби.
Накрая, ултразвуковата обработка осигурява отличен контрол върху параметрите на фрагментиране. Чрез регулиране на импулсните цикли, продължителността и нивата на мощност изследователите могат надеждно да постигнат желаното разпределение на фрагментите по размер.
Фрагментиране на хроматина чрез оптимизирана ултразвукова обработка на проби за ChIP.
(a) без срязване (дълги фрагменти в гела);
(b) оптимален профил на фрагментиране (обогатяване с фрагменти с дължина 200–600 bp);
(c) прекомерно фрагментиране на ДНК (прекомерен дял на фрагментите, по-къси от 200 bp)
© Jarillo et al., 2018
Сравнение на техниките за срязване на хроматина
| Метод за срязване на хроматина | Принцип | Предимства | Ограничения |
| Ултразвукова обработка | Високочестотната акустична енергия механично фрагментира хроматина. | Фрагментиране без реагенти, резултати с висока възпроизводимост, регулируемо разпределение на фрагментите по размер, съвместимост с кръстосано свързан хроматин, мащабируемост от единични епруветки до формати с множество проби и микроплаки. | Изисква оборудване за ултразвукова обработка и оптимизиране на параметрите на ултразвуковата обработка. |
| Ензимно разграждане (MNase) | Микрококовата нуклеаза разгражда ДНК между нуклеозомите. | Щадящо фрагментиране и полезен метод за анализ на нативен хроматин. | Ензимна селективност, предпочитание към определени последователности, трудно контролируемо разграждане, потенциална вариабилност между експериментите. |
| Механично срязване (игла / спринцовка) | Хроматинът се разрушава чрез многократно прилагане на физическа сила. | Прост метод, който изисква минимално оборудване. | Ниска възпроизводимост, ограничен контрол върху размера на фрагментите, трудоемкост при множество проби. |
| Небулизация | Сгъстен въздух принуждава ДНК да премине през малки отвори, което причинява фрагментиране. | Бърз процес на фрагментиране. | Възможна загуба на проба, ограничена мащабируемост, изисква специализирано оборудване. |
Как да оценя количеството и качеството на получения хроматин след ултразвуково фрагментиране?
След ултразвукова обработка за ChIP изследователите трябва да оценят както количеството, така и качеството на фрагментирания хроматин. Тази стъпка за проверка гарантира, че фрагментирането на хроматина отговаря на изискванията на последващите приложения, като ChIP-qPCR или ChIP-seq.
Количественото определяне обикновено започва с измерване на концентрацията на ДНК. Спектрофотометричните методи, като анализа с Nanodrop, или флуорометричните анализи, като количественото определяне на ДНК с Qubit, осигуряват надеждни оценки на добива на хроматин след премахване на кръстосаните връзки и пречистване.
Само концентрацията на ДНК обаче не показва дали фрагментирането е било успешно. Затова изследователите оценяват разпределението на фрагментите по размер чрез електрофоретични техники. Електрофорезата в агарозен гел остава често използван подход за визуализиране на ДНК фрагменти и проверка дали повечето попадат в целевия диапазон на размерите.
По-модерните лаборатории често използват системи за капилярна електрофореза, като Agilent Bioanalyzer или TapeStation. Тези платформи осигуряват прецизни профили на разпределението по размер и позволяват на изследователите да откриват прекомерно фрагментиране или непълно срязване.
При оценка на качеството на хроматина след ултразвуково фрагментиране изследователите обикновено потвърждават, че:
- Повечето ДНК фрагменти попадат в диапазона 100–600 bp
- Разпределението на фрагментите е еднородно между повторните проби
- Разграждането на ДНК е минимално
- Общият добив на хроматин е достатъчен за планирания ChIP анализ
Правилният контрол на качеството гарантира, че стъпката на ултразвуково срязване на хроматина дава възпроизводими и биологично значими резултати.
Заключение: Ултразвуково срязване на хроматина за надеждни изследвания
Надеждното срязване на хроматина е основополагащо за успешните ChIP и епигенетични изследвания. Ултразвуковото фрагментиране предлага мощно решение, тъй като позволява прецизно и възпроизводимо разрушаване на хроматина без реагенти в широк спектър от експериментални формати.
Чрез внимателно оптимизиране на параметрите на ултразвуковата обработка, проверка на разпределението на фрагментите по размер и избор на подходяща система за ултразвукова обработка – независимо дали това е ултразвуков апарат със сонда, VialTweeter за множество епруветки или ултразвуковият апарат за микроплаки UIP400MTP с висок капацитет за обработка на проби – изследователите могат да постигнат еднородно фрагментиране на хроматина, което подпомага получаването на висококачествени резултати от ChIP и ChIP-seq.
Тъй като изследванията в епигенетиката продължават да се развиват към по-висок капацитет за обработка на проби и по-голяма експериментална възпроизводимост, ултразвуковото срязване на хроматина остава един от най-универсалните и надеждни методи, достъпни за съвременните лаборатории по молекулярна биология.
Проектиране, производство и консултации – качество, произведено в Германия
Ултразвуковите апарати на Hielscher са добре известни с най-високите си стандарти за качество и дизайн. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Ултразвуковите апарати на Hielscher лесно се справят с тежки условия и взискателни среди.
Hielscher Ultrasonics е компания, сертифицирана по ISO, и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови апарати с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher са в съответствие с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.
Статив с епруветки, обработен с ултразвук в UIP400MTP за срязване на хроматина
Литература / Източници
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
Често задавани въпроси
Какво е хроматин?
Хроматинът е структурният комплекс от ДНК и свързани с нея протеини, който организира генетичния материал в ядрото на еукариотните клетки. Основните протеини в хроматина са хистоните, около които ДНК се увива, за да образува нуклеозоми. Тази организация уплътнява ДНК, като същевременно регулира достъпа до генетичната информация за процеси като транскрипция, репликация и възстановяване на ДНК.
Какви са видовете хроматин?
Хроматинът обикновено се класифицира в две основни форми: еухроматин и хетерохроматин. Еухроматинът е слабо уплътнен и транскрипционно активен, което позволява лесен достъп на транскрипционния апарат до гените. Хетерохроматинът е по-плътно уплътнен и транскрипционно неактивен, като обикновено съдържа повтарящи се ДНК последователности или гени, чиято експресия е потисната. Хетерохроматинът може допълнително да се раздели на конститутивен хетерохроматин, който остава постоянно кондензиран, и факултативен хетерохроматин, който може да преминава между активни и неактивни състояния в зависимост от клетъчните условия.
Какво е кръстосано свързване?
Кръстосаното свързване е биохимичен процес, използван за стабилизиране на взаимодействията между биомолекулите чрез образуване на ковалентни връзки между тях. В изследванията на хроматина кръстосаното свързване обикновено се използва за запазване на взаимодействията между протеините и ДНК в хроматина преди анализа. Химични агенти като формалдехид обикновено се използват за създаване на обратими ковалентни връзки между ДНК и свързаните с нея протеини, като ефективно „замразяват“ молекулярните взаимодействия в определен момент. Това стабилизиране позволява хроматиновите комплекси да бъдат фрагментирани и обработени, без да се губят нативните асоциации между ДНК и регулаторните протеини, което е съществено за техники като имунопреципитацията на хроматина (ChIP).
Какво е ChIP?
Имунопреципитацията на хроматина (ChIP) е техника в молекулярната биология, използвана за изследване на взаимодействията между протеините и ДНК в хроматина. При този метод ДНК–протеиновите комплекси първо се стабилизират, обикновено чрез кръстосано свързване, а след това хроматинът се фрагментира. За имунопреципитация на протеин–ДНК комплексите се използват антитела, специфични за целевия протеин, което позволява свързаните ДНК последователности да бъдат изолирани и анализирани.
За какво се използва ChIP?
ChIP се използва за идентифициране на геномни области, свързани със специфични ДНК-асоциирани протеини, като транскрипционни фактори, хистонови модификации или регулаторни протеини, асоциирани с хроматина. Техниката се прилага широко за изучаване на генната регулация, епигенетичните модификации, местата на свързване на транскрипционните фактори и структурата на хроматина. В съчетание с последващи аналитични методи, като количествена PCR (ChIP-qPCR) или секвениране с висок капацитет (ChIP-seq), тя позволява картографиране на взаимодействията между протеините и ДНК в целия геном.
Какви са видовете ChIP?
Съществуват няколко варианта на имунопреципитация на хроматина в зависимост от експерименталния дизайн и последващия анализ. Най-често срещаните подходи включват ChIP-qPCR, който количествено определя обогатяването на специфични геномни области; ChIP-seq, който използва секвениране от следващо поколение за картографиране на взаимодействията между протеините и ДНК в целия геном; и ChIP-chip, който съчетава ChIP с анализ чрез ДНК микрочипове. Допълнителни варианти, като нативен ChIP (N-ChIP), който анализира хроматин без кръстосано свързване, и ChIP с кръстосано свързване (X-ChIP), който използва химично кръстосано свързване за стабилизиране на взаимодействията между протеините и ДНК, също се използват широко в зависимост от изследвания биологичен въпрос.
Срязване на хроматина с висок капацитет за обработка на проби чрез ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP
Hielscher Ultrasonics произвежда високопроизводителни ултразвукови хомогенизатори с размери от лабораторни до промишлени.