Срязване на хроматина със соникация
Срязването на хроматина е критична стъпка в много работни процеси в епигенетиката и молекулярната биология, особено при хроматиновата имунопреципитация (ChIP), ChIP-seq и свързаните с тях анализи. Целта е хроматинът да се фрагментира на възпроизводими ДНК-белтъчни комплекси, като същевременно се запазва целостта на епитопите и се свежда до минимум загубата на проба. Сред наличните методи ултразвуковата фрагментация на хроматина се превърна в широко използван подход, тъй като осигурява надеждна фрагментация без реагенти с отлична възпроизводимост.
Какво трябва да се има предвид при срязването на хроматина?
Ефективното срязване на хроматина изисква внимателен контрол на експерименталните параметри. Неправилното фрагментиране може да компрометира последващите ChIP експерименти чрез генериране на фрагменти, които са или твърде големи, или прекалено разградени, или несъвместими между пробите.
Един от най-важните фактори е желаното разпределение на размера на фрагментите. За повечето ChIP и ChIP-seq приложения оптимални са хроматиновите фрагменти между 100 и 600 базови двойки. Този диапазон от размери позволява ефективна имунопреципитация, като същевременно осигурява достатъчна разделителна способност за геномно картографиране.
Друг ключов фактор е ефективността на омрежването преди сонирането. Повечето работни процеси на ChIP включват фиксиране с формалдехид за стабилизиране на взаимодействията протеин-ДНК. Прекомерното омрежване обаче може да направи хроматина по-устойчив на фрагментиране, което изисква по-дълго време за сониране и потенциално увеличава топлинното излагане.
Контролът на температурата също е от решаващо значение. Соникацията генерира локализирана енергия, която може да повиши температурата на пробата. Повишените температури могат да увредят ДНК или да денатурират протеините, което да повлияе на разпознаването на антителата по време на ChIP. Затова много изследователи извършват импулсни цикли на сониране, съчетани с интервали на охлаждане, за да поддържат стабилността на пробата.
Концентрацията и обемът на пробата също оказват влияние върху ефективността на фрагментацията. Висококонцентрираните хроматинови суспензии могат да изискват по-дълго време за сониране, докато малките обеми на пробите изискват прецизно подаване на енергия, за да се предотврати прекомерната обработка.
Накрая, изборът на устройство за сониране оказва силно влияние върху възпроизводимостта на експеримента. Устройствата, предназначени за срязване на хроматин, обикновено осигуряват контролирана ултразвукова енергия и стандартизирана работа с пробите, което позволява последователна фрагментация на множество проби.
Ултразвуково срязване на ДНК по време на ChIP – Хроматин имунопреципитация
Кой соникатор трябва да избера за срязване на хроматин?
Различните лабораторни работни процеси изискват различни конфигурации за сониране. Оптималната система зависи до голяма степен от производителността на пробите, обема и формата на експеримента.
Соникатор тип сонда
Соникаторът тип "сонда" доставя ултразвукова енергия директно в пробата чрез титаниева сонда. Тази конфигурация осигурява много висока енергийна плътност и следователно е подходяща за надеждно разрушаване на хроматина в отделни проби.
Сондажните сонатори са особено полезни за:
- Брой на малки и средни проби
- Труден за фрагментиране хроматин
- Гъвкави експериментални протоколи
Многотръбен сонатор - VialTweeter
За лабораториите, които обработват множество проби едновременно, сонаторът с много епруветки VialTweeter осигурява решение с висока степен на възпроизводимост. Системата предава ултразвукова енергия индиректно през държача на флакона, което позволява фрагментирането на няколко запечатани епруветки при идентични условия.
Тази конфигурация предлага важни предимства:
- Паралелно срязване на хроматин на множество проби
- Елиминиране на замърсяването на сондата
- Висока възпроизводимост между епруветките
- Опростен работен процес за подготовка на ChIP проби
Такива системи с много епруветки са подходящи за рутинни ChIP експерименти и проучвания със средна производителност.
Соникатор за микроплатки - UIP400MTP
Изследванията на епигенетиката с висока производителност все повече разчитат на обработка на проби на базата на микроплатки. Микропланковият сонатор UIP400MTP е предназначен за фрагментиране на хроматин директно в стандартни микропланкови плаки, без да се прехвърлят проби.
Този подход позволява:
- Едновременна обработка на десетки или стотици проби
- Удобни за автоматизиране работни процеси
- Равномерно разпределение на ултразвуковата енергия в кладенците
- Значително намаляване на стъпките за обработка на пробите
За големи проекти за ChIP-seq скрининг или високопроизводителни епигенетични изследвания сонирането на микроплатки осигурява изключителна мащабируемост и ефективност. Уонизаторът за многоямкови плаки UIP400MTP е подходящ за интегриране в системи за обработка на течности и автоматизирани лабораторни работни процеси.
Защо да изберем соникацията пред други техники за срязване на хроматина?
В сравнение с ензимните подходи сонирането за ChIP осигурява обективна фрагментация, тъй като процесът не зависи от специфичната за последователността ензимна активност. Това е особено важно за епигенетичните изследвания на целия геном, при които равномерното покритие е от съществено значение.
Друго голямо предимство е мащабируемостта. Ултразвуковите системи могат да поемат единични проби, множество епруветки или цели микроплаки, което позволява на лабораториите да изберат най-подходящата конфигурация за своята експериментална производителност.
И накрая, сонирането осигурява отличен контрол върху параметрите на фрагментация. Чрез регулиране на циклите на импулсите, продължителността и нивата на мощност изследователите могат надеждно да постигнат желаното разпределение на размера на фрагментите.
Фрагментиране на хроматина чрез оптимизирано сониране на ChIP проби.
(а) без срязване (дълги фрагменти в гела);
(б) оптимален профил на фрагментация (обогатяване на фрагментите с 200-600 bp);
(в) прекомерна фрагментация на ДНК (свръхпредставяне на фрагменти, по-къси от 200 bp)
© Jarillo et al., 2018
Сравнение на техниките за срязване на хроматин
| Метод на срязване на хроматина | Принцип | Предимства | Ограничения |
| ултразвук | Високочестотната акустична енергия механично фрагментира хроматина. | Фрагментиране без реагент, високо възпроизводими резултати, регулируемо разпределение на размера на фрагментите, съвместимо с омрежен хроматин, мащабируемо от единични епруветки до формати за много проби и микроплатки. | Изисква оборудване за сониране и оптимизиране на параметрите на сониране. |
| Ензимно разграждане (MNase) | Микрококовата нуклеаза разгражда ДНК между нуклеозомите. | Леко фрагментиране и полезно за анализ на нативен хроматин. | Ензимно отклонение, предпочитание на последователността, трудно контролирано смилане, потенциална променливост между експериментите. |
| Механично срязване (с игла/шприца) | Хроматинът се разрушава чрез многократно прилагане на физическа сила. | Опростен метод, който изисква минимално оборудване. | Слаба възпроизводимост, ограничен контрол върху размера на фрагментите, трудоемкост при многобройни проби. |
| Небулизация | Сгъстеният въздух изтласква ДНК през малки отвори, което води до фрагментация. | Бърз процес на фрагментация. | Възможна е загуба на проба, ограничена мащабируемост, изисква се специализирано оборудване. |
Как да определя количествено и качествено добива на хроматин след ултразвуково фрагментиране?
След сониране за ChIP изследователите трябва да оценят както количеството, така и качеството на фрагментирания хроматин. Тази стъпка на проверка гарантира, че фрагментирането на хроматина отговаря на изискванията на приложенията надолу по веригата, като ChIP-qPCR или ChIP-seq.
Количественото определяне обикновено започва с измерване на концентрацията на ДНК. Спектрофотометричните методи, като например анализът Nanodrop, или флуорометричните анализи, като например количественото определяне на ДНК Qubit, осигуряват надеждни оценки на добива на хроматин след декрослинкване и пречистване.
Въпреки това концентрацията на ДНК сама по себе си не показва дали фрагментацията е била успешна. Затова изследователите оценяват разпределението на размера на фрагментите с помощта на електрофоретични техники. Агарозната гел-електрофореза продължава да бъде често използван подход за визуализиране на ДНК фрагменти и за проверка дали повечето от тях попадат в целевия диапазон на размери.
По-напредналите лаборатории често използват системи за капилярна електрофореза, като например Agilent Bioanalyzer или TapeStation. Тези платформи осигуряват прецизни профили на разпределение на размера и позволяват на изследователите да откриват свръхфрагментация или непълно срязване.
Когато оценяват качеството на хроматина след ултразвукова фрагментация, изследователите обикновено потвърждават:
- По-голямата част от ДНК фрагментите попадат в диапазона 100-600 bp
- Разпределението на фрагментите е последователно при всички повторени проби
- Разграждането на ДНК е минимално
- Общият добив на хроматин е достатъчен за планирания ChIP анализ
Правилният контрол на качеството гарантира, че етапът на срязване на хроматина с ултразвук дава възпроизводими и биологично значими резултати.
Заключение: Ултразвуково срязване на хроматина за надеждни изследвания
Надеждното срязване на хроматина е от основно значение за успешните ChIP и епигенетични изследвания. Ултразвуковото фрагментиране предлага мощно решение, тъй като позволява прецизно, възпроизводимо и без реагенти разкъсване на хроматина в широк спектър от експериментални формати.
Чрез внимателно оптимизиране на параметрите на сониране, проверка на разпределението на размера на фрагментите и избор на подходяща система за сониране – независимо дали става въпрос за сонда, многотръбен сонатор VialTweeter или високопроизводителния сонатор за микроплаки UIP400MTP – изследователите могат да постигнат последователна фрагментация на хроматина, която поддържа висококачествени ChIP и ChIP-seq резултати.
Тъй като изследванията в областта на епигенетиката продължават да се развиват в посока на по-висока производителност и по-добра възпроизводимост на експериментите, ултразвуковото срязване на хроматина остава един от най-универсалните и надеждни методи, достъпни за съвременните лаборатории по молекулярна биология.
Проектиране, производство и консултиране – Качество, произведено в Германия
Ултразвуковите апарати Hielscher са добре известни със своите най-високи стандарти за качество и дизайн. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Тежките условия и взискателните условия се справят лесно с ултразвуковите апарати на Hielscher.
Hielscher Ultrasonics е сертифицирана по ISO компания и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови уреди, отличаващи се с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher са съвместими с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.
Tube rack sonified in the UIP400MTP for chromatin shearing
Литература / Препратки
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
Често задавани въпроси
Какво представлява хроматинът?
Хроматинът е структурен комплекс от ДНК и свързани с нея протеини, който организира генетичния материал в ядрото на еукариотните клетки. Основните белтъци в хроматина са хистоните, около които ДНК се увива, за да образува нуклеозоми. Тази организация уплътнява ДНК, като същевременно регулира достъпа до генетична информация за процеси като транскрипция, репликация и поправка на ДНК.
Какви са видовете хроматин?
Хроматинът обикновено се разделя на две основни форми: евхроматин и хетерохроматин. Еухроматинът е слабо опакован и транскрипционно активен, което позволява на гените да бъдат лесно достъпни за транскрипционната машина. Хетерохроматинът е по-плътен и транскрипционно неактивен, като обикновено съдържа повтарящи се ДНК последователности или гени, които са заглушени. Хетерохроматинът може да бъде разделен на конститутивен хетерохроматин, който остава постоянно кондензиран, и факултативен хетерохроматин, който може да преминава между активно и неактивно състояние в зависимост от клетъчните условия.
Какво е кръстосано свързване?
Омрежването е биохимичен процес, използван за стабилизиране на взаимодействията между биомолекулите чрез образуване на ковалентни връзки между тях. В изследванията на хроматина омрежването обикновено се използва за запазване на взаимодействията между протеини и ДНК в хроматина преди анализ. Химически агенти като формалдехид обикновено се използват за създаване на обратими ковалентни връзки между ДНК и свързаните с нея протеини, което ефективно “замразяване” молекулярни взаимодействия в определен момент от време. Това стабилизиране позволява хроматиновите комплекси да бъдат фрагментирани и обработвани, без да се губят естествените връзки между ДНК и регулаторните протеини, което е от съществено значение за техники като хроматиновата имунопреципитация (ChIP).
Какво представлява ChIP?
Хроматиновата имунопреципитация (ChIP) е техника в молекулярната биология, използвана за изследване на взаимодействията между протеини и ДНК в хроматина. При този метод ДНК-протеиновите комплекси първо се стабилизират, обикновено чрез омрежване, а след това хроматинът се фрагментира. Използват се антитела, специфични за целеви протеин, за да се имунопреципитират комплексите протеин-ДНК, което позволява изолирането и анализирането на свързаните с тях ДНК последователности.
За какво се използва ChIP?
ChIP се използва за идентифициране на геномни области, свързани със специфични ДНК-асоциирани протеини, като например транскрипционни фактори, хистонови модификации или хроматин-асоциирани регулаторни протеини. Техниката се прилага широко за изследване на генната регулация, епигенетичните модификации, местата за свързване на транскрипционни фактори и структурата на хроматина. Когато се комбинира с аналитични методи надолу по веригата, като например количествен PCR (ChIP-qPCR) или секвениране с висока производителност (ChIP-seq), тя дава възможност за картографиране на взаимодействията протеин-ДНК в целия геном.
Какви са видовете ChIP?
Съществуват няколко варианта на имунопреципитация на хроматин в зависимост от експерименталния план и анализа надолу по веригата. Най-разпространените подходи включват ChIP-qPCR, при който се определя количествено обогатяване на специфични геномни области; ChIP-seq, при който се използва секвениране от следващо поколение за картографиране на взаимодействията между протеини и ДНК в целия геном; и ChIP-chip, при който ChIP се комбинира с анализ на ДНК микрочипове. Допълнителни варианти, като нативен ChIP (N-ChIP), при който се анализира некръстосан хроматин, и кръстосан ChIP (X-ChIP), при който се използва химическо кръстосване за стабилизиране на взаимодействията между протеини и ДНК, също се използват широко в зависимост от изследваните биологични въпроси.
Високопроизводително срязване на хроматин с микропланков сонатор UIP400MTP
Hielscher Ultrasonics произвежда високоефективни ултразвукови хомогенизатори от лаборатория да индустриален размер.