Екстракция на белтъци от туморна тъкан с помощта на ултразвукова обработка – протокол

Този протокол описва метод за екстракция на белтъци от туморна тъкан с помощта на ултразвукова обработка, който усъвършенства стандартната процедура на CPTAC за лизис с урея чрез добавяне на контролирана стъпка на ултразвукова обработка със сонда по време на разрушаването на тъканта. Като надгражда утвърдената стратегия на CPTAC за подготовка за задълбочен анализ на протеома и фосфопротеома, тази модификация подобрява разрушаването на клетките и субклетъчните структури, намалява вискозитета на пробите и подпомага освобождаването на белтъци, които обикновено се извличат по-трудно само чрез лизис с урея, особено мембранно свързани белтъци и белтъци, които се свързват с ДНК или са асоциирани с ядрото. В проучването, на което се основава протоколът, процедурата с ултразвукова обработка увеличава откриването както на белтъци, така и на фосфопептиди, като запазва съвместимостта с последващите етапи по схемата на CPTAC: ензимно разграждане, маркиране с TMT, фракциониране, обогатяване на фосфопептиди и анализ чрез LC-MS/MS.

Екстракция на белтъци от туморна тъкан с помощта на ултразвукова обработка за задълбочен протеомен и фосфопротеомен анализ

Следният протокол е оптимизиран за екстракция на белтъци от криогенно стрита туморна тъкан в лизисен буфер с 8 M урея: добавената стъпка на ултразвукова обработка със сонда подобрява извличането на трудни за екстракция класове белтъци, особено белтъци, асоциирани с мембраните и с ДНК/ядрото, преди ензимното разграждане и последващия анализ чрез LC-MS/MS. В проучването на Li et al. (2025), на което се основава протоколът, добавянето на ултразвукова обработка увеличава откриването на белтъци, асоциирани с мембраните и ядрото, и подпомага постигането на задълбочено аналитично покритие на >12 000 белтъци и >25 000 фосфопептиди при използваната от авторите процедура.

Област на приложение на протокола

Използвайте тази процедура за:

• прясно замразена, криогенно стрита туморна тъкан
• клетъчни утайки или други биологични проби, за които екстракцията с урея вече е утвърдена
• процедури за глобална протеомика и фосфопротеомика, използващи разграждане с трипсин и незадължително маркиране с TMT

В проучването на Li et al. (2025) се посочва, че процедурата е приложима и за други видове проби, като клетъчни линии, кръв и урина, но може да е необходима оптимизация според вида на пробата.

Оптимизирана процедура за подготовка на проби с включена стъпка на ултразвукова обработка. Оптимизираната процедура и експерименталният дизайн се основават на протокола на CPTAC за подготовка на проби за глобален протеомен и фосфопротеомен анализ.
Проучване и схема: ©Li et al., 2025

Принцип на действие

В оригиналното проучване към стандартната процедура на CPTAC за лизис с урея е добавена ултразвукова обработка и е установено подобрено откриване на белтъци, асоциирани с мембраните и ядрата. Авторите посочват, че параметрите на ултразвуковата обработка трябва да бъдат прецизно настроени според размера/концентрацията на пробата – чрез избор на размер на сонотрода, вложена енергия и времеви параметри на импулсите.

Например за Hielscher UP200Ht и UP200St това означава:

• използвайте амплитудата и импулсния режим като основни управляващи параметри
• поддържайте пробите студени през цялото време (т.е. върху лед)
• започнете с консервативни настройки
• оптимизирайте според бистротата на пробата, температурата, добива на белтъци и качеството на пептидите при последващите етапи

 
И двата модела ултразвукови апарати на Hielscher с мощност 200 вата, UP200Ht и UP200St, са предназначени за малки и средни обеми проби и имат регулируеми настройки на амплитудата и импулсите; и двата ултразвукови хомогенизатора предлагат цифрово управление чрез сензорен екран за прецизно настройване на параметрите, автоматично записване на данни, свързваем температурен сензор, дистанционно управление и осветяване на пробата.
 

Реагенти за екстракция на белтъци с помощта на ултразвукова обработка

Лизисен буфер с урея

Пригответе пресен буфер непосредствено преди употреба:

• 8 M урея
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL апротинин
• 10 µg/mL леупептин
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Смес от фосфатазни инхибитори 2, 1:100 (v/v)
• Смес от фосфатазни инхибитори 3, 1:100 (v/v)

Уреята трябва да бъде напълно разтворена преди внасянето на добавките; инхибиторите трябва да се добавят непосредствено преди употреба; буферът трябва да се държи върху лед; след внасянето на добавките се препоръчва леко кръгово разклащане вместо интензивно разбъркване на вортекс.
 

Допълнителни реагенти:

• Реагенти за определяне на белтъци чрез BCA анализ
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Йодоацетамид
• LysC
• Трипсин
• Мравчена киселина
• TMT реагенти, ако се използва мултиплексна количествена протеомика
• IMAC реагенти, ако се извършва обогатяване на фосфопептиди

Оборудване за екстракция на белтъци с помощта на ултразвукова обработка

Необходимо оборудване

Препоръки за избор на сонда

За проби с обем около 200–1000 µL използвайте сонотрод с малък диаметър, подходящ за директна обработка на малки обеми с висок интензитет. Hielscher предлага сонотроди с различни диаметри, като по-малкият диаметър на накрайника осигурява по-висок интензитет на върха.

Практическа бележка: използвайте най-малката сонда, която осигурява ефективно смесване без прекомерно разпенване или контакт със стената на съда.

Ако работите с няколко проби едновременно, можете да обмислите използването на ултразвуковия апарат за множество епруветки VialTweeter или ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP!

Инструкции стъпка по стъпка: процедура за екстракция на белтъци с помощта на ултразвукова обработка

A. Предварително охлаждане и подготовка

1. Охладете центрофугата до 4°C.
2. Пригответе пресен лизисен буфер с урея и го дръжте върху лед.
3. Монтирайте UP200Ht или UP200St на стойка в шумоизолиращ кожух.
4. Пригответе ледена баня, достатъчно голяма, за да държи епруветките с пробите изправени и стабилни.

Приготвянето на пресен буфер и работата при ниска температура са от критично значение.

B. Първоначална екстракция с урея

1. Дръжте криогенно стритата тъкан върху лед.
2. Добавете 200 µL охладен лизисен буфер с урея на 50 mg влажна тъкан.
3. Разбъркайте на вортекс за 5–10 s при висока скорост.
4. Инкубирайте за 15 min при 4°C.
5. Повторете стъпката с разбъркване на вортекс и инкубация още веднъж.
6. Центрофугирайте при 20 000g за 10 min при 4°C.
7. Прехвърлете лизата/супернатанта в чиста епруветка с ниско свързване на белтъци.

C. Ултразвукова обработка с UP200Ht или UP200St

Начални условия за ултразвукова обработка

• Амплитуда: започнете с 20–30%
• Продължителност на импулса: 5 s включено
• Охлаждане: 2 min върху лед между импулсите
• Брой цикли: 4 цикъла
• Общо време на активна ултразвукова обработка: 20 s
• Общо време на процеса, включително охлаждането: около 8–10 min

Стъпки на ултразвуковата обработка

1. Прехвърлете лизата в епруветка, подходяща за ултразвукова обработка. Използвайте тясна епруветка с тънки стени, която позволява добър топлообмен и безопасно потапяне на сондата.
2. Поставете епруветката в ледена баня. В публикацията охлаждането по време на ултразвуковата обработка се определя като критично за предотвратяване на термично увреждане.
3. Потопете върха на сондата в пробата. Дръжте върха достатъчно потопен за стабилна кавитация, но не допускайте да докосва стената или дъното на епруветката.
4. Приложете един импулс от 5 s при началната амплитуда.
5. Незабавно върнете пробата изцяло върху лед за 2 min.
6. Повтаряйте до завършване на 4 цикъла.
7. Проверете лизата след цикъла.
8. Продължете само ако е необходимо, като прилагате по един допълнителен импулс от 5 s, винаги последван от пълно охлаждане.
9. Спрете, щом лизатът стане по-хомогенен и по-малко точлив/вискозен.
   Крайният резултат е по-прозрачен лизат, който образува капки вместо непрекъсната вискозна струя.
10. Центрофугирайте при около 16 000g за 15 min при 4°C.
11. Прехвърлете избистрения супернатант в нова епруветка и измерете концентрацията на белтъците.

Сравнение на глобалната протеомика и фосфопротеомика между проби със и без ултразвукова обработка.
a. Брой идентифицирани белтъци (глобална протеомика) във всички PDX туморни тъкани със или без ултразвукова обработка. b. Брой идентифицирани фосфопептиди (обогатяване чрез IMAC) във всички PDX туморни тъкани със или без ултразвукова обработка. Преброени са само белтъци и фосфопептиди със съотношение на количественото съдържание, по-голямо или равно на 25-ия персентил. Съотношението на количественото съдържание е изчислено между проби от един и същ тип.
Проучване и графики: ©Li et al., 2025

Последващо ензимно разграждане и анализ

След ултразвуковата обработка и избистрянето продължете, както е описано в оригиналната процедура по схемата на CPTAC:

1. Разредете лизата 1:3 (v/v) с 50 mM Tris-HCl pH 8,0, за да намалите концентрацията на уреята до <2 M.
2. Добавете LysC в количество 1 mAU на 50 µg белтък и инкубирайте за 2 h при 25°C.
3. Добавете трипсин в съотношение 1:49 ензим:субстрат (w/w) и извършете разграждане през нощта при 25°C.
4. Спрете реакцията чрез добавяне на мравчена киселина до крайна концентрация 1%.
5. Продължете с обезсоляване, маркиране с TMT, фракциониране, обогатяване на фосфопептиди и LC-MS/MS според необходимостта.

Диференциална експресия на фосфопептиди, установена чрез MS с TMT маркиране.
a. Базален подтип с открояване на някои човешки фосфопептиди (начало и край на белтъчната последователност) с повишена експресия в пробите с ултразвукова обработка в сравнение с пробите без ултразвукова обработка. b. Луминален подтип с открояване на някои човешки фосфопептиди (начало и край на protein_sequence) с повишена експресия в пробите с ултразвукова обработка в сравнение с пробите без ултразвукова обработка. c. Обогатени пътища от KEGG въз основа на белтъците, съответстващи на фосфопептидите с повишена експресия в ултразвуково обработени тумори от базалния подтип. d. Обогатени пътища от KEGG въз основа на белтъците, съответстващи на фосфопептидите с повишена експресия в ултразвуково обработени тумори от луминалния подтип.
Проучване и графики: ©Li et al., 2025

Проектиране, производство и консултации – качество, произведено в Германия

Ултразвуковите апарати на Hielscher са добре известни с най-високите си стандарти за качество и проектиране. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Ултразвуковите апарати на Hielscher се справят лесно с тежки условия и взискателни работни среди.

Hielscher Ultrasonics е компания, сертифицирана по ISO, и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови апарати, отличаващи се с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher съответстват на изискванията за CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.

Литература / източници

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.