Извличане на протеини от туморна тъкан с помощта на соникация – протокол

Този протокол описва метод за екстракция на протеини от туморна тъкан с помощта на сониране, който усъвършенства стандартния работен процес на CPTAC карбамиден лизис чрез добавяне на контролирана стъпка на сониране на сондата по време на разрушаването на тъканта. Въз основа на утвърдената дълбокомащабна стратегия за приготвяне на протеоми и фосфопротеоми по CPTAC тази модификация подобрява разрушаването на клетъчната и субклетъчната структура, намалява вискозитета на пробата и подобрява освобождаването на протеини, които обикновено се възстановяват по-трудно само с карбамиден лизис, особено мембранно свързани и ДНК-свързващи или ядрено асоциирани протеини. В основното проучване работният процес, подпомаган от сонирането, увеличава откриването както на протеини, така и на фосфопептиди, като същевременно запазва съвместимостта си с последващото разграждане в стил CPTAC, маркирането с TMT, фракционирането, обогатяването на фосфопептиди и конвейера за LC-MS/MS анализ.

Екстракция на протеини от туморна тъкан с помощта на соникация за дълбочинен протеомен и фосфопротеомен анализ

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Област на приложение на протокола

Използвайте тази процедура за:

• прясно замразена, криопулверизирана туморна тъкан
• клетъчни гранули или други биологични образци, при които вече е установена екстракция на базата на карбамид
• глобални работни процеси за протеомика и фосфопротеомика с използване на триптично разграждане и опционално маркиране с TMT

В проучването на Li и сътр. (2025) се посочва, че работният процес е приложим и за други видове проби, като клетъчни линии, кръв и урина, но може да се наложи оптимизация за всеки вид проба.

Оптимизиран работен процес за подготовка на пробите с въведена стъпка за сониране. Оптимизираният работен процес и експерименталният дизайн се основават на протокола за подготовка на проби CPTAC за глобален протеомен и фосфопротеомен анализ.
Проучване и схема: ©Li et al., 2025

Принцип на работа

Първоначалното проучване добавя сониране към стандартния работен процес на CPTAC карбамиден лизис и установява подобрено откриване на протеини, свързани с мембрани и ядра. Авторите посочват, че параметрите на сонирането трябва да бъдат прецизно настроени по отношение на размера/концентрацията на пробата – чрез избор на размера на сонотрода, входящата енергия и времето на импулса.

Например за Hielscher UP200Ht и UP200St това означава:

• използване на амплитудата и режима на импулса като основни променливи за управление
• поддържайте пробите студени през цялото време (напр. върху лед).
• започнете с консервативни настройки
• оптимизиране спрямо чистотата на пробата, температурата, добива на протеини и качеството на пептидите надолу по веригата

 
И двата модела на Hielscher 200 вата соникатор UP200Ht и UP200St са предназначени за малки и средни обеми на пробата, с регулируеми настройки на амплитудата и импулса; и двата ултразвукови хомогенизатора осигуряват цифров сензорен екран за прецизно регулиране на параметрите, автоматичен запис на данни, включващ се температурен сензор, дистанционно управление, осветление на пробата.
 

Реагенти за екстракция на протеини с помощта на соникация

Буфер за лизис с урея

Приготвяйте пресни непосредствено преди употреба:

• 8 М карбамид
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/ml апротинин
• 10 µg/ml леупептин
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Коктейл от фосфатазен инхибитор 2, 1:100 (v/v)
• Коктейл от фосфатазен инхибитор 3, 1:100 (v/v)

Карбамидът трябва да бъде напълно разтворен преди добавянето на добавки; инхибиторите трябва да се добавят непосредствено преди употреба; буферът трябва да се съхранява върху лед; след добавянето на добавки се препоръчва по-скоро разбъркване, отколкото енергично завихряне.
 

Допълнителни реактиви:

• Реактиви за протеинов анализ BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Йодоацетамид
• LysC
• Трипсин
• Мравчена киселина
• Реагенти TMT, ако използвате мултиплексна количествена протеомика
• IMAC реактиви, ако се извършва обогатяване на фосфопептиди

Оборудване за екстракция на протеини с помощта на соникация

Изисква се

Препоръчителен избор на сонда

За проби с обем около 200-1000 µl използвайте сонотрод с малък диаметър, подходящ за директна високоинтензивна обработка на малки обеми. Hielscher предлага няколко диаметъра на сонотрода, а по-малките диаметри на накрайниците осигуряват по-висок интензитет на върха.

Практическа забележка: Използвайте най-малката сонда, която осигурява ефективно смесване без прекомерно разпенване или контакт със стените на съда.

Ако работите с няколко проби едновременно, може да помислите за многотръбният сонатор VialTweeter или соникатора за микроплатки UIP400MTP!

Инструкции стъпка по стъпка: Процедура за екстракция на протеини с помощта на соникация

A. Предварително охлаждане и подготовка

1. Охладете центрофугата до 4°C.
2. Пригответе пресен буфер за лизис с урея и го съхранявайте в лед.
3. Поставете UP200Ht или UP200St на стойка в звукозаписна кутия.
4. Подгответе ледена баня, която е достатъчно голяма, за да държи епруветките с пробите изправени и стабилни.

Приготвянето на пресен буфер и обработката на студено са от решаващо значение.

B. Първоначално извличане на урея

1. Съхранявайте криопулверизираната тъкан върху лед.
2. Добавете 200 µl охладен буфер за лизис на урея за 50 mg мокра тъкан.
3. Вихър 5-10 с висока скорост.
4. Инкубирайте 15 минути при 4°C.
5. Повторете стъпката с вихрушка и инкубация още веднъж.
6. Центрофугирайте при 20 000 g за 10 минути при 4°C.
7. Прехвърлете лизата/супернатантата в чиста епруветка с ниска степен на свързване.

C. Соникация с използване на UP200Ht или UP200St

Начални условия за соникация

• Амплитуда: започнете от 20-30%
• Дължина на импулса: 5 s ON
• Охлаждане: 2 минути върху лед между импулсите
• Брой цикли: 4 цикъла
• Общо време за активна соникация: 20 s
• Общо време за обработка, включително охлаждане: около 8-10 мин.

Стъпки на соникация

1. Прехвърлете лизата в епруветка, подходяща за сониране. Използвайте тясна, тънкостенна епруветка, която позволява добър топлообмен и безопасно потапяне на сондата.
2. Поставете епруветката в ледена баня. В статията се посочва, че охлаждането по време на соникацията е от решаващо значение за предотвратяване на топлинното увреждане.
3. Потопете накрайника на сондата в пробата. Поддържайте накрайника потопен достатъчно, за да се получи стабилна кавитация, но не позволявайте да докосва стената или дъното на епруветката.
4. Изпълнете един 5-секунден импулс с началната амплитуда.
5. Незабавно върнете пробата изцяло в лед за 2 мин.
6. Повтаряйте, докато завършите 4 цикъла.
7. Проверете лизата след цикъла.
8. Продължете само ако е необходимо, като използвате по един допълнителен импулс от 5 s, винаги последван от пълно охлаждане.
9. Спрете, когато лизатът стане по-еднороден и по-малко жилав/вискозен.
   Крайната точка е по-прозрачен лизат, който образува капки, а не непрекъснат вискозен поток.
10. Центрофугирайте при около 16 000 g за 15 минути при 4°C.
11. Прехвърлете избистрената супернатанта в нова епруветка и измерете концентрацията на протеина.

Сравнение на глобалната протеомика и фосфопротеомиката между сонирани и несонирани проби.
a. Брой идентифицирани протеини (глобална протеомика) във всички туморни тъкани на PDX със или без сониране. б. Брой идентифицирани фосфопептиди (обогатяване с IMAC) във всички туморни тъкани на PDX със или без сониране. Бяха отчетени само протеини и фосфопептиди със съотношение на изобилие, по-голямо или равно на 25-ия персентил. Съотношението на изобилие беше изчислено между същите видове проби.
Проучване и графики: ©Li et al., 2025 г.

Разграждане и анализ надолу по веригата

След сониране и избистряне процедирайте, както е описано в оригиналния работен процес в стил CPTAC:

1. Разредете лизата в съотношение 1:3 (v/v) с 50 mM Tris-HCl pH 8,0, за да намалите карбамида до <2 M.
2. Добавете LysC в количество 1 mAU на 50 µg протеин и инкубирайте 2 часа при 25°C.
3. Добавете трипсин в съотношение 1:49 ензим:субстрат (w/w) и разградете за една нощ при 25°C.
4. Охлаждайте с мравчена киселина до 1% окончателно.
5. Продължете с обезсоляването, етикетирането на TMT, фракционирането, обогатяването на фосфопептиди и LC-MS/MS, както е необходимо.

Диференциална експресия на фосфопептиди от маркирани с TMT MS.
a. Базален подтип, като се подчертават някои човешки фосфопептиди (начало и край на протеиновата последователност), регулирани в сонирани проби в сравнение с несонирани проби. б. Луминален подтип, като се подчертават някои човешки фосфопептиди (начало и край на протеиновата последователност), регулирани в сонирани проби в сравнение с несонирани проби. в. Обогатени KEGG пътища, базирани на протеини с повишена концентрация на фосфопептиди в сонирани тумори от базален подтип. г. Обогатени KEGG пътища, базирани на протеини с повишена концентрация на фосфопептиди в сонирани тумори от луминален подтип.
Проучване и графики: ©Li et al., 2025 г.

Проектиране, производство и консултиране – Качество, произведено в Германия

Ултразвуковите апарати Hielscher са добре известни със своите най-високи стандарти за качество и дизайн. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Тежките условия и взискателните условия се справят лесно с ултразвуковите апарати на Hielscher.

Hielscher Ultrasonics е сертифицирана по ISO компания и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови уреди, отличаващи се с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher са съвместими с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.

Литература / Препратки