Екстракция на протеини с помощта на соникация за фосфопротеомика

В съвременните науки за живота фосфопротеомиката се превърна в крайъгълен камък в технологията за разкодиране на клетъчните сигнални пътища и разбиране на механизмите на заболяванията на системно ниво. Тъй като фосфорилирането регулира критични биологични функции – от ензимната активност до взаимодействията протеин-протеин – точното му измерване е от съществено значение както за фундаменталните изследвания, така и за транслационната медицина. Неотдавнашният напредък в масспектрометрията позволи идентифицирането на десетки хиляди фосфорилиращи събития в един експеримент, което подчертава необходимостта от надеждни, мащабируеми и възпроизводими работни процеси за подготовка на пробите.
Сред най-значимите постижения в тази област е въвеждането на екстракция на протеини с помощта на соникация, което значително подобрява качеството на пробите, производителността и възпроизводимостта. Ултразвуковите технологии, като например VialTweeter и UIP400MTP, сега предефинират начина, по който лабораториите обработват големи групи проби, особено в областта на високопроизводителната фосфопротеомика.

Научното значение на ефективната подготовка на пробите във фосфопротеомиката

Фосфорилирането на белтъците е изключително динамична и обратима посттранслационна модификация, която засяга повечето белтъци в човешките клетки. То регулира структурата, локализацията и мрежите от взаимодействия на протеините, а дисрегулацията му е свързана със заболявания като рак и невродегенерация.
Фосфопротеомичният анализ обаче представлява уникално техническо предизвикателство. Фосфорилираните пептиди често са с ниско съдържание и изискват внимателно обогатяване и високоефективна предварителна подготовка на пробите. Всяка неефективност по време на екстракцията на протеини или разграждането им може да доведе до загуба на сигнал, лоша възпроизводимост и непълно фосфозитно покритие.
Тук звуковата обработка става изключително важна.

Защо соникацията трансформира екстракцията на протеини

Соникацията използва високоинтензивни ултразвукови вълни за механично разрушаване на клетките и тъканите, което позволява ефективно освобождаване на протеини от клетки, тъкани, биотечности и извънклетъчни везикули. В сравнение с конвенционалните техники за лизис, соникацията предлага няколко ясни предимства:

• Първо, той осигурява бързо и равномерно разрушаване на клетките, което е особено важно за запазване на преходните състояния на фосфорилиране. Във фосфопротеомиката дори малки забавяния или непълно лизиране могат да променят сигналните профили, което прави бързото и възпроизводимо извличане от съществено значение.
• Второ, сонирането подобрява добива и разтварянето на протеините, особено при трудни за лизиране проби, като например плътни тъкани или богати на мембрани клетки. Това директно се отразява на по-доброто разграждане надолу по веригата и възстановяването на фосфопептиди.
• Трето, ултразвуковата обработка по своята същност е мащабируема. Устройства като VialTweeter позволяват едновременна соникация на множество запечатани епруветки, като осигуряват идентични условия за обработка на всички проби. Това елиминира променливостта, която се получава при ръчна обработка.
• За още по-високи изисквания за производителност UIP400MTP представлява голям технологичен скок. Той позволява директна соникация на цели микроплаки или стелажи с епруветки, включително флакони с автосамулатор, което го прави идеален за паралелна обработка на стотици проби. Тази възможност е особено ценна в системната биология и клиничните изследвания, където стандартно се използват големи групи проби.

Високопроизводителна соникация: VialTweeter и UIP400MTP на фокус

Интегрирането на модерни ултразвукови устройства във фосфопротеомичните работни процеси не е просто удобство. – това е методологическо подобрение.
VialTweeter е проектиран за синхронизирано ултразвуково третиране на множество затворени флакони, като свежда до минимум кръстосаното замърсяване и осигурява възпроизводимост. Той е особено подходящ за приложения със средна производителност и стандартизирани работни процеси.
 

За разлика от него UIP400MTP е оптимизиран за среди с висока производителност, което позволява:

• Равномерна соникация по цялата площ на стандартни микроплаки, напр. 96-ямкови или 384-ямкови плаки
• Директна обработка на стелажи с епруветки и флакони за автосамолет
• Значително съкращаване на времето за практическа работа
• Подобрена възпроизводимост на големи набори от данни

Тази мащабируемост напълно съответства на съвременните подходи на фосфопротеомиката, при които работните потоци обичайно обработват десетки до стотици проби паралелно.

Общ протокол за подготовка на фосфопротеомични проби с помощта на соникация

Надеждният фосфопротеомичен работен процес обединява ефикасно извличане на протеини, ензимно смилане и обогатяване на фосфопептиди. Следващият план отразява установените най-добри практики, адаптирани към подготовката на базата на сониране:

1. Бързо утаяване и събиране на пробата
   Клетките или тъканите бързо угасват – обикновено чрез бързо замразяване – за запазване на състоянията на фосфорилиране. Тази стъпка е от решаващо значение поради преходния характер на събитията, свързани с фосфорилирането.
2. Ултразвуков клетъчен лизис и извличане на протеини
   Пробите се размразяват и се подлагат на сониране, обикновено в кратки цикли. Ултразвуковата енергия разрушава клетъчните мембрани и освобождава ефективно протеини. Във валидираните работни процеси сонирането се извършва в няколко цикъла, за да се осигури пълен лизис.
   Пример: След размразяване на пробите върху лед, клетъчният лизис се постига чрез сониране, напр. с инструмента Vialtweeter за 2 цикъла, всеки цикъл по 1 мин.
3. Изясняване и количествено определяне на протеини
   След лизиране пробите се центрофугират, за да се отстранят остатъците. Супернатантът, съдържащ разтворими протеини, се събира и се определя количествено, за да се осигури последователно въвеждане на всички проби.
4. Редукция и алкилиране
   Дисулфидните връзки се редуцират (напр. чрез DTT) и алкилират (напр. чрез IAA), за да се стабилизират протеините и да се подобри ефективността на смилането.
5. протеолитично храносмилане
   Протеините се смилат ензимно, обикновено с трипсин, като се получават пептиди, подходящи за масспектрометричен анализ. Прочетете повече за ускореното с ултразвук храносмилане на протеини!
6. Пречистване и обезсоляване на пептиди
   Пептидите се пречистват чрез методи, базирани на C18, за да се отстранят замърсителите, които биха могли да попречат на LC-MS анализа.
7. Обогатяване на фосфопептиди
   Предвид малкото количество фосфорилирани пептиди, за селективно изолиране на фосфопептиди се прилагат техники за обогатяване като Fe-NTA или TiO₂ афинитетни методи.
8. LC-MS/MS анализ и обработка на данни
   Обогатените проби се анализират с помощта на масспектрометрия с висока разделителна способност, като често се използва независимо от данните събиране (DIA) за по-добро количествено определяне и възпроизводимост.

Мащабните работни процеси могат да бъдат адаптирани към 96-ямкови плаки, което позволява паралелна обработка на до стотици проби. – подход, напълно съвместим със сонирането, базирано на UIP400MTP.
 

Оптимизиран протокол за бързо гасене на фосфопротеома, обогатяване на фосфопептиди и Phos-DIA-MS.
Протокол и изображение: ©Die et al. 2023

Подобряване на възпроизводимостта и качеството на данните чрез соникация

Едно от основните предизвикателства в областта на фосфопротеомиката е постигането на последователно количествено определяне в големи набори от данни. Променливостта, въведена по време на подготовката на пробите, може да заличи биологично значимите разлики.

Соникацията решава този проблем, като осигурява:

1. Стандартизиран енергиен разход за всички проби
2. Намалена ръчна променливост
3. Подобрена възпроизводимост при екстракция и смилане на протеини

Когато се комбинират с високопроизводителни платформи като UIP400MTP, лабораториите могат да постигнат ниво на последователност, което е от съществено значение за системните биологични изследвания и откриването на клинични биомаркери.

Бъдещето на фосфопротеомиката: Автоматизация и мащабируемост

Тъй като фосфопротеомиката продължава да се разширява и да намира широкомащабни и клинични приложения, търсенето на автоматизация и производителност само ще се увеличава. Подготовката на проби чрез соникация, особено когато е интегрирана със съвместими с микроплатки системи, представлява ключова технология, която дава възможност за това.
Като съчетават ефективен ултразвуков лизис, паралелна обработка и съвместимост с автоматизирани работни процеси, устройства като VialTweeter и UIP400MTP поставят нови стандарти в подготовката на проби за протеомика.
Прочетете повече за интегрирането на UIP400MTP в автоматизираните лабораторни работни процеси!

Възползвайте се от подготовката на проби с помощта на соникация във фосфопротеомиката!

Екстракцията на протеини с помощта на соникация се превърна в критичен компонент на съвременната фосфопротеомика, предлагайки несравнима ефективност, мащабируемост и възпроизводимост. С нарастващата необходимост от анализ на сложни биологични системи в големи групи проби, ултразвуковите технологии са не само изгодни – те са от съществено значение.
Като позволяват високопроизводителни, стандартизирани работни процеси, решения като VialTweeter и UIP400MTP ускоряват откритията в областта на клетъчните сигнали, механизмите на заболяванията и прецизната медицина.

Проектиране, производство и консултиране – Качество, произведено в Германия

Ултразвуковите апарати Hielscher са добре известни със своите най-високи стандарти за качество и дизайн. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Тежките условия и взискателните условия се справят лесно с ултразвуковите апарати на Hielscher.

Hielscher Ultrasonics е сертифицирана по ISO компания и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови уреди, отличаващи се с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher са съвместими с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.

Hielscher Sonicator за много проби модели UIP400MTP за микроплаки, VialTweeter и CupHorn: високоскоростно и високопроизводително приготвяне на проби