Екстракция на протеини с помощта на ултразвукова обработка за фосфопротеомика

В съвременните науки за живота фосфопротеомиката се утвърди като основополагаща технология за разкриване на клетъчните сигнални пътища и разбиране на механизмите на заболяванията на системно ниво. Тъй като фосфорилирането управлява ключови биологични функции – от ензимната активност до взаимодействията протеин–протеин – прецизното му измерване е от съществено значение както за фундаменталните изследвания, така и за транслационната медицина. Последните постижения в масспектрометрията позволиха идентифицирането на десетки хиляди събития на фосфорилиране в един експеримент, което подчертава необходимостта от надеждни, мащабируеми и възпроизводими работни процеси за подготовка на проби.
Сред най-значимите развития в тази област е въвеждането на екстракция на протеини с помощта на ултразвукова обработка, която значително подобрява качеството на пробите, капацитета за обработка на проби и възпроизводимостта. Ултразвукови технологии като VialTweeter и UIP400MTP вече променят начина, по който лабораториите обработват големи групи проби, особено във фосфопротеомиката с висок капацитет за обработка на проби.

Научното значение на ефективната подготовка на проби във фосфопротеомиката

Фосфорилирането на протеините е силно динамична и обратима посттранслационна модификация, която засяга по-голямата част от протеините в човешките клетки. То регулира структурата и локализацията на протеините и мрежите от взаимодействия между тях, а нарушената му регулация е свързана със заболявания като рак и невродегенерация.
Фосфопротеомният анализ обаче поставя специфични технически предизвикателства. Фосфорилираните пептиди често присъстват в ниски количества и изискват внимателно обогатяване и високоефективна предварителна подготовка на пробите. Всяка неефективност при екстракцията или разграждането на протеините може да доведе до загуба на сигнал, ниска възпроизводимост и непълно покритие на местата на фосфорилиране.
Именно тук ултразвуковата обработка става решаваща.

Защо ултразвуковата обработка преобразява екстракцията на протеини

Ултразвуковата обработка използва ултразвукови вълни с висок интензитет за механично разрушаване на клетки и тъкани, което позволява ефективно освобождаване на протеини от клетки, тъкани, биологични течности и извънклетъчни везикули. В сравнение с конвенционалните техники за лизис ултразвуковата обработка предлага няколко ясно изразени предимства:

• Първо, тя осигурява бързо и равномерно разрушаване на клетките, което е особено важно за запазването на преходните състояния на фосфорилиране. Във фосфопротеомиката дори малки забавяния или непълен лизис могат да променят профилите на сигнализация, поради което бързата и възпроизводима екстракция е от съществено значение.
• Второ, ултразвуковата обработка подобрява добива и солюбилизацията на протеините, особено при проби, които трудно се поддават на лизис, като плътни тъкани или клетки с много мембрани. Това пряко води до по-добро последващо разграждане и извличане на фосфопептидите.
• Трето, ултразвуковата обработка по своята същност е мащабируема. Устройства като VialTweeter позволяват едновременна ултразвукова обработка на множество запечатани епруветки, като осигуряват еднакви условия за обработка на всички проби. Това премахва вариабилността, възникваща при ръчно манипулиране.
• При изисквания за още по-висок капацитет за обработка на проби UIP400MTP представлява значителен технологичен напредък. Той позволява директна ултразвукова обработка на цели микроплаки или стативи за епруветки, включително виали за автосемплер, което го прави идеален за паралелна обработка на стотици проби. Тази възможност е особено ценна в системната биология и клиничните изследвания, където големите групи проби са стандарт.

Ултразвукова обработка с висок капацитет за обработка на проби: фокус върху VialTweeter и UIP400MTP

Интегрирането на усъвършенствани ултразвукови устройства във фосфопротеомните работни процеси не е просто удобство – то е методологично подобрение.
VialTweeter е предназначен за синхронизирана ултразвукова обработка на множество затворени виали, като свежда до минимум кръстосаното замърсяване и същевременно осигурява възпроизводимост. Той е особено подходящ за приложения със среден капацитет за обработка на проби и стандартизирани работни процеси.
 

За разлика от него UIP400MTP е оптимизиран за среди с висок капацитет за обработка на проби, като позволява:

• Равномерна ултразвукова обработка на цели стандартни микроплаки, например плаки с 96 или 384 ямки
• Директна обработка на стативи за епруветки и виали за автосемплер
• Значително намаляване на времето за ръчна работа
• Подобрена възпроизводимост в големи набори от данни

Тази мащабируемост съответства напълно на съвременните подходи във фосфопротеомиката, при които работните процеси обичайно включват паралелна обработка на десетки до стотици проби.

Общ протокол за подготовка на фосфопротеомни проби с помощта на ултразвукова обработка

Надеждният фосфопротеомен работен процес обединява ефективна екстракция на протеини, ензимно разграждане и обогатяване на фосфопептиди. Следната схема отразява утвърдени най-добри практики, адаптирани към подготовката чрез ултразвукова обработка:

1. Бързо прекратяване на реакциите в пробите и събирането им
   Реакциите в клетките или тъканите се прекратяват бързо – обикновено чрез мигновено замразяване – за да се запазят състоянията на фосфорилиране. Тази стъпка е решаваща поради преходния характер на събитията на фосфорилиране.
2. Ултразвуков клетъчен лизис и екстракция на протеини
   Пробите се размразяват и се подлагат на ултразвукова обработка, обикновено на кратки цикли. Ултразвуковата енергия разрушава клетъчните мембрани и освобождава протеините ефективно. При валидирани работни процеси ултразвуковата обработка се извършва в няколко цикъла, за да се осигури пълен лизис.
   Пример: След размразяване на пробите върху лед клетъчният лизис е постигнат чрез ултразвукова обработка, например с устройството VialTweeter за 2 цикъла, всеки с продължителност 1 min.
3. Избистряне и количествено определяне на протеините
   След лизиса пробите се центрофугират, за да се отстранят клетъчните остатъци. Супернатантът, съдържащ разтворими протеини, се събира и се определя количеството на протеините в него, за да се осигури еднакво входно количество за всички проби.
4. Редукция и алкилиране
   Дисулфидните връзки се редуцират (например с DTT) и се алкилират (например с IAA), за да се стабилизират протеините и да се подобри ефективността на разграждането.
5. Протеолитично разграждане
   Протеините се разграждат ензимно, обикновено с трипсин, като се получават пептиди, подходящи за масспектрометричен анализ. Прочетете повече за разграждането на протеини, ускорено чрез ултразвук!
6. Пречистване и обезсоляване на пептидите
   Пептидите се пречистват чрез методи, базирани на C18, за да се отстранят замърсителите, които биха могли да повлияят на LC-MS анализа.
7. Обогатяване на фосфопептиди
   Предвид ниското количество на фосфорилираните пептиди се прилагат техники за обогатяване като афинитетни методи с Fe-NTA или TiO₂ за селективно изолиране на фосфопептиди.
8. LC-MS/MS анализ и обработка на данните
   Обогатените проби се анализират чрез масспектрометрия с висока разделителна способност, като често се използва независимо от данните събиране на данни (DIA) за подобрено количествено определяне и възпроизводимост.

Трябва да се отбележи, че мащабните работни процеси могат да бъдат адаптирани към формати с плаки с 96 ямки, което позволява паралелна обработка на до стотици проби – подход, напълно съвместим с ултразвуковата обработка с UIP400MTP.
 

Оптимизиран протокол за бързо прекратяване на реакциите във фосфопротеома, обогатяване на фосфопептиди и Phos-DIA-MS.
Протокол и изображение: ©Die et al. 2023

Подобряване на възпроизводимостта и качеството на данните чрез ултразвукова обработка

Едно от основните предизвикателства във фосфопротеомиката е постигането на съгласувано количествено определяне в големи набори от данни. Вариабилността, възникваща при подготовката на пробите, може да прикрие биологично значими разлики.

Ултразвуковата обработка решава този проблем, като осигурява:

1. Стандартизирано въвеждане на енергия във всички проби
2. Намалена вариабилност, дължаща се на ръчната работа
3. Подобрена възпроизводимост при екстракцията и разграждането на протеините

В комбинация с платформи с висок капацитет за обработка на проби като UIP400MTP лабораториите могат да постигнат степен на съгласуваност, която е от съществено значение за изследванията в системната биология и откриването на клинични биомаркери.

Бъдещето на фосфопротеомиката: автоматизация и мащабируемост

Тъй като фосфопротеомиката продължава да навлиза в мащабни и клинични приложения, търсенето на автоматизация и капацитет за обработка на проби само ще се увеличава. Подготовката на проби чрез ултразвукова обработка, особено когато е интегрирана със системи, съвместими с микроплаки, представлява ключова технология, която позволява това развитие.
Като съчетават ефективен ултразвуков лизис, паралелна обработка и съвместимост с автоматизирани работни процеси, устройства като VialTweeter и UIP400MTP установяват нови стандарти в подготовката на проби за протеомика.
Прочетете повече за интегрирането на UIP400MTP в автоматизирани лабораторни работни процеси!

Възползвайте се от подготовката на проби с помощта на ултразвукова обработка във фосфопротеомиката!

Екстракцията на протеини с помощта на ултразвукова обработка се превърна в решаващ компонент на съвременната фосфопротеомика, като предлага ненадминати ефективност, мащабируемост и възпроизводимост. С нарастващата необходимост от анализ на сложни биологични системи в големи групи проби ултразвуковите технологии са не просто полезни – те са незаменими.
Като позволяват стандартизирани работни процеси с висок капацитет за обработка на проби, решения като VialTweeter и UIP400MTP ускоряват откритията в клетъчната сигнализация, механизмите на заболяванията и прецизната медицина.

Проектиране, производство и консултиране – качество, произведено в Германия

Ултразвуковите уреди на Hielscher са добре известни с най-високите си стандарти за качество и проектиране. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови уреди в промишлени съоръжения. Ултразвуковите уреди на Hielscher лесно се справят с тежки условия и взискателни среди.

Hielscher Ultrasonics е компания, сертифицирана по ISO, и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови уреди, които се отличават с най-съвременни технологии и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите уреди на Hielscher са в съответствие с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.

Модели уреди на Hielscher за ултразвукова обработка на множество проби – UIP400MTP за микроплаки, VialTweeter и CupHorn: подготовка на проби с висока скорост и висок капацитет за обработка на проби