Депарафинизация и екстракция на протеини от FFPE

Улеснете извличането на протеин от фиксирани с формалин парафин (FFPE) тъканни участъци, като използвате оптимизирана комбинация от депарафинизация, разтваряне и ултразвук с многотръбен ултразвук VialTweeter. Този протокол поддържа протеомика, базирана на масспектрометрия надолу по веригата, и е съвместим с работните процеси за почистване на SP3 и ензимно храносмилане.

Тази SOP е предназначена за лабораторен персонал, участващ в протеомен анализ на тъканни проби FFPE с помощта на високоефективна ултразвук. Той е оптимизиран за до десет FFPE проби, обработвани паралелно с помощта на VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

Протокол: Извличане на протеин от FFPE проби с помощта на VialTweeter

Материали и реактиви

Реактиви

• Ксилол (хистологична степен)
• Етанол (абсолютни 96%)
• Лизис буфер:

6 M гуанидин хидрохлорид
50 mM Tris-HCl, pH 8.5
10 mM TCEP (Tris(2-карбоксиетил)фосфин)
40 mM CAA (2-хлорацетамид)

• Протеазен инхибитор (по избор; напр. cOmplete™ mini EDTA)

Оборудване

• Многотръбен ултразвуков ултразвук VialTweeter
• 1,5 ml или 2,0 ml нискосвързващи микроцентрофужни епруветки
• Топлинен блок или инкубатор (настройки 95°C и 80°C)
• Микроцентрофуга
• Термомиксер (по избор, но препоръчително)

Примерен вход

• 1–2 секции FFPE тъкан с дебелина 10 μm на проба (т.е. на флакон)

или

• Общо ~100 μg тъкан на проба (т.е. на флакон)

Забележка: Използвайте пресни остриета за микротомия, за да сведете до минимум замърсяването с остатъци от парафин.

Процедура

1. депарафинизация
   1. Прехвърлете FFPE секции в ниско свързващи микроцентрофужни епруветки.
   2. Добавете 1 ml ксилол, вихр за кратко.
   3. Инкубира се 10 минути при стайна температура.
   4. Центрофуга на 14 000 × g за 2 минути; Изхвърлете супернатант.
   5. Повторете измиването с ксилол още веднъж (стъпки 2–4).
   6. Измийте пелетите с 1 ml 96% етанол, вихр, след което центрофугайте на 14 000 × g за 2 минути. Изхвърлете супернатанта.
   7. Повторете измиването с етанол още веднъж (общо 2 измивания с етанол).
   8. Изсушете пелетите на въздух за 10 минути при стайна температура с отворени капаци, за да се изпари остатъчният етанол.
2. Извличане на протеини и соникация
   1. Добавете 200 μL буфер за лизис към всяка суха пелета.
      Забележка: Въпреки че ултразвукът побира до 1 ml, 200 μL е оптимално за обработка надолу по веригата.

   2. Смесете чрез вихр или нежно пипетиране.
3. Първа термична инкубация
   1. Епруветките се инкубират при 95 °C за 30 минути, с разбъркване при 400 оборота в минута с помощта на термомиксер или топлинен блок.
   2. Оставете пробите да се охладят при стайна температура за 5 минути.
4. Първа Уникация с VialTweeter
   1. Поставете епруветките във флакона за високи честоти.
   2. Настройте VialTweeter UP200St на стойностите по-долу и озвучете.
Настройки на Sonicator
• Задайте амплитудата (A) на 100%
• Задайте режим на пулсация (C) на 100%
• Часовник на периода: включен
• Навреме: 60s
• Време за изключване: 30s
• Гранична стойност: 15 минути (съответства на 10 цикъла)
(Бележка за изчисление: (60 s On + 30 s Off) × 10 цикъла = 900 s = 15 min)
5. Втора термична инкубация
   Извадете епруветките и инкубирайте отново при 95 °C за 15 минути, 400 об / мин.
6. Втора развръзка
   Повторете ултразвука на VialTweeter, като използвате същите настройки (както по-горе) за допълнителни 10 цикъла (общо 15 минути).
7. Избистряне на лизат
   1. Пробите се центрофугират при 13 000 × g за 10 минути при 23°C (стайна температура).
   2. Внимателно съберете супернатанта в нова 2,0 ml тръба Safe-lock Eppendorf. Избягвайте да нарушавате пелетата.
8. Обработка надолу по веригата
   Лизатът вече е готов за почистване със SP3 и ензимно храносмилане.

Бележки и най-добри практики

1. Рискът от прегряване по време на ултразвук се смекчава чрез програмирано включване/изключване.
2. Избягвайте завихряне след ултразвук, за да предотвратите агрегацията на протеини.

Изхвърляне на отпадъци и безопасност

Таблицата по-долу ви дава представа за приблизителния капацитет на обработка на нашите ултразвукови апарати с лабораторен размер: