Депарафинизация и извличане на протеини от FFPE

Улеснете извличането на протеини от тъканни срезове, фиксирани с формалин и включени в парафин (FFPE), чрез оптимизирана комбинация от депарафинизация, солюбилизация и ултразвукова обработка с многoепруветъчен ултразвуков апарат VialTweeter. Този протокол подпомага последващия протеомен анализ чрез масспектрометрия и е съвместим с работни процеси за пречистване чрез SP3 и ензимно разграждане.

Тази стандартна оперативна процедура (SOP) е предназначена за лабораторен персонал, който извършва протеомен анализ на FFPE тъканни проби чрез високоефективна ултразвукова обработка. Тя е оптимизирана за до десет FFPE проби, обработвани паралелно с многоепруветъчния ултразвуков апарат VialTweeter.

Протокол: извличане на протеини от FFPE проби с VialTweeter

Материали и реактиви

Реактиви

• Ксилен (с чистота за хистология)
• Етанол (абсолютен 96%)
• Буфер за лизис:

6 M гуанидин хидрохлорид
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine)
40 mM CAA (2-Chloroacetamide)

• Протеазен инхибитор (по избор; напр. cOmplete™ mini без EDTA)

Оборудване

• Многоепруветъчен ултразвуков апарат VialTweeter
• Микроцентрофужни епруветки от 1,5 mL или 2,0 mL с ниска адсорбция
• Нагревателен блок или инкубатор (настройки за 95°C и 80°C)
• Микроцентрофуга
• Термомиксер (по избор, но се препоръчва)

Изходно количество проба

• 1–2 среза от FFPE тъкан с дебелина 10 µm за всяка проба (т.е. за всяко флаконче)

ИЛИ

• Общо ~100 µg тъкан за всяка проба (т.е. за всяко флаконче)

Забележка: Използвайте нови остриета за микротомия, за да сведете до минимум замърсяването с парафинови остатъци.

Процедура

1. Депарафинизация
   1. Прехвърлете FFPE срезовете в микроцентрофужни епруветки с ниска адсорбция.
   2. Добавете 1 mL ксилен и разбъркайте за кратко на вортекс.
   3. Инкубирайте 10 минути при стайна температура.
   4. Центрофугирайте при 14 000 × g за 2 минути; изхвърлете супернатанта.
   5. Повторете промиването с ксилен още веднъж (стъпки 2–4).
   6. Промийте утайката с 1 mL 96% етанол, разбъркайте на вортекс, след което центрофугирайте при 14 000 × g за 2 минути. Изхвърлете супернатанта.
   7. Повторете промиването с етанол още веднъж (общо 2 промивания с етанол).
   8. Оставете утайката да изсъхне на въздух за 10 минути при стайна температура с отворени капачки, за да се изпари остатъчният етанол.
2. Извличане на протеини и ултразвукова обработка
   1. Добавете 200 µL буфер за лизис към всяка суха утайка.

      Забележка: Въпреки че ултразвуковият апарат побира до 1 mL, 200 µL е оптималният обем за последваща обработка.

   2. Смесете чрез разбъркване на вортекс или внимателно пипетиране.
3. Първа термична инкубация
   1. Инкубирайте епруветките при 95 °C за 30 min с разклащане при 400 rpm, като използвате термомиксер или нагревателен блок.
   2. Оставете пробите да се охладят при стайна температура за 5 min.
4. Първа ултразвукова обработка с VialTweeter
   1. Поставете епруветките във VialTweeter.
   2. Настройте VialTweeter UP200St на посочените по-долу стойности и извършете ултразвуковата обработка.
Настройки на ултразвуковия апарат
• Задайте амплитудата (A) на 100%
• Задайте импулсния режим (C) на 100%
• Таймер за периодите: включен
• Време на включване: 60s
• Време на изключване: 30s
• Гранична стойност: 15 min (съответства на 10 цикъла)
(Забележка за изчислението: (60 s включено + 30 s изключено) × 10 цикъла = 900 s = 15 min)
5. Втора термична инкубация
   Извадете епруветките и инкубирайте отново при 95 °C за 15 min, 400 rpm.
6. Втора ултразвукова обработка
   Повторете ултразвуковата обработка с VialTweeter при същите настройки (както по-горе) за още 10 цикъла (общо 15 min).
7. Избистряне на лизата
   1. Центрофугирайте пробите при 13 000 × g за 10 min при 23°C (стайна температура).
   2. Внимателно прехвърлете супернатанта в нова епруветка Safe-lock Eppendorf от 2,0 mL. Избягвайте нарушаването на утайката.
8. Последваща обработка
   Лизатът вече е готов за пречистване чрез SP3 и ензимно разграждане.

Бележки и най-добри практики

1. Рискът от прегряване по време на ултразвуковата обработка се намалява чрез програмирани цикли на включване/изключване.
2. Избягвайте разбъркване на вортекс след ултразвуковата обработка, за да предотвратите агрегацията на протеини.

Обезвреждане на отпадъци и безопасност

Таблицата по-долу дава представа за приблизителния капацитет за обработка на нашите ултразвукови апарати с лабораторни размери: