Подготовка на FFPE проби с висок капацитет: екстракция на протеини и срязване на нуклеинови киселини
С ултразвуковия апарат UIP400MTP с висок капацитет за обработка на проби Hielscher Ultrasonics преодолява предизвикателствата при подготовката на тъкани, фиксирани с формалин и включени в парафин (FFPE). Научете как ултразвуковата обработка позволява обработването на голям брой FFPE проби за депарафинизация, лизис на тъкани, хомогенизация, екстракция на протеини и срязване на ДНК/РНК! Възползвайте се от ултразвуковата подготовка на FFPE тъкани – обработване на голям брой проби в многоямкови плаки! Получавайте висококачествени проби в голям брой за надеждни изследователски резултати! И не на последно място, спестявайте време и пари!
Подготовка на FFPE проби, улеснена чрез ултразвукова обработка с висок капацитет
Фиксирането с формалин и включването в парафин (FFPE) е най-разпространеният метод за съхраняване и архивиране на солидни тъкани. Екстракцията на биомолекули от FFPE тъканни проби често представлява значително предизвикателство поради качеството на съхраняваните проби. Тези проби, които са безценен ресурс в молекулярната биология и клиничните изследвания, предоставят богат източник на биологична информация за ретроспективни проучвания и валидиране на диагностични биомаркери. Въпреки това процесът на фиксиране с формалин и включване в парафин, макар да запазва архитектурата и морфологията на тъканите, затруднява екстракцията на висококачествени нуклеинови киселини и протеини. Формалинът предизвиква образуване на напречни връзки между нуклеиновите киселини и протеините, което води до молекулярна фрагментация и химични модификации. Научете как ултразвуковият апарат UIP400MTP с висок капацитет за обработка на проби преодолява предизвикателствата при подготовката на FFPE проби!
Ултразвуков апарат за ефективна подготовка на FFPE проби
- Лесен работен процес: опростени процеси, удобни за потребителя.
- Депарафинизация, екстракция на протеини, срязване на ДНК / РНК
- Бърза обработка с висок капацитет: ефективно обработване на многоямкови плаки.
- Ефективна депарафинизация: подобрена солюбилизация на протеините.
- Нетоксични разтворители: избягва се използването на вредни органични разтворители като ксилен.
Ултразвуков апарат UIP400MTP с висок капацитет за обработка на проби за обработване на FFPE проби с висок капацитет в многоямкови плаки
Напредък в техниките за екстракция на протеини от FFPE тъкани
Hielscher Ultrasonics преодолява предизвикателствата при подготовката на FFPE проби с висок капацитет. Ултразвуковата обработка използва ултразвукови вълни за генериране на механични вибрации и фокусирана кавитация, които ефективно разрушават клетъчните структури и подобряват солюбилизацията на биомолекулите. Тази техника придоби популярност благодарение на способността си да повишава ефективността и добива при екстракция на нуклеинови киселини и протеини от FFPE тъкани, както и при срязване на ДНК и РНК за подготовка на библиотеки. Много е важно да се подчертае, че ултразвуковата обработка с апарата UIP400MTP за многоямкови плаки запазва целостта на тези биомолекули за последващи приложения.
Срязване на нуклеинови киселини чрез ултразвукова обработка с висок капацитет
Ултразвуковият апарат UIP400MTP за многоямкови плаки, предназначен за работа с висок капацитет за обработка на проби, извежда подготовката на FFPE проби на ново ниво. Този метод за ултразвукова обработка на многоямкови плаки осигурява ефективно и надеждно решение за едновременно обработване на множество проби. Той улеснява бързата и възпроизводима екстракция на ДНК, РНК и протеини, които са от решаващо значение за различни аналитични техники, включително секвениране от ново поколение (NGS), количествена PCR и протеомни анализи. Оптимизирането на параметрите на ултразвуковата обработка, като амплитуда, продължителност и температура, допълнително подобрява качеството и увеличава количеството на екстрахираните биомолекули.
Ултразвуковият апарат UIP400MTP за многоямкови плаки предлага значителни предимства при фрагментирането и срязването на ДНК и РНК от FFPE тъкани. Една от отличителните характеристики на тази система е способността ѝ да постига тесен диапазон от размери на фрагментите на ДНК и РНК, като осигурява прецизно регулиране на интензивността на ултразвуковата обработка за получаване на къси фрагменти от 150–200 базови двойки (bp) или по-дълги фрагменти от 15–20 килобазови двойки (kbp). Тази универсалност прави UIP400MTP незаменим както за секвениране с къси прочити, така и за секвениране с дълги прочити, като гарантира висококачествени резултати при секвениране от ново поколение (NGS) и секвениране на целия геном (WGS). Прецизният контрол върху размера на фрагментите е от решаващо значение за изследователите във всички области на геномиката, тъй като позволява подготовката на проби според зададените спецификации.
Свържете се с нас за усъвършенствани решения за FFPE тъкани
Открийте ултразвуковия апарат UIP400MTP за многоямкови плаки за ефективно извличане на биомолекули от FFPE проби, като се запазва целостта на екстрахираните нуклеинови киселини и протеини и се гарантира възпроизводимостта на резултатите. Тази технология се интегрира безпроблемно с други препаративни и аналитични работни процеси, като рационализира и подобрява молекулярните изследвания с използване на архиви от FFPE тъкани.
Фиксатори и техните ефекти
Фиксирането е ключов етап от подготовката на проби, който запазва клетъчните структури, спира биохимичните реакции и предотвратява разграждането. В зависимост от конкретните експериментални изисквания се използват различни фиксатори. Двата най-разпространени фиксатора са формалдехидът и параформалдехидът, които образуват напречни връзки между протеините и нуклеиновите киселини, запазвайки морфологията и антигенността на клетките и тъканите. Други фиксатори, като етанол, метанол и глутаралдехид, се използват за специфични приложения.
Формалдехидните и параформалдехидните фиксатори образуват метиленови мостове между аминогрупите, което води до образуване на напречни връзки между протеините. Този процес ефективно обездвижва клетъчните компоненти, запазвайки тяхната цялост по време на последващите етапи на анализа. Ефектите на тези фиксатори могат да се влияят от фактори като концентрация, pH и температура, а оптимизирането на тези параметри е от решаващо значение за осигуряване на оптимално запазване на клетъчните структури.
Предимства на ултразвуковата подготовка на FFPE проби
Ултразвуковата обработка е мощна техника за разрушаване на фиксирани клетки и тъкани, която превъзхожда конвенционалните техники. Тя предлага няколко съществени предимства пред традиционните методи за лизис:
- Бързина и ефективност: Ултразвуковият лизис осигурява бързо разрушаване на клетките и тъканите, като значително намалява времето за обработка в сравнение с механичните или химичните методи за лизис. Високочестотните звукови вълни, генерирани от ултразвукова сонда, създават механични сили на срязване, които предизвикват разрушаване на фиксираните клетъчни структури. Това бързо и ефективно разрушаване позволява на изследователите да обработват големи обеми проби за кратко време.
- Щадящ и регулируем: Ултразвуковият лизис предлага щадящ механизъм на разрушаване, който свежда до минимум увреждането на чувствителни биомолекули като протеини, нуклеинови киселини и ензими. За разлика от механичните методи, които генерират прекомерна топлина или сили на срязване, ултразвуковият лизис използва контролирана кавитация за разрушаване на клетките, като същевременно запазва целостта и функционалността на вътреклетъчните компоненти.
- Универсалност: Ултразвуковият лизис може да се прилага върху проби, обработени с различни фиксатори, което позволява на изследователите да работят с широк спектър от фиксирани проби. Независимо дали се използва формалдехид, параформалдехид или алтернативни фиксатори, ултразвуковият лизис осигурява последователно ефективно разрушаване, като гарантира оптимално извличане на клетъчните компоненти.
- Висок добив и качество: Ултразвуковият лизис улеснява получаването на висок добив от неповредени клетъчни компоненти благодарение на способността си да разрушава равномерно фиксираните клетки и тъкани. Това позволява последващите приложения, като анализ на протеини, екстракция на нуклеинови киселини и ензимни анализи, да дават надеждни и възпроизводими резултати.
- Съвместимост с автоматизация: Ултразвуковият лизис може лесно да се интегрира в автоматизирани системи, позволявайки обработване на проби с висок капацитет. Тази съвместимост позволява на изследователите да рационализират работния си процес и да увеличат производителността, особено при мащабни проучвания.
Ултразвуков апарат UIP400MTP за 96-ямкови плаки за ултразвукова обработка на микротитърни и многоямкови плаки
Ултразвуковият лизис революционизира разрушаването на фиксирани клетки и тъкани, като предлага множество предимства пред традиционните методи за лизис. Неговата бързина, ефективност, селективност, универсалност, висок добив и съвместимост с автоматизация го правят незаменим инструмент в изследванията по молекулярна биология и биотехнологии. Предлагайки както безконтактни ултразвукови апарати, така и апарати със сонда, Hielscher Ultrasonics осигурява най-подходящия ултразвуков хомогенизатор за вашето приложение в науките за живота. Независимо дали искате да обработвате единични проби, множество проби или много голям брой проби едновременно, ние ще ви предложим най-добрия ултразвуков апарат, съответстващ на вашите изследователски и диагностични изисквания.
Прочетете повече за безконтактните ултразвукови апарати на Hielscher за подготовка на множество проби и подготовка на проби с висок капацитет!
- еднократна инвестиция
- използвайте собствените си консумативи
- без повтарящи се разходи за фирмени принадлежности и консумативи
- висок капацитет за обработка на проби
- прецизен контрол
- най-съвременна технология
- надеждност и здравина
- регулируем, прецизен контрол на процеса
- индустриално изпълнение: може да работи непрекъснато 24/7
- лесна и безопасна работа
- минимална поддръжка
Прочетете повече за приложенията на ултразвуковите апарати в науките за живота!
Ултразвуков апарат UIP400MTP за всякакви 96-ямкови плаки, микротитърни плаки и многоямкови плаки.
Проектиране, производство и консултации – качество, произведено в Германия
Ултразвуковите апарати на Hielscher са добре известни със своите най-високи стандарти за качество и проектиране. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Ултразвуковите апарати на Hielscher лесно се справят с тежки условия и взискателни работни среди.
Hielscher Ultrasonics е компания, сертифицирана по ISO, и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови апарати с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher са в съответствие с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.
Свържете се с нас! / Попитайте ни!
Ултразвуков апарат UIP400MTP: Подготовка на FFPE проби с висок капацитет в многоямкова плака
Често задавани въпроси
По-долу отговаряме на често задавани въпроси, свързани с подготовката на FFPE тъкани и ултразвуковата обработка на FFPE проби.
Как се подготвят FFPE тъкани?
Етапи на подготовката на FFPE тъкани: внимателното манипулиране и обработване на прясна тъкан са от решаващо значение за получаването на висококачествени FFPE проби. Запазването на клетъчната архитектура, нуклеиновите киселини и протеините е от съществено значение за точния последващ анализ. Всеки етап – от вземането до включването в парафин – изисква прецизност, за да се запази целостта на пробата за различни анализи, включително хистологично изследване, имунохистохимия и молекулярни изследвания. При правилно изпълнение този процес на фиксиране и включване в парафин гарантира, че съхранената тъкан точно отразява състоянието in vivo, което позволява надеждни диагностични и изследователски резултати.
Ще ви преведем през 6-те основни етапа на процеса на включване в парафин на FFPE тъканни проби.
- Вземане на тъкан
Биопсиите от живи бозайници и тъканните култури са подходящи източници за получаване на прясна тъкан за подготовка на FFPE проби.
Важно е да се използва асептична техника: използвайте стерилни инструменти и ръкавици, за да избегнете замърсяване. В идеалния случай вземайте тъкани в стерилна среда, например в операционна зала или под ламинарен бокс.
Тъй като образецът е много крехък, внимателното боравене с него е от съществено значение: сведете до минимум забавянията при обработката и започнете последващата обработка на тъканта веднага след изрязването. Това е от решаващо значение за предотвратяване на автолизата и разграждането. Дръжте тъканта при стайна температура; избягвайте замразяване, тъй като то може да причини образуване на ледени кристали и увреждане на тъканта. - Фиксиране на тъканта
Първо тъканта се обработва с фиксиращ разтвор: използвайте 10% неутрално буфериран формалин (NBF), който е еквивалентен на 4% формалдехид във вода, буфериран до неутрално pH.
Потопете тъканта изцяло във формалин. Осигурете обемно съотношение между фиксатора и тъканта най-малко 10:1. Времето за фиксиране обикновено е от 6 до 24 часа в зависимост от вида и размера на тъканта. Важно е фиксаторът да може да проникне изцяло в тъканта. Прекомерното фиксиране обаче може да доведе до образуване на напречни връзки, които затрудняват възстановяването на антигенността, докато недостатъчното фиксиране може да доведе до лошо запазване на тъканта. - Изрязване на тъканта
На второ място, изрежете тъканта до дебелина около 3–5 mm, за да осигурите достатъчно проникване на фиксатора. Осигурете правилна ориентация на тъканта, за да бъдат обхванати съответните хистологични структури. Това улеснява процеса на екстракция, когато тъканта по-късно се използва за анализ. - Обработка на фиксираната проба
Сега фиксираната тъкан трябва да бъде дехидратирана: след фиксиране тъканта трябва да бъде дехидратирана, за да се осигури пълно проникване на парафина. Прекарайте тъканта през серия от нарастващи концентрации на етанол (70%, 80%, 90% и 100%), за да отстраните водата.
Просветляване с ксилен: парафинът е неразтворим във вода, но е разтворим в ксилен. Следователно водата в тъканта трябва да бъде заменена с ксилен. Самият ксилен обаче е неразтворим във вода, но е разтворим в алкохол, което налага междинен етап, при който водата първо се заменя с алкохол. Потопете тъканта в ксилен или заместител на ксилена, за да отстраните етанола и да подготвите тъканта за инфилтрация с парафин.
Инфилтрация с парафин: включете тъканта в разтопен парафин, като осигурите пълна инфилтрация. Този етап обикновено включва няколко смени на парафина, за да се осигури пълно импрегниране. - Включване на тъканта в парафин
На този етап тъканта се оформя в тъканен блок: поставете тъканта във форма с желаната ориентация и я залейте с разтопен парафин. Оставете парафина да се втвърди чрез охлаждане при стайна температура или върху студена плоча. - Изготвяне и монтиране на срезове
Микротомия: за да нарежете включената в парафин тъкан, използвайте микротом за изготвяне на тънки срезове (обикновено 4–5 микрометра) от парафиновия блок. След това пробата се монтира, като срезовете се поставят върху предметни стъкла за последващо оцветяване и микроскопски анализ.
Накрая проверете качеството на хистологичния препарат: оценете първите срезове под микроскоп, за да се уверите в правилното фиксиране и обработване. Коригирайте протоколите според необходимостта въз основа на вида тъкан и наблюдаваното качество.
FFPE тъканите могат да се използват за извличане на РНК, ДНК и протеини, както и за откриване на признаци на рак или друго заболяване. Те могат да се съхраняват години наред и са съществена част от начина, по който изследователите и лекарите използват тъканни проби за диагностика и изследвания.
Какви са често срещаните проблеми и предизвикателства при FFPE тъканите?
Тъканните проби, фиксирани с формалин и включени в парафин (FFPE), се използват широко в изследванията и диагностиката, но са свързани с няколко предизвикателства и често срещани проблеми:
- Разграждане на биомолекулите: Продължителното фиксиране може да доведе до разграждане на ДНК, РНК и протеини, което затруднява екстракцията на висококачествени нуклеинови киселини или протеини за последващи приложения. Правилното фиксиране (избягване на недостатъчно и прекомерно фиксиране) е от съществено значение за запазването на тъканта.
- Маскиране на антигените: Процесът на фиксиране може да маскира антигенните участъци, намалявайки ефективността на свързването на антителата при имунохистохимия и други имунологични анализи. Това често изисква възстановяване на антигенността – процедура, чрез която маскирането на епитопа се премахва и свързването между епитопа и антитялото се възстановява. Пълната антигенност обаче може невинаги да бъде възстановена.
- Променливо качество на фиксирането: Разликите във времето и условията на фиксиране могат да доведат до непостоянно качество на пробите, което влияе върху възпроизводимостта и сравнимостта на резултатите. Използвайте надеждни протоколи за фиксиране и избягвайте недостатъчното и прекомерното фиксиране.
- Увреждане и фрагментация на ДНК: Фиксирането с формалин на FFPE проби може да причини различни видове увреждане на ДНК, включително дезаминиране на цитозина (мутации от C към T), окислително увреждане (напр. 8-oxo-guanine, водещ до мутации от G към T), както и физически нарушения, като едноверижни прекъсвания, празнини и участъци без азотна база, които възпрепятстват активността на ДНК полимеразата. Процесът на фиксиране с формалин може да причини фрагментация на ДНК, което затруднява генетичните и геномните анализи, като PCR и секвениране.
- Качество на РНК: РНК, екстрахирана от FFPE тъкани, често е фрагментирана и химически модифицирана, което затруднява извършването на висококачествени транскриптомни анализи.
- Модификации на протеините: Формалинът може да предизвика химични модификации в протеините, засягащи тяхната структура и функция, което може да попречи на протеомните анализи.
- Артефакти при обработката на пробите: По време на процеса на включване в парафин и изготвяне на срезове механичното напрежение и топлината могат да внесат артефакти и да причинят допълнително увреждане на тъканта.
- Вариабилност между партидите: Разликите в протоколите за фиксиране и включване в парафин между различните партиди могат да доведат до значителна вариабилност на резултатите, затруднявайки сравненията между проучванията.
- Проблеми при съхранението: Дългосрочното съхранение на FFPE блокове може да доведе до допълнително разграждане и загуба на целостта на нуклеиновите киселини с течение на времето, което влияе върху пригодността на архивните проби за ретроспективни проучвания.
Образуване на напречни връзки: Фиксирането с формалин причинява образуване на напречни връзки между протеините и нуклеиновите киселини, което може да затрудни молекулярния анализ и да повлияе на точността на имунохистохимията и други анализи.
Използването на оптимизирани протоколи, внимателното боравене с пробите и прилагането на усъвършенствани техники спомагат за подобряване на качеството и надеждността на данните, получени от FFPE тъкани.
Каква е разликата между FFPE и замразена тъкан?
FFPE тъканта (фиксирана с формалин и включена в парафин) се съхранява чрез използване на формалин за фиксиране на тъканта и последващо включване в парафин, което позволява дългосрочно съхранение при стайна температура при запазване на тъканната морфология. За разлика от нея, замразената тъкан се съхранява чрез бързо замразяване, което по-добре запазва целостта на нуклеиновите киселини и протеините, но изисква съхранение при много ниски температури.
Какви химикали се използват за включване в парафин при FFPE?
Химикалите, използвани за включване в парафин при FFPE, обикновено включват формалин за фиксиране и парафин за включване. При FFPE тъканите обикновено се фиксират с 10% (v/v) неутрално буфериран формалин (FA) или с прясно приготвен 4% (w/v) разтвор на формалдехид (PFA), получен от параформалдехид на прах. Формалинът, който представлява разтвор на формалдехид във вода, се буферира до неутрално pH, за да се запази тъканната морфология и да се предотврати прекомерното образуване на напречни връзки. Разтворът на основата на параформалдехид също осигурява ефективно фиксиране чрез образуване на напречни връзки между протеините, като по този начин стабилизира тъканната структура за последващо включване в парафин. Тези химикали са от съществено значение за поддържането на целостта и морфологията на тъканта по време на процеса на фиксиране и включване в парафин.
Как се отстранява парафинът от FFPE проби?
За отстраняване на парафина от FFPE проби тъканните срезове обикновено се подлагат на серия от промивания с ксилен, последвани от рехидратация през серия от намаляващи концентрации на алкохоли и накрая вода. Тъй като ксиленът е силно токсичен и създава рискове за здравето, като дихателни проблеми, кожно дразнене и потенциални дългосрочни ефекти при многократна експозиция, ултразвуковото отстраняване на парафин се утвърждава като обещаваща алтернатива в много лаборатории. Този метод използва интензивни ултразвукови вълни за ефективно и безопасно отстраняване на парафина без необходимост от токсични разтворители като ксилен, като по този начин намалява риска за лабораторния персонал и създава по-безопасна работна среда.
Колко дълго трябва да фиксирам тъканите си за добро качество на FFPE пробите?
Общите препоръки за продължителността на фиксиране обикновено предлагат тъканните проби да се фиксират във формалин за 24 до 48 часа. Тази продължителност обикновено е достатъчна за запазване на тъканната морфология и клетъчните структури, като същевременно свежда до минимум прекомерното фиксиране, което може да доведе до прекомерно образуване на напречни връзки и разграждане на нуклеиновите киселини и протеините. Оптималното време за фиксиране обаче може да варира в зависимост от размера и вида на тъканта, като по-малките или по-деликатните проби изискват по-кратко време за фиксиране. От решаващо значение е да се постигне баланс между достатъчното фиксиране за предотвратяване на автолизата и разграждането на тъканта и избягването на продължително фиксиране, което би могло да затрудни последващите молекулярни анализи.