FFPE високопроизводителна подготовка на проби: екстракция на протеини и срязване на нуклеинови киселини
С високопроизводителния ултразвуков UIP400MTP Hielscher Ultrasonics се справя с предизвикателствата на фиксирането на формалин и подготовката на тъканите с парафин (FFPE). Научете как ултразвукът обработва FFPE проба в големи количества за FFPE депарафинизация, тъканен лизис, хомогенизация, екстракция на протеини и срязване на ДНК/РНК! Възползвайте се от ултразвуковата FFPE подготовка на тъкани – Обработка на голям брой проби в многоямкови пластини! Вземете висококачествени проби и получете висок брой проби за надеждни резултати от изследванията! И не на последно място, спестете време и пари!
Подготовката на проби FFPE, улеснена от високопроизводителна соникация
Фиксирането на формалин и вграждането на парафин (FFPE) е най-често срещаният метод за запазване и архивиране на твърди тъкани. Извличането на биомолекули от тъканни проби често представлява значителни предизвикателства поради качеството на съхраняваните проби. Тези проби, които са безценни активи в молекулярната биология и клиничните изследвания, осигуряват богат източник на биологична информация за ретроспективни проучвания и диагностично валидиране на биомаркери. Въпреки това, процесът на фиксиране на формалин и вграждане на парафин, като същевременно запазва тъканната архитектура и морфология, усложнява извличането на висококачествени нуклеинови киселини и протеини. Формалинът индуцира омрежване на нуклеинови киселини и протеини, което води до молекулярна фрагментация и химични модификации. Научете как високопроизводителният ултразвуков UIP400MTP преодолява предизвикателствата на подготовката на проби FFPE!
Ултразвуков апарат за ефективна подготовка на проби FFPE
- Лесен за използване работен процес: Опростени процеси, които са лесни за използване.
- Депарафинизация, екстракция на протеини, срязване на ДНК / РНК
- Бърза обработка с висока производителност: Ефективна работа с многолункови плочи.
- Ефективна депарафинизация: Подобрена разтваряне на протеини.
- Нетоксични разтворители: Избягва използването на вредни органични разтворители като ксилол.
UIP400MTP високопроизводителен ултразвуков уред за високопроизводителна обработка на проби FFPE в многоямкови пластини
Напредък в техниките за извличане на протеини от FFPE тъкан
Hielscher Ultrasonics се справя с предизвикателствата при подготовката на проби FFPE с висока производителност. Соникацията използва ултразвукови вълни за генериране на механични вибрации и фокусирана кавитация, ефективно нарушавайки клетъчните структури и подобрявайки разтварянето на биомолекулите. Тази техника придоби популярност заради способността си да повишава ефективността и добива на екстракция на нуклеинова киселина и протеини от FFPE тъкани, както и срязване на ДНК и РНК за подготовка на библиотеката. Много е важно да се подчертае, че ултразвукът с помощта на UIP400MTP многоямков плачен ултразвук поддържа целостта на тези биомолекули за приложения надолу по веригата.
Срязване на нуклеинова киселина с помощта на високопроизводителна ултразвукова обработка
Многоямковият ултразвуков UIP400MTP за използване в условия с висока производителност извежда подготовката на FFPE проби на ново ниво. Този метод на ултразвук с многоямкови плочи осигурява ефективно и надеждно решение за едновременна обработка на множество проби. Той улеснява бързото и възпроизводимо извличане на ДНК, РНК и протеини, които са от решаващо значение за различни аналитични техники, включително секвениране от следващо поколение (NGS), количествен PCR и протеомни анализи. Оптимизирането на параметрите на ултразвука, като амплитуда, продължителност и температура, допълнително подобрява качеството и количеството на извлечените биомолекули.
UIP400MTP ултразвукораздвижителят за многоямкови плочи предлага значителни предимства за фрагментиране и срязване на ДНК и РНК от FFPE тъкан. Една от забележителните характеристики на тази система е способността й да постига тесни размери на фрагменти от ДНК и РНК, осигурявайки прецизна настройка на интензитета на ултразвука за получаване на къси фрагменти от 150-200 базови двойки (bp) или по-дълги фрагменти от 15-20 килобазни двойки (kbp). Тази гъвкавост прави UIP400MTP незаменим както за приложения за секвениране на късо, така и за дълго четене, осигурявайки висококачествени резултати за секвениране от следващо поколение (NGS) и секвениране на целия геном (WGS). Прецизният контрол върху размера на фрагмента е от решаващо значение за изследователите във всички области на геномиката, тъй като позволява да се подготвят проби според спецификациите.
Свържете се с нас за усъвършенствани решения в FFPE тъкани
Открийте UIP400MTP многоямковия плачен ултразвук за ефективно възстановяване на биомолекули от FFPE проби, поддържане на целостта на извлечените нуклеинови киселини и протеини и осигуряване на възпроизводимост на резултатите. Тази технология се интегрира безпроблемно с други препаративни и аналитични работни процеси, рационализирайки и подобрявайки молекулярните изследвания с помощта на FFPE тъканни архиви.
Фиксатори и техните ефекти
Фиксирането е решаваща стъпка в подготовката на пробата, която запазва клетъчните структури, спира биохимичните реакции и предотвратява разграждането. Използват се различни фиксатори в зависимост от специфичните експериментални изисквания. Двата най-често срещани фиксатива са формалдехид и параформалдехид, които кръстосват протеини и нуклеинови киселини, запазвайки морфологията и антигенността на клетките и тъканите. Други фиксатори, като етанол, метанол и глутаралдехид, се използват за специфични приложения.
Формалдехидните и параформалдехидните фиксатори образуват метиленови мостове между аминогрупите, което води до омрежване на протеини. Този процес ефективно обездвижва клетъчните компоненти, запазвайки тяхната цялост по време на следващите стъпки на анализ. Ефектите на тези фиксатори могат да бъдат повлияни от фактори като концентрация, рН и температура и оптимизирането на тези параметри е от решаващо значение за осигуряване на оптимално запазване на клетъчните структури.
Предимства на ултразвуковия FFPE препарат
Ултразвукът е мощна техника за разрушаване на фиксирани клетки и тъкани, която превъзхожда конвенционалните техники. Той предлага няколко забележителни предимства пред традиционните методи за лизис:
- Скорост и ефективност: Ултразвуковият лизис осигурява бързо разрушаване на клетките и тъканите, като значително намалява времето за обработка в сравнение с методите за механичен или химичен лизис. Високочестотните звукови вълни, генерирани от ултразвуковата сонда, създават механични сили на срязване, причинявайки разрушаване на фиксираните клетъчни структури. Това бързо и ефективно прекъсване позволява на изследователите да обработват големи обеми проби за кратък период от време.
- Нежен и регулируем: Ултразвуковият лизис предлага нежен механизъм за разрушаване, който минимизира увреждането на чувствителните биомолекули като протеини, нуклеинови киселини и ензими. За разлика от механичните методи, които генерират прекомерна топлина или сили на срязване, ултразвуковият лизис използва контролирана кавитация, за да разруши клетките, като същевременно запазва целостта и функционалността на вътреклетъчните компоненти.
- Гъвкавост: Ултразвуковият лизис може да се приложи към различни фиксатори, което позволява на изследователите да работят с широк спектър от фиксирани проби. Независимо дали използвате формалдехид, параформалдехид или алтернативни фиксатори, ултразвуковият лизис постоянно осигурява ефективно разрушаване, осигурявайки оптимално възстановяване на клетъчните компоненти.
- Висок добив и качество: Ултразвуковият лизис улеснява високия добив на непокътнати клетъчни компоненти поради способността си да нарушава фиксираните клетки и тъкани равномерно. Това позволява приложения надолу по веригата като анализ на протеини, екстракция на нуклеинови киселини и ензимни анализи, за да дадат надеждни и възпроизводими резултати.
- Съвместимост с автоматизация: Ултразвуковият лизис може лесно да се интегрира в автоматизирани системи, което позволява обработка на проби с висока производителност. Тази съвместимост позволява на изследователите да рационализират работния си процес и да увеличат производителността, особено в мащабни проучвания.
96-ямкови пластинчати звукови UIP400MTP за ултразвук на микротитърни и многоямкови плочи
Ултразвуковият лизис революционизира разрушаването на фиксираните клетки и тъкани, предлагайки множество предимства пред традиционните методи за лизис. Неговата скорост, ефективност, селективност, гъвкавост, висок добив и съвместимост с автоматизация го правят незаменим инструмент в молекулярната биология и биотехнологичните изследвания. Предлагайки безконтактни ултразвукови ултразвукоразведници, както и сондов тип, Hielscher Ultrasonics предлага най-подходящия ултразвуков хомогенизатор за вашето приложение в областта на науките за живота. Независимо дали искате да обработвате единични проби, няколко проби или много голям брой проби едновременно, ние ще ви предложим най-добрия ултразвукораздвижен уред, отговарящ на вашите изследователски и диагностични изисквания.
Прочетете повече за безконтактните ултразвукови уреди Hielscher за подготовка на проби с много проби и висока производителност!
- еднократна инвестиция
- Използвайте свои собствени консумативи
- без повтарящи се разходи за патентовани аксесоари и консумативи
- Висока производителност
- прецизен контрол
- Най-съвременна технология
- надеждност & Стабилност
- регулируемо, прецизно управление на процеса
- индустриален клас: може да работи непрекъснато 24/7
- лесен и безопасен за работа
- ниска поддръжка
Прочетете повече за приложенията на ултразвуковите уреди в науките за живота!
Пластинчатият ултразвук UIP400MTP за всякакви 96-ямкови плочи, микротитърни плочи и многоямкови плочи.
Проектиране, производство и консултиране – Качество, произведено в Германия
Ултразвуковите апарати Hielscher са добре известни със своите най-високи стандарти за качество и дизайн. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Тежките условия и взискателните условия се справят лесно с ултразвуковите апарати на Hielscher.
Hielscher Ultrasonics е сертифицирана по ISO компания и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови уреди, отличаващи се с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher са съвместими с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.
Свържете се с нас! / Попитайте ни!
UIP400MTP Ултразвук: Подготовка на проби с висока производителност FFPE в Multi-Well-Plate
ЧЗВ
По-долу отговаряме на често задавани въпроси, които се отнасят до подготовката на тъкани FFPE и ултразвука на FFPE проби.
Как се приготвя FFPE тъкан?
Стъпки за подготовка на FFPE тъкани: Щателното боравене и обработка на прясна тъкан са от решаващо значение за генерирането на висококачествени FFPE проби. Осигуряването на запазването на клетъчната архитектура, нуклеиновите киселини и протеините е от съществено значение за точния анализ надолу по веригата. Всяка стъпка - от събирането до вграждането - изисква прецизност, за да се поддържа целостта на пробата за различни анализи, включително хистологично изследване, имунохистохимия и молекулярни изследвания. Правилно изпълнен, този процес на фиксиране и вграждане гарантира, че запазената тъкан отразява точно състоянието in vivo, което позволява надеждни резултати от диагностиката и изследванията.
Превеждаме ви през 6-те основни стъпки от процеса на вграждане на FFPE тъканни проби.
- Събиране на тъкани
Биопсиите от живи бозайници и тъканни култури са жизнеспособни източници за получаване на прясна тъкан за подготовка на FFPE проба.
Важно е да използвате асептична техника: Използвайте стерилни инструменти и ръкавици, за да избегнете замърсяване. В идеалния случай събирайте тъкани в стерилна среда, като хирургически пакет или ламинарен качулка.
Тъй като образецът е много крехък, чувствителното му боравене е от съществено значение: Минимизирайте забавянията в обработката и незабавно започнете последващата обработка на тъканите след изрязването. Това е от решаващо значение за предотвратяване на автолиза и разграждане. Поддържайте тъканта на стайна температура; Избягвайте замръзване, тъй като може да причини образуване на ледени кристали и увреждане на тъканите. - Фиксиране на тъкани
Първо, тъканта се третира с фиксиращ разтвор: Използва се 10% неутрално буфериран формалин (NBF), който е еквивалентен на 4% формалдехид във вода, буфериран до неутрално pH.
Потопете тъканта напълно във формалин. Осигурете съотношение на обема на фиксатора към тъканта най-малко 10:1. Времето за фиксиране обикновено варира от 6 до 24 часа, в зависимост от вида и размера на тъканта. Важно е фиксаторът да може да проникне добре в тъканта. Свръхфиксацията обаче може да доведе до кръстосано свързване, което усложнява извличането на антигени, докато недостатъчната фиксация може да доведе до лошо запазване на тъканите. - Подрязване на тъкани
Второ, отрежете тъканта до дебелина около 3-5 мм, за да позволите адекватно проникване на фиксатора. Осигурете правилна ориентация на тъканта за улавяне на съответните хистологични структури. Това улеснява процеса на екстракция, когато тъканта по-късно се използва за анализ. - Обработка на фиксираната проба
Сега фиксираната тъкан трябва да бъде дехидратирана: След фиксирането тъканта трябва да бъде дехидратирана, за да се осигури пълно проникване от парафиновия восък. Прекарайте тъканта през степенувана серия от етанол (70%, 80%, 90% и 100%), за да отстраните водата.
Изчистване с ксилол: Парафиновият восък е неразтворим във вода, но разтворим в ксилол. Следователно водата в тъканта трябва да бъде заменена с ксилол. Самият ксилол обаче е неразтворим във вода, но разтворим в алкохол, което налага междинна стъпка, при която водата първо се заменя с алкохол. Потопете тъканта в ксилол или заместител на ксилола, за да премахнете етанола и да подготвите тъканта за парафинова инфилтрация.
Инфилтрация с помощта на парафин: Вградете тъканта в разтопен парафинов восък, осигурявайки пълна инфилтрация. Тази стъпка обикновено включва няколко смени на парафина, за да се осигури цялостно импрегниране. - Вграждане на тъканта
В тази стъпка тъканта се оформя в тъканен блок: Поставете тъканта във форма с желаната ориентация и я залейте с разтопен парафин. Оставете парафина да се втвърди чрез охлаждане при стайна температура или върху студена чиния. - Секциониране и монтаж
Микротомия: За да нарежете вградената тъкан, използвайте микротом, за да изрежете тънки участъци (обикновено 4-5 микрометра) от парафиновия блок. След това пробата се монтира, като секциите се поставят върху стъклени предметни стъкла за последващо оцветяване и микроскопски анализ.
Накрая проверете качеството на хистологията: Оценете първите секции под микроскоп, за да осигурите правилно фиксиране и обработка. Коригирайте протоколите, ако е необходимо, въз основа на типа тъкан и наблюдаваното качество.
FFPE тъканите могат да се използват за възстановяване на РНК, ДНК и протеини, както и за откриване на признаци на рак или друго заболяване. Те могат да се съхраняват с години и са съществена част от начина, по който изследователите и лекарите използват тъканни проби за диагностика и изследвания.
Какви са често срещаните проблеми и предизвикателства с FFPE тъканта?
Фиксираните с формалин, вградени в парафин (FFPE) тъканни проби се използват широко в изследванията и диагностиката, но те представляват няколко предизвикателства и често срещани проблеми:
- Разграждане на биомолекули: Продължителната фиксация може да доведе до разграждане на ДНК, РНК и протеини, което затруднява извличането на висококачествени нуклеинови киселини или протеини за приложения надолу по веригата. Правилната фиксация (избягване на недостатъчна и свръхфиксация) е от съществено значение за запазването на тъканите.
- Антигенно маскиране: Процесът на фиксиране може да маскира антигенни места, намалявайки ефективността на свързването на антитела в имунохистохимията и други имунологични анализи. Това често изисква извличане на антиген, процедура, чрез която маскирането на епитопа се обръща и свързването на епитопа с антитела се възстановява. Въпреки това, пълната антигенност не винаги може да бъде възстановена.
- Променливо качество на фиксиране: Разликите във времето и условията на фиксиране могат да доведат до непостоянно качество на пробата, което се отразява на възпроизводимостта и съпоставимостта на резултатите. Използвайте надеждни протоколи за фиксиране и избягвайте недостатъчна и прекомерна фиксация.
- Увреждане и фрагментация на ДНК: Фиксирането на формалин на FFPE проби може да причини различни видове увреждане на ДНК, включително дезаминиране на цитозин (C до T мутации), оксидативно увреждане (напр. 8-оксо-гуанин, водещ до мутации от G към T), както и физически смущения като прорези, пропуски и аосновни места, които възпрепятстват активността на ДНК полимеразата. Процесът на фиксиране на формалин може да причини фрагментация на ДНК, усложнявайки генетични и геномни анализи като PCR и секвениране.
- Качество на РНК: РНК, извлечена от тъканите на FFPE, често е фрагментирана и химически модифицирана, което затруднява извършването на висококачествени транскриптомни анализи.
- Протеинови модификации: Формалинът може да индуцира химични модификации в протеините, засягайки тяхната структура и функция, което може да попречи на протеомните анализи.
- Артефакти за обработка на проби: По време на процеса на вграждане и секциониране, механичното напрежение и топлината могат да внесат артефакти и да причинят допълнително увреждане на тъканта.
- Променливост от партида до партида: Вариациите в протоколите за фиксиране и вграждане между различните партиди могат да доведат до значителна вариабилност в резултатите, усложнявайки сравненията между проучванията.
- Проблеми със съхранението: Дългосрочното съхранение на FFPE блокове може да доведе до допълнително разграждане и загуба на целостта на нуклеиновата киселина с течение на времето, което оказва влияние върху жизнеспособността на архивните проби за ретроспективни изследвания.
Омрежване: Фиксирането на формалин причинява кръстосано свързване на протеини и нуклеинови киселини, което може да попречи на молекулярния анализ и да повлияе на точността на имунохистохимията и други анализи.
Използването на оптимизирани протоколи, внимателната обработка на пробите и прилагането на усъвършенствани техники помагат за подобряване на качеството и надеждността на данните, получени от FFPE тъкани.
Каква е разликата между FFPE и замразена тъкан?
FFPE (формалин-фиксирана, парафин-вградена) тъкан се запазва с помощта на формалин за фиксиране на тъканта и след това се вгражда в парафинов восък, което позволява дългосрочно съхранение при стайна температура, като същевременно се запазва морфологията на тъканта. За разлика от тях, замразената тъкан бързо се запазва чрез замразяване, което по-добре поддържа целостта на нуклеиновите киселини и протеини, но изисква съхранение при много ниски температури.
Какви химикали се използват за вграждане на FFPE?
Химикалите, използвани за вграждане на FFPE, обикновено включват формалин за фиксиране и парафинов восък за вграждане. За вграждане на FFPE тъканите обикновено се фиксират с помощта на 10% (v/v) неутрален буфериран формалин (FA) или прясно приготвен 4% (w/v) разтвор на формалдехид (PFA), направен от параформалдехид на прах. Формалинът, който е разтвор на формалдехид във вода, се буферира до неутрално рН, за да се запази морфологията на тъканите и да се предотврати прекомерното омрежване. Разтворът на основата на параформалдехид също така осигурява ефективно фиксиране чрез омрежващи протеини, като по този начин стабилизира тъканната структура за последващо вграждане в парафинов восък. Тези химикали са от съществено значение за поддържане на целостта и морфологията на тъканите по време на процеса на фиксиране и вграждане.
Как се отстранява парафинът от пробите FFPE?
За да се премахне парафинът от пробите от FFPE, тъканните участъци обикновено се подлагат на серия от промивания с ксилол, последвани от рехидратация чрез степенувана серия от алкохоли и накрая вода. Тъй като ксилолът е силно токсичен, създавайки рискове за здравето като дихателни проблеми, дразнене на кожата и потенциални дългосрочни ефекти при многократно излагане, ултразвуковото отстраняване на парафин се очертава като обещаваща алтернатива в много лаборатории. Този метод използва интензивни ултразвукови вълни за ефективно и безопасно отстраняване на парафина без необходимост от токсични разтворители като ксилол, като по този начин намалява риска за лабораторния персонал и създава по-безопасна работна среда.
Колко дълго трябва да фиксирам тъканите си за добро качество на FFPE пробата?
Общите препоръки за продължителност на фиксирането обикновено предполагат фиксиране на тъканни проби във формалин за 24 до 48 часа. Тази продължителност обикновено е достатъчна, за да се запази морфологията на тъканите и клетъчните структури, като същевременно се минимизира свръхфиксацията, което може да доведе до прекомерно омрежване и разграждане на нуклеинови киселини и протеини. Оптималното време за фиксиране обаче може да варира в зависимост от размера и вида на тъканта, като по-малките или по-деликатни проби изискват по-кратко време за фиксиране. От решаващо значение е да се балансира адекватната фиксация, за да се предотврати автолиза и разграждане на тъканите, като същевременно се избягва продължителна фиксация, която може да усложни молекулярните анализи надолу по веригата.