Ултразвукова подготовка на проби с помощта на филтър (FASP): подобряване на работните процеси в областта на протеомиката с усъвършенствана соникация

Ултразвуковата филтърна подготовка на пробите (FASP) се превръща във високоефективен и възпроизводим метод в съвременната протеомика. Чрез интегриране на контролирана соникация в установените работни процеси на FASP изследователите могат значително да подобрят екстракцията на протеини, ефективността на разграждането и цялостното качество на данните. С нарастващото търсене на високопроизводителна и възпроизводима подготовка на пробите, фокусираните сонатори, като микропластинковия сонатор UIP400MTP, придобиват научна и практическа значимост.

Научен контекст: Защо FASP има значение за протеомиката

Подготовката на проби с помощта на филтър (FASP) се превърна в златен стандарт в протеомиката отдолу нагоре поради способността си да отстранява детергенти, соли и други замърсители, като същевременно позволява ефективно ензимно разграждане. Класическите протоколи за FASP обаче често се сблъскват с ограничения, свързани с непълно лизиране, непоследователно смилане и променливост на пробите. – особено когато става въпрос за сложни или устойчиви биологични клетки или тъкани.
Именно тук фокусираната ултразвукова енергия (сониране) осигурява решаващо предимство. Чрез въвеждане на механични сили на срязване и кавитация сонирането подобрява множество критични стъпки в работния процес на FASP, без да се нарушава целостта на протеините.

Положителните ефекти на соникацията при ултразвуковата FASP

Соникацията въвежда контролирана акустична кавитация – образуване и разпадане на микроскопични мехурчета – което поражда локални сили на срязване и микропоток.
Соникацията подобрява както етапите на алкилиране, така и на разграждане в ултразвуковата FASP, като подобрява масовия трансфер и ускорява кинетиката на реакцията. Прилагането на ултразвукова енергия генерира кавитация, което води до локализиран микропоток и преходни сили на срязване, които насърчават бързото смесване и ефективното проникване на реагентите в протеиновата матрица или филтърната среда. По време на алкилирането това води до по-равномерно и по-бързо модифициране на цистеиновите остатъци с йодоацетамид. В етапа на разграждане сонирането увеличава достъпността на местата за протеолитично разцепване и подобрява взаимодействията между ензим и субстрат, като по този начин ускорява активността на трипсина и повишава ефективността на разграждането. Като цяло обработката с ултразвук намалява времето за обработка, като същевременно запазва или подобрява пълнотата и възпроизводимостта на реакцията.

При подготовката на проби за протеомика ултразвуковият FASP се превръща в:

• По-ефективно разрушаване на клетките и извличане на протеини, дори в трудни тъкани или микробни проби
• Подобрено разтваряне на протеините
• Подобрена достъпност на ензимите по време на храносмилането
• Намалено време за обработка и повишена възпроизводимост

За разлика от конвенционалните механични или химични методи за лизис, обработката с ултразвук е силно контролируема и мащабируема, което я прави особено подходяща за стандартизирани работни процеси в областта на протеомиката.

Предимства на ултразвуковата FASP пред конвенционалните подходи

Интегрирането на сонирането в протоколите на FASP осигурява измерими ползи, които пряко влияят върху резултатите от масспектрометрията надолу по веригата.
Ултразвуковият FASP позволява по-пълно възстановяване на протеини, особено от трудни проби като влакнести тъкани или биофилми. Равномерното разпределение на енергията осигурява последователно третиране на всички повторения, като намалява променливостта. – съществено изискване за количествената протеомика.
Освен това соникацията ускорява кинетиката на храносмилане, като подобрява взаимодействието между ензима и субстрата. Това често води до по-кратко време за смилане и по-висок добив на пептиди, като същевременно се запазва покритието на последователността.
От гледна точка на работния процес ултразвуковите системи намаляват ръчната намеса и премахват необходимостта от агресивна химическа обработка, като запазват целостта на пробата и опростяват стандартизирането на протокола.

Диаграма на Вен, показваща увеличения брой идентифицирани протеини чрез ултразвукова FASP в сравнение с FASP през нощта
Изображение и проучване: ©Carvalho et al., 2020

Протокол: Високопроизводителна ултразвукова FASP с UIP400MTP

За лабораториите, които обработват големи групи проби, сонаторът за микроплатки UIP400MTP позволява едновременно сониране на стандартни многоямкови плаки (напр. 96-ямкови плаки), което значително увеличава производителността и възпроизводимостта.
В този формат пробите (обикновено 50-200 µl на ямка) се приготвят директно в микроплаки, съвместими с ултрафилтрация или обработка надолу по веригата. Буферите за лизис са подобни на тези, използвани в стандартните протоколи на FASP.

UIP400MTP прилага равномерна ултразвукова енергия във всички кладенци. Обикновено соникацията се извършва при 60-80% амплитуда в продължение на 2-4 минути, в зависимост от вида на пробата. Наблюдавайте температурата с помощта на включван температурен сензор. Използване на импулсна соникация и по желание на лабораторен охладител.

Примерен протокол:

1. За етапа на алкилиране пробите се сонират с помощта на сонатор за микроплатки (UIP400MTP) при 40% амплитуда за 7 цикъла (30 s ON, 15 s OFF; общо време за сониране: 5 min 45 s).
2. След соникация разтворът на йодоацетамид (IAA) се отстранява чрез центрофугиране. Преди смилането с трипсин пробите трябва да се промият, за да се отстрани остатъчната урея - силен хаотропен агент, който потиска ензимната активност. Затова пробите се промиват два пъти с 200 μl 25 mM амониев бикарбонат (AmBic).
3. Впоследствие се добавят 100 μl разтвор на трипсин (съотношение 1:30 ензим/протеин), приготвен в 12,5 mM амониев бикарбонат. След това се извършва смилане на протеините с помощта на UIP400MTP при същите условия на сониране (40% амплитуда, 7 цикъла, 30 s ON / 15 s OFF; общо време: 5 min 45 s).
4. След сониране пробите се прехвърлят във филтърни плаки или се обработват с помощта на системи за FASP, базирани на плаки. Стъпките на редуциране и алкилиране се извършват в плаката, като се поддържа рационализиран работен процес.
5. Трипсиновото разграждане се извършва при контролирани условия (напр. 37°C, 4-16 часа), с възможност за кратка ултразвукова стимулация за ускоряване на ензимната активност и подобряване на пептидния добив.
6. Пептидите се възстановяват чрез центрофугиране и са готови за LC-MS/MS анализ.

Ключовото предимство на тази система се състои в способността ѝ да осигурява идентични условия на обработка във всички ямки, като свежда до минимум ефектите от партидите и позволява надеждни количествени сравнения при широкомащабни протеомични изследвания.

Проектиране, производство и консултиране – Качество, произведено в Германия

Ултразвуковите апарати Hielscher са добре известни със своите най-високи стандарти за качество и дизайн. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Тежките условия и взискателните условия се справят лесно с ултразвуковите апарати на Hielscher.

Hielscher Ultrasonics е сертифицирана по ISO компания и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови уреди, отличаващи се с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher са съвместими с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.

Литература / Препратки