Ултразвукова подготовка на проби с помощта на филтър (FASP): усъвършенстване на протеомните работни процеси чрез усъвършенствана ултразвукова обработка

Ултразвуковата подготовка на проби с помощта на филтър (FASP) се утвърждава като високоефективен и възпроизводим метод в съвременната протеомика. Чрез интегриране на контролирана ултразвукова обработка в установените работни процеси за FASP изследователите могат значително да подобрят извличането на протеини, ефективността на ензимното разграждане и цялостното качество на данните. С нарастващото търсене на подготовка на проби с висок капацитет и възпроизводимост апаратите за фокусирана ултразвукова обработка, като ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP, придобиват все по-голямо научно и практическо значение.

Научен контекст: защо FASP е важна за протеомиката

Подготовката на проби с помощта на филтър (FASP) се е превърнала в златен стандарт в протеомиката „отдолу нагоре“ благодарение на способността си да отстранява детергенти, соли и други замърсители, като същевременно позволява ефективно ензимно разграждане. Класическите протоколи за FASP обаче често срещат ограничения, свързани с непълен лизис, непостоянно ензимно разграждане и вариабилност на пробите – особено при работа със сложни или устойчиви биологични клетки или тъкани.
Именно тук фокусираната ултразвукова енергия (ултразвуковата обработка) осигурява решаващо предимство. Чрез създаване на механични сили на срязване и кавитация ултразвуковата обработка подобрява множество критични етапи в работния процес за FASP, без да нарушава целостта на протеините.

Положителните ефекти на ултразвуковата обработка при ултразвукова FASP

Ултразвуковата обработка създава контролирана акустична кавитация – образуване и колапс на микроскопични мехурчета – която генерира локализирани сили на срязване и микропотоци.
Ултразвуковата обработка подобрява както етапа на алкилиране, така и етапа на ензимно разграждане при ултразвуковата FASP, като подобрява масопреноса и ускорява кинетиката на реакциите. Прилагането на ултразвукова енергия генерира кавитация, която води до локализирани микропотоци и краткотрайни сили на срязване, подпомагащи бързото смесване и ефективното проникване на реагентите в протеиновата матрица или във филтърната среда. При алкилирането това води до по-равномерна и по-бърза модификация на цистеиновите остатъци с йодоацетамид. На етапа на ензимно разграждане ултразвуковата обработка увеличава достъпността на местата за протеолитично разцепване и подобрява взаимодействията ензим–субстрат, като по този начин ускорява действието на трипсина и повишава ефективността на разграждането. Като цяло ултразвуковата обработка намалява времето за обработка, като същевременно запазва или подобрява пълнотата и възпроизводимостта на реакциите.

При подготовката на проби за протеомика ултразвуковата FASP води до:

• По-ефективно разрушаване на клетките и извличане на протеини дори в устойчиви тъкани или микробни проби
• Подобрена солюбилизация на протеините
• Подобрен достъп на ензимите по време на разграждането
• Намалено време за обработка и повишена възпроизводимост

За разлика от конвенционалните механични или химични методи за лизис, ултразвуковата обработка позволява висока степен на контрол и мащабиране, което я прави особено подходяща за стандартизирани работни процеси в протеомиката.

Предимства на ултразвуковата FASP пред конвенционалните подходи

Интегрирането на ултразвукова обработка в протоколите за FASP осигурява измерими ползи, които пряко влияят върху резултатите от последващата масспектрометрия.
Ултразвуковата FASP позволява по-пълно извличане на протеините, особено от трудни за обработка проби като фиброзни тъкани или биофилми. Равномерното разпределение на енергията осигурява еднаква обработка на повторенията и намалява вариабилността – съществено изискване за количествената протеомика.
Освен това ултразвуковата обработка ускорява кинетиката на ензимното разграждане, като подобрява взаимодействието ензим–субстрат. Това често води до по-кратко време за разграждане и по-висок добив на пептиди, като същевременно се запазва покритието на аминокиселинните последователности.
От гледна точка на работния процес ултразвуковите системи намаляват ръчната намеса и премахват необходимостта от агресивни химични обработки, като запазват целостта на пробите и улесняват стандартизирането на протоколите.

Диаграма на Вен, показваща увеличения брой идентифицирани протеини чрез ултразвукова FASP в сравнение с FASP с инкубация през нощта
Изображение и изследване: ©Carvalho et al., 2020

Протокол: ултразвукова FASP с висок капацитет за обработка на проби с UIP400MTP

За лаборатории, които обработват големи групи проби, ултразвуковият апарат за микроплаки UIP400MTP позволява едновременна ултразвукова обработка на стандартни многоямкови плаки (напр. 96-ямкови плаки), като значително увеличава капацитета за обработка на проби и възпроизводимостта.
При този формат пробите (обикновено 50–200 µL на ямка) се подготвят директно в микроплаки, съвместими с ултрафилтрация или последваща обработка. Буферите за лизис са подобни на използваните в стандартните протоколи за FASP.

UIP400MTP прилага равномерна ултразвукова енергия във всички ямки. Ултразвуковата обработка обикновено се извършва при амплитуда 60–80% за 2–4 минути в зависимост от вида на пробата. Следете температурата с помощта на температурния сензор, който се включва към апарата. Използвайте импулсна ултразвукова обработка и по желание лабораторен охладител.

Примерен протокол:

1. За етапа на алкилиране пробите се обработват ултразвуково с ултразвуковия апарат за микроплаки (UIP400MTP) при 40% амплитуда за 7 цикъла (30 s включено, 15 s изключено; общо време на ултразвукова обработка: 5 min 45 s).
2. След ултразвуковата обработка разтворът на йодоацетамид (IAA) се отстранява чрез центрофугиране. Преди разграждането с трипсин пробите трябва да бъдат промити, за да се отстрани остатъчната урея – силен хаотропен агент, който инхибира ензимната активност. Затова пробите се промиват два пъти с 200 μL 25 mM амониев бикарбонат (AmBic).
3. След това се добавят 100 μL разтвор на трипсин (съотношение ензим към протеин 1:30), приготвен в 12,5 mM амониев бикарбонат. Разграждането на протеините се извършва с UIP400MTP при същите условия на ултразвукова обработка (40% амплитуда, 7 цикъла, 30 s включено / 15 s изключено; общо време: 5 min 45 s).
4. След ултразвуковата обработка пробите се прехвърлят във филтърни плаки или се обработват със системи за FASP, базирани на плаки. Етапите на редукция и алкилиране се извършват в плаката, като се поддържа оптимизиран работен процес.
5. Разграждането с трипсин се извършва при контролирани условия (напр. 37°C, 4–16 часа), с възможност за кратка ултразвукова стимулация за ускоряване на ензимната активност и подобряване на добива на пептиди.
6. Пептидите се извличат чрез центрофугиране и са готови за LC-MS/MS анализ.

Основното предимство на тази система е способността ѝ да осигурява идентични условия на обработка във всички ямки, като свежда до минимум ефектите, дължащи се на различия между партидите, и позволява надеждни количествени сравнения в мащабни протеомни изследвания.

Проектиране, производство и консултации – качество, произведено в Германия

Ултразвуковите апарати Hielscher са добре известни с най-високото си качество и стандарти на проектиране. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени инсталации. Ултразвуковите апарати Hielscher лесно се справят с тежки условия и взискателни среди.

Hielscher Ultrasonics е компания, сертифицирана по ISO, и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови апарати, отличаващи се с най-съвременни технологии и удобство при работа. Разбира се, ултразвуковите апарати Hielscher отговарят на изискванията за CE и на изискванията на UL, CSA и RoHs.

Литература / източници

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).