Протеомни работни процеси с високопроизводително разграждане на белтъци

Протеомиката е съществена област за разбирането на биологичните процеси и системи, като разграждането на белтъци представлява критична стъпка в нейните работни процеси. Традиционно разграждането на белтъци се извършва в разтвор с помощта на протеолитични ензими като трипсин, който специфично хидролизира пептидните връзки при лизиновите и аргининовите остатъци. Този процес генерира пептиди, подходящи за йонизация и фрагментация при приложения в масспектрометрията (MS). Конвенционалните методи за разграждане обаче изискват 12–24 часа за завършване, което създава значителни затруднения в протеомните работни процеси.
Ултразвуковата обработка предлага мощна алтернатива, като драстично съкращава времето за разграждане от часове до само няколко минути. В съчетание с усъвършенствани ултразвукови устройства за обработка на множество проби, като Hielscher CupHorn, VialTweeter и ултразвуковото устройство за 96-ямкови плаки UIP400MTP, ултразвуковата обработка позволява ускорена, високопроизводителна протеомика. Тези технологии оптимизират работните процеси, като намаляват времето за подготовка на пробите и повишават ефективността, без да компрометират възпроизводимостта или качеството на данните.

Ролята на ултразвуковата енергия при разграждането на белтъци

Ултразвуковата обработка използва фокусирани ултразвукови вълни за създаване на кавитация – локализирани микромехурчета, които колапсират и генерират интензивни сили на срязване. Това явление подобрява масопреноса, подпомага смесването на ензимите със субстратите и разгъва белтъчните структури, като разкрива местата за разцепване пред протеолитични ензими като трипсин.
Резултатът? Значително намаляване на времето за разграждане, без да се компрометира ефективността или възпроизводимостта.

Протеолитично разграждане, усилено чрез ултразвук: методология и резултати

Протокол за ускорено разграждане

Разграждането с помощта на ултразвук съчетава протеолитични ензими и ултразвукова енергия за ускоряване на работните процеси. Например при използване на Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) работният процес за разграждане протича по следния начин:

1. Редукция: Белтъчните проби (0,5 mg/mL, 20 µL) се третират с DTT (2 µL, 110 mM) в буфер с амониев бикарбонат (12,5 mM). Прилага се ултразвукова обработка при 50% амплитуда в продължение на 5 минути.
2. Алкилиране: След добавяне на IAA (2 µL, 400 mM) ултразвуковата обработка се повтаря при същите условия.
3. Разграждане: Пробите се разреждат и се инкубират с наночастици с имобилизиран трипсин. Последен цикъл на ултразвукова обработка (5 минути) завършва разграждането. Пептидите се отделят, изсушават и съхраняват за MS анализ.

Този ултразвуков метод намалява общото време за подготовка от 12 часа до под 30 минути. Въпреки ускорения процес добивът и качеството на пептидите остават съпоставими с тези при традиционните методи с инкубация през нощта.

Ефективност на ултразвуковото разграждане на белтъци

При сравнителни изследвания с протеоми на E. coli:

• Идентифициране на белтъци: В ултразвуково разградените проби са идентифицирани 777 белтъка за 5 минути в сравнение с 817 за 12 часа. Делът на белтъците, идентифицирани и с двата метода, надхвърля 70%.
• Възпроизводимост: Повторните анализи показват стойности на корелацията над 98% в рамките на всеки метод, което демонстрира надеждност.
• Селективност: Всеки метод разгражда преимуществено определени белтъци, като ултразвуковото разграждане благоприятства 65 белтъка, а разграждането през нощта – 54 белтъка. Тези фини различия подчертават уникалния потенциал на ултразвуковата обработка за специфични приложения.

Резултати от количественото определяне без маркиране на седем белтъка, добавени към
проба от E. coli. Следните белтъци са добавени на две различни нива, както е посочено в колоната
с наименование „Theo Ratio“. Theo Ratio е теоретичното съотношение между двете нива, използвани в този
експеримент. Говежди серумен албумин (ALBU), β-лактоглобулин (LACB), α-S1 казеин (CASA1),
α-S2 казеин (CASA2), цитохром c (CYC), овалбумин (OVAL) и карбоанхидраза 2
(CAH2). Съотношенията са изчислени с помощта на LFQ интензитетите на белтъците, получени при анализ с MaxQuant.
За сравнение на стойностите, получени с всеки метод, е приложен t-тестът на Стюдънт (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Изследване и графика: © Martins et al., 2019)

Трипсин, имобилизиран върху наночастици

Съчетаването на наночастици с имобилизиран трипсин (напр. T-FMNPs) с ултразвукова обработка допълнително подобрява протеомните работни процеси. Тези наночастици осигуряват голяма повърхност за взаимодействията между ензимите и субстратите, като повишават ефективността. При прилагане към сложни протеоми, като този на E. coli, комбинираният метод постига:

• Бързина: Пълно разграждане в рамките на 5 минути.
• Точност: Количествено определяне на белтъци, съпоставимо с това при традиционните методи (p > 0,01, n=3).
• Мащабируемост: Адаптирането към многоямкови платформи като UIP400MTP позволява обработка с висок капацитет за обработка на проби.

Щракнете тук за подробния протокол с инструкции стъпка по стъпка!
(срв. Martins et al., 2019)

Протеолитично разграждане с висока скорост и висок капацитет за обработка на проби с ултразвукови устройства Hielscher

Най-добрите модели ултразвукови устройства за протеомика

Hielscher Ultrasonics предлага различни модели ултразвукови устройства за едновременна подготовка на множество проби, които улесняват работните процеси с висок капацитет за обработка на проби. Независимо дали работите с флакони, епруветки, многоямкови плаки (напр. плаки с 6, 24 или 96 ямки) или петриеви панички – предлагаме ви идеалните ултразвукови устройства за вашите експерименти.

Ултразвуково устройство за многоямкови плаки UIP400MTP

За максимален капацитет за обработка на проби UIP400MTP предоставя възможност за ултразвукова обработка на 96-ямкови плаки. Съвместим с всяка стандартна микроплака, UIP400MTP не изисква скъпи фирмени консумативи за еднократна употреба и ви дава свободата да изберете най-добрата многоямкова плака за вашето изследване. Чрез равномерно подаване на енергия по цялата плака той позволява бърза редукция, алкилиране и разграждане на до 200 сложни протеома само за 1 час. Това ниво на автоматизация и ефективност е от решаващо значение за високопроизводителната протеомика и клиничните приложения. Научете повече за ултразвуковото устройство за многоямкови плаки!

VialTweeter

VialTweeter е предназначен за лаборатории, които се нуждаят от едновременна ултразвукова обработка на до 10 флакона или епруветки. Неговият неинвазивен подход елиминира рисковете от кръстосано замърсяване, като същевременно осигурява възпроизводимо разграждане на белтъци. Това устройство е идеално за изследователи, работещи с ограничени обеми на пробите или с разнообразни типове проби.
Научете повече за ултразвуковото устройство за множество епруветки VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Ултразвуковото устройство CupHorn е мощно устройство, предназначено за едновременна обработка на множество проби в запечатани съдове. То осигурява равномерно разпределение на ултразвуковата енергия и прецизен контрол на температурата. Възможността за едновременна обработка на до пет проби, съчетана със съвместимостта му с работни процеси, включващи редукция, алкилиране и разграждане, прави CupHorn надежден инструмент за протеомика, базирана на MS.
Научете повече за сонореактора CupHorn!

Протокол стъпка по стъпка за протеолитично разграждане с помощта на ултразвукова обработка и трипсин, имобилизиран върху наночастици

Този протокол на Martins et al. (2019) е оптимизиран за бързо разграждане на белтъци с помощта на ултразвукова енергия и трипсин, имобилизиран върху наночастици (T-FMNPs). Описаните стъпки осигуряват ефективна редукция, алкилиране и протеолиза, подходящи за приложения в масспектрометрията (MS).
Стъпки на протокола

1. Редукция на дисулфидните връзки
   • Добавете 2 µL разтвор на DTT (110 mM) към белтъчната проба с обем 20 µL (0,5 mg/mL) в буфер AmBic.
   • Поставете епруветката с пробата в сонореактора UP200St-CupHorn.
   • Обработете пробата с ултразвук в продължение на 2,5 минути при 50% амплитуда (200 W, 26 kHz).
   • Направете кратка пауза, за да позволите охлаждане, след което обработете с ултразвук още 2,5 минути при същите условия.
2. Алкилиране на редуцираните цистеинови остатъци
   • Добавете 2 µL разтвор на IAA (400 mM) към редуцираната белтъчна проба.
   • Обработете с ултразвук в продължение на 2,5 минути при 50% амплитуда, за да подпомогнете алкилирането.
   • Направете пауза за охлаждане, след което обработете с ултразвук още 2,5 минути.

   Забележка: Сведете до минимум излагането на алкилираната проба на светлина, за да предотвратите разграждането на IAA.

3. Разреждане на пробата
   • Разредете алкилираната белтъчна проба до краен обем от 100 µL с помощта на 25 mM буфер AmBic, съдържащ 4% ацетонитрил (v/v).
   • Разбъркайте добре чрез внимателно пипетиране.
4. Протеолитично разграждане с трипсин, имобилизиран върху наночастици
   • Добавете 20 µL разтвор на T-FMNP (3 mg/mL) към разредената белтъчна проба.
   • Обработете сместа с ултразвук в сонореактора в продължение на 2,5 минути при 50% амплитуда.
   • Направете пауза за охлаждане, след което обработете с ултразвук още 2,5 минути при същите условия.
5. Отделяне на наночастиците с трипсин
   • Използвайте магнит, за да отделите T-FMNPs от супернатанта, съдържащ пептиди, получени при разграждането.
   • Прехвърлете супернатанта в нова микроцентрофужна епруветка.
6. Подготовка на пептидите за MS анализ
   • Изсушете супернатанта, съдържащ пептиди, във вакуумна центрофуга.
   • Съхранявайте изсушените пептиди при -20°C до последващ анализ чрез масспектрометрия.