Протеомни работни процеси с високопроизводително разграждане на протеини

Протеомиката е основна област за разбиране на биологичните процеси и системи, като храносмилането на протеини е критична стъпка в нейните работни процеси. Традиционно разграждането на протеини се извършва в разтвор с помощта на протеолитични ензими като трипсин, който специфично хидролизира пептидните връзки при остатъци от лизин и аргинин. Този процес генерира пептиди, подходящи за йонизация и фрагментация в приложения на масспектрометрия (MS). Конвенционалните методи за храносмилане обаче изискват 12-24 часа, за да постигнат завършване, създавайки значителни затруднения в протеомните работни процеси.
Ултразвукът предлага мощна алтернатива, която драстично съкращава времето за храносмилане от часове до само няколко минути. Когато се комбинира с усъвършенствани ултразвукоизатори с множество проби като Hielscher CupHorn, VialTweeter и 96-ямковия пластинчатия ултразвук UIP400MTP, ултразвукът позволява ускорена протеомика с висока производителност. Тези технологии рационализират работните процеси, намалявайки времето за подготовка на пробите и повишавайки ефективността, без да правят компромис с възпроизводимостта или качеството на данните.

Ролята на ултразвуковата енергия в храносмилането на протеини

Ултразвукът използва фокусирани ултразвукови вълни, за да създаде кавитация - локализирани микромехурчета, които се свиват, за да генерират интензивни сили на срязване. Това явление засилва масовия трансфер, насърчава смесването на ензими със субстрати и разгръща протеиновите структури, излагайки местата на разцепване на протеолитични ензими като трипсин.
Резултатът? Значително намаляване на времето за храносмилане без компромис с ефективността или възпроизводимостта.

Ултразвуково подобрено протеолитично храносмилане: методология и резултати

Протокол за ускорено храносмилане

Ултразвуковото храносмилане комбинира протеолитични ензими и ултразвукова енергия за ускоряване на работните процеси. Например, използвайки Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), работният процес на храносмилане протича по следния начин:

1. Редукция: Протеиновите проби (0,5 mg/ml, 20 μL) се третират с DTT (2 μL, 110 mM) в амониев бикарбонатен буфер (12,5 mM). Соникацията се прилага при 50% амплитуда за 5 минути.
2. Алкилиране: След добавяне на IAA (2 μL, 400 mM), ултразвукът се повтаря при същите условия.
3. Храносмилане: Пробите се разреждат и инкубират с обездвижени наночастици трипсин. Последен кръг на ултразвук (5 минути) завършва храносмилането. Пептидите се разделят, изсушават и съхраняват за анализ на МС.

Този ултразвуков метод намалява общото време за подготовка от 12 часа до под 30 минути. Въпреки ускорения процес, добивът и качеството на пептидите остават в съответствие с традиционните методи за нощ.

Ефективност на ултразвуковото разграждане на протеини

При сравнителни изследвания, използващи протеоми на E. coli:

• Идентификация на протеина: Ултразвуково разградените проби идентифицират 777 протеина за 5 минути, в сравнение с 817 за 12 часа. Споделените идентификации на протеини надхвърлят 70%.
• Възпроизводимост: Повторните анализи показват стойности на корелация над 98% във всеки метод, което показва надеждност.
• Селективност: Някои протеини се усвояват преференциално по всеки метод, като ултразвуковото храносмилане благоприятства 65 протеина, а през нощта 54 протеина. Такива нюансирани разлики подчертават уникалния потенциал на ултразвука за специфични приложения.

Резултати от количествено определяне на протеина без етикет на седем протеина с шипове в E. coli
мостра. Следните протеини са добавени на две различни нива, както е отбелязано в колоната
наречен "Тео Рацио". Съотношението на Тео е теоретичното съотношение между двете нива, използвани в това
експеримент. серумен албумин от говедата (ALBU), β-лактоглобулин (LACB), α-S1 казеин (CASA1),
α-S2 казеин (CASA2), цитохром c (CYC), овалбумин (OVAL) и карбоанхидраза 2
(CAH2). Съотношенията са изчислени с помощта на интензитети на LFQ протеина, получени от MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Проучване и графика: © Martins et al., 2019)

Иммобилизиран трипсин с наночастици

Интегрирането на имобилизирани трипсинови наночастици (напр. T-FMNP) с ултразвук допълнително подобрява протеомичните работни процеси. Тези наночастици осигуряват висока повърхност за взаимодействия ензим-субстрат, повишавайки ефективността. Когато се прилага върху сложни протеоми, като E. coli, комбинираният метод постига:

• Скорост: Пълно храносмилане в рамките на 5 минути.
• Точност: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Мащабируемост: Адаптирането към многоямкови платформи като UIP400MTP позволява обработка с висока производителност.

Кликнете тук за подробния протокол с инструкции стъпка по стъпка!
(срв. Martins et al., 2019)

Протеолитично разграждане с висока скорост и висока производителност със сонатори Hielscher

Най-добрите модели Sonicator за протеомика

Hielscher Ultrasonics предлага различни модели ултразвукори за едновременно приготвяне на множество проби, улесняващи работните процеси с висока производителност. Независимо дали работите с флакони, епруветки, многоямкови плочи (напр. 6-, 24-, 96-ямкови плочи) или чашки на Петри – Ние ви предлагаме идеалните ултразвукови уреди за вашите експерименти.

UIP400MTP многоямков пластинчат ултразвук

За максимална производителност UIP400MTP осигурява възможност за ултразвукова обработка на 96-ямкови плочи. Съвместим с всяка стандартна микроплоча, UIP400MTP не изисква скъпи патентовани консумативи за еднократна употреба и ви дава свободата да изберете най-добрата многоямкова плоча за вашето изследване. Доставяйки равномерна енергия в плочата, той позволява бързо редукция, алкилиране и разграждане на до 200 сложни протеома само за 1 час. Това ниво на автоматизация и ефективност е от решаващо значение за високопроизводителната протеомика и клиничните приложения. Научете повече за многоямковия пластинчатия ултразвукораздирател!

ФлаконВисокоговорител за високи честоти

VialTweeter е пригоден за лаборатории, изискващи едновременно ултразвук на до 10 флакона или епруветки. Неговият неинвазивен подход елиминира рисковете от кръстосано замърсяване, като същевременно осигурява възпроизводимо разграждане на протеини. Това устройство е идеално за изследователи, работещи с ограничени обеми проби или различни типове проби.
Научете повече за многотръбния соникатор VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Ултразвукът CupHorn е мощно устройство, предназначено за едновременна обработка на множество проби в запечатани контейнери. Той осигурява равномерно ултразвуково разпределение на енергията и прецизен контрол на температурата. Възможността за обработка на до пет проби едновременно, съчетана със съвместимостта му с намалени, алкилирани и усвоени работни процеси, прави CupHorn надежден инструмент за протеомика, базирана на MS.
Научете повече за CupHorn SonoReactor!

Протокол стъпка по стъпка за ултразвуково протеолитично разграждане с помощта на обездвижен трипсин с наночастици

Този протокол от Martins et al. (2019) е оптимизиран за бързо разграждане на протеини с помощта на ултразвукова енергия и имобилизиран трипсин (T-FMNP). Очертаните стъпки осигуряват ефективна редукция, алкилиране и протеолиза, подходящи за приложения на масспектрометрия (MS).
Протоколни стъпки

1. Редукция на дисулфидни връзки
   • Добавете 2 μL DTT разтвор (110 mM) към 20 μL протеинова проба (0,5 mg/ml) в AmBic буфер.
   • Поставете епруветката за проба в sonoreactor UP200St-CupHorn.
   • Соникирайте пробата за 2,5 минути при 50% амплитуда (200 W, 26 kHz).
   • Направете пауза за кратък интервал, за да позволите охлаждане, след което пуснете ултразвук за още 2,5 минути при същите условия.
2. Алкилиране на редуцирани остатъци от цистеин
   • Добавете 2 μL разтвор на IAA (400 mM) към редуцираната протеинова проба.
   • Сонирайте за 2,5 минути при 50% амплитуда, за да улесните алкилирането.
   • Направете пауза за охлаждане, след което натиснете ултразвук за още 2,5 минути.

   Забележка: Минимизирайте излагането на алкилираната проба на светлина, за да предотвратите разграждането на IAA.

3. Разреждане на пробата
   • Алкилираната протеинова проба се разрежда до краен обем от 100 μL, като се използва 25 mM AmBic буфер, съдържащ 4% ацетонитрил (v/v).
   • Разбъркайте старателно чрез нежно пипетиране.
4. Протеолитично разграждане с обездвижен трипсин с наночастици
   • Добавете 20 μL разтвор на T-FMNP (3 mg/ml) към разредената протеинова проба.
   • Соникирайте сместа в сонорактора за 2,5 минути при 50% амплитуда.
   • Направете пауза за охлаждане, след това ултразвук за още 2,5 минути при същите условия.
5. Разделяне на трипсинови наночастици
   • Използвайте магнит, за да отделите T-FMNP от супернатанта, съдържащ усвоени пептиди.
   • Прехвърлете супернатанта в нова епруветка за микроцентрофуга.
6. Пептидна подготовка за МС анализ
   • Супернатантът, съдържащ пептиди, се изсушава във вакуумна центрофуга.
   • Съхранявайте изсушените пептиди при -20°C до по-нататъшен анализ чрез масспектрометрия.