Протокол за протеомика: безконтактната ултразвукова обработка подобрява подготовката на пептидни проби за MS
Протеомиката по подхода „отдолу нагоре“ се превърна в основополагащ метод за съвременното откриване на биомаркери, структурната биология и клиничната диагностика. Чрез разграждане на белтъците до пептиди преди анализа с масспектрометрия (MS) изследователите могат да постигнат по-пълно покритие на последователността и по-надеждно количествено определяне. Подготовката на биологични проби с висока сложност за MS обаче остава технически трудна. Последните методологични постижения показват как контролираната ултразвукова обработка – по-конкретно с безконтактния ултразвуков апарат за множество епруветки VialTweeter и ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP – може значително да оптимизира този работен процес, да подобри възпроизводимостта и да предотврати често срещани ограничения в работата на апаратурата.
Запознайте се с подробен протокол за подготовка на проби, чрез който да получите пептиди с подходящ размер за анализ чрез MS.
Кой трябва да използва безконтактна ултразвукова обработка за подготовка на пептидни проби?
- Лаборатории за протеомика по подхода „отдолу нагоре“ и откривателски изследвания: Изследователи, които подготвят проби с висока сложност за работни процеси с LC-MS или MALDI и се нуждаят от постоянно висок добив на пептиди от различни биологични матрици.
- Потребители на S-Trap™ и улавяне в суспензия: Екипи, които разчитат на пречистване с микроколони и се нуждаят от контролирано срязване на ДНК, за да предотвратят запушването на колоните и да осигурят безпроблемно зареждане и ензимно разграждане на пробите.
- Групи за клинични и транслационни изследвания: Лаборатории, които обработват тъкани, клетки, плазма, серум или цереброспинална течност и за които възпроизводимостта между партидите и запазването на целостта на пробите са от критично значение.
- Екипи за количествена и таргетна MS: Лаборатории, които извършват строго контролирани сравнителни изследвания, при които ултразвуковите апарати със сонда създават рискове от кръстосано замърсяване, способни да компрометират количественото определяне на пептиди с ниско съдържание.
- Центрове със споделена научна инфраструктура и дейности с висок капацитет за обработка на проби: Групи, които обработват едновременно множество биологични повторения и се възползват от блоковата ултразвукова обработка на множество затворени епруветки с VialTweeter, която премахва необходимостта от почистване на сонда, намалява времето за ръчна работа и поддържа асептични условия.
- Изследователи на посттранслационните модификации (PTM) и структурата на белтъците: Изследователи, които се нуждаят от щадяща обработка с контролирана температура, за да запазят лабилните модификации и да постигнат максимално покритие на последователността при клетъчен лизис и хомогенизация.
Ултразвуков апарат за множество проби „VialTweeter“ за безконтактна подготовка на проби за протеомика в множество запечатани флакони
Преглед на протокола: от тъкани и клетки до пептиди, готови за MS
Широко прилаганият работен процес за протеомика по подхода „отдолу нагоре“, описан от Wojtkiewicz и съавт., осигурява надежден, мащабируем метод за подготовка на пептидни проби от различни биологични матрици. Започвайки с 50–100 mg бързо замразена тъкан или 1–20 милиона клетки, протоколът включва технология за улавяне в суспензия (S-Trap™), за да отстрани ефективно детергенти, соли и замърсители преди ензимното разграждане.
След лизис, количествено определяне на белтъците, редукция и алкилиране пробата се подкиселява и се зарежда в центрофужна колона S-Trap™, където се извършва разграждане с трипсин/lysC. Получените пептиди се елуират, изсушават и подлагат на LC-MS анализ. Когато се прилага върху 50 mg човешка сърдечна тъкан, този работен процес неизменно осигурява достатъчно пептиди за 30–40 инжектирания, като при всеки анализ се идентифицират над 4 000 уникални белтъка. Въпреки че химичните процедури и пречистването с колони са ясно определени, успехът на цялостния процес зависи в голяма степен от началните етапи на физическо разрушаване и обработка на ДНК.
Протоколът препоръчва използването на ултразвуковия апарат за множество епруветки VialTweeter за ултразвуков лизис на клетките и срязване на ДНК – и двата етапа са от критично значение за анализа на пептидите.
VialTweeter обработва ултразвуково запечатани епруветки Eppendorf с обем 1,0, 1,5 и 2,0mL, както и различни флакони NUNC
Ултразвуков лизис на клетки и тъкани за извличане на белтъци
В работния процес за протеомика по подхода „отдолу нагоре“ ултразвуковата обработка е ключов етап при лизиса на клетъчни проби за извличане на белтъци за последващ масспектрометричен анализ. След добавяне на буфер със SDS за клетъчен лизис към клетъчната утайка пробите се подлагат на ултразвукова обработка с ултразвуковия апарат за множество епруветки VialTweeter. Протоколът използва микроцентрофужни епруветки с обем 1,5 mL и предписва работа на ултразвуковия апарат при 30% мощност с 10 секунди включване и 10 секунди изключване, повторени в 3 цикъла. След изчакване от 1 минута цикълът се повтаря още два пъти. Пробите се охлаждат непрекъснато с лед.
Този процес не само подпомага разрушаването на клетките, но е необходим именно за срязване на геномната ДНК, освободена при лизиса. Ефективното срязване на ДНК е от решаващо значение за намаляване на вискозитета на пробата и предотвратяване на запушването на колоните S-Trap™, като по този начин се осигуряват оптимален добив на белтъци и надеждно последващо ензимно разграждане за получаване на пептиди.
Критичната роля на ултразвуковото срязване на ДНК
Един от най-честите проблеми в работните процеси, базирани на S-Trap™, е запушването на колоната, което се причинява почти изключително от геномна ДНК с висока молекулна маса, освободена при хомогенизация на клетки или тъкани. Нефрагментираната ДНК рязко увеличава вискозитета на пробата, задържа пептидите и блокира микропорестия сорбентен слой на S-Trap™.
Ултразвуковата обработка решава този проблем чрез механично фрагментиране на ДНК до малки, разтворими фрагменти. Чрез прилагане на контролирана акустична енергия VialTweeter ефективно срязва нуклеиновите киселини, без да генерира прекомерна топлина или да внася външни замърсители. Това намаляване на вискозитета осигурява безпроблемно зареждане на пробите, постоянен дебит през колоната и непрекъсната кинетика на ензимното разграждане.
Оптимизирани параметри за ултразвукова обработка с VialTweeter
Протоколът определя режим на ултразвукова обработка с висока възпроизводимост, оптимизиран за запазване на целостта на биологичните проби и съвместимост с последващия MS анализ. За проба в микроцентрофужни епруветки с обем 1,5mL, обработвана с безконтактния блоков ултразвуков апарат Hielscher VialTweeter, следните параметри осигуряват лизис и оптимално срязване на ДНК, като същевременно запазват структурата на белтъците:
- Амплитуда: 30% мощност
- Схема на цикъла: 10 секунди ВКЛЮЧЕНО / 10 секунди ИЗКЛЮЧЕНО
- Продължителност: 3 цикъла (10sec ВКЛЮЧЕНО/10sec ИЗКЛЮЧЕНО) → 1 минута почивка върху лед → повторение още 2 пъти
- Контрол на температурата: пробите се поставят върху лед по време на обработката, за да се предотвратят термична денатурация и преждевременна ензимна активност
Този подход с импулсна ултразвукова обработка предотвратява локалното прегряване, свежда до минимум окисляването на пептидите и осигурява равномерно акустично въздействие във всички флакони. Конфигурацията със затворени епруветки премахва и необходимостта от почистване на сонда между пробите, като драстично намалява времето за ръчна работа и вариациите, дължащи се на оператора.
Основни предимства за съвременните работни процеси в протеомиката
Включването на VialTweeter във вашия работен процес за протеомика по подхода „отдолу нагоре“ предлага редица практически и научни предимства:
- Постоянство при фрагментирането на ДНК: Равномерното подаване на акустична енергия във всички флакони осигурява възпроизводимо намаляване на вискозитета и предотвратява вариациите между партидите при зареждането на S-Trap™.
- Запазване на лабилните модификации: Обработката при ниска температура в ледена баня защитава посттранслационните модификации (PTM) и предотвратява предизвиканата от топлина агрегация на белтъците при клетъчен лизис.
- Оптимизирана последваща обработка: Лизатите, обработени с VialTweeter, могат директно да бъдат избистрени чрез центрофугиране и подложени на количествено определяне без допълнителни етапи на пречистване, което ускорява преминаването към ензимно разграждане със S-Trap™.
- Мащабируемост и гъвкавост: Едни и същи настройки за ултразвукова обработка са приложими както за тъканни проби с висока сложност, така и за клетъчни суспензии, като подпомагат работните процеси за откривателска протеомика, таргетно количествено определяне и гликопротеомика. Ултразвуковите апарати за микроплаки на Hielscher позволяват лесно увеличаване на броя на обработваните проби в плаки с множество ямки.
Безконтактният ултразвуков апарат за множество епруветки VialTweeter може да работи в хладилни шкафове
Ултразвукови апарати за подготовка на проби за протеомика
Подготовката на висококачествени пептидни проби за масспектрометрия изисква повече от ефективен лизис – тя налага прецизен контрол върху срязването на ДНК, температурата и предотвратяването на замърсяване. Чрез включване на Hielscher VialTweeter във вашия работен процес за протеомика по подхода „отдолу нагоре“ можете да премахнете запушването на S-Trap™, да осигурите възпроизводим добив на белтъци и да поддържате чистотата, необходима за чувствителни MS анализи. Независимо дали обработвате човешка тъкан, култивирани клетки или сложни лизати, блоковата ултразвукова обработка осигурява надеждността, мащабируемостта и контрола на процеса, които съвременните лаборатории по протеомика изискват.
За да увеличите броя на обработваните проби, възползвайте се от фокусираните безконтактни ултразвукови апарати за микроплаки на Hielscher, модели UIP400MTP и UIP550MTP! Обработвайте всяка стандартна плака с множество ямки за протеомика с висок капацитет за обработка на проби!
Обработка в затворени епруветки в сравнение с традиционните ултразвукови апарати със сонда
В миналото изследователите са разчитали на ултразвукови апарати със сонда в пряк контакт с пробата за срязване на ДНК. Макар да са ефективни, системите със сонда създават няколко критични ограничения в работните процеси за протеомика:
- Риск от кръстосано замърсяване: Повторното използване на сонда за множество проби води до пренос на аерозоли и внася замърсители от други проби, които изкривяват количествените MS резултати.
- Загуба на проба: Директното въвеждане на сондата може да доведе до разплискване, изпаряване и полепване на ценни пептиди по повърхността ѝ.
- Почистване: Щателното обеззаразяване на сондата между обработките отнема време и често е непълно, което компрометира изследванията на белтъци с ниско съдържание.
Блоковият ултразвуков апарат VialTweeter обработва пробите изцяло в запечатани микроцентрофужни епруветки. Тази конструкция със затворена система премахва контакта между сонда и проба, предотвратява образуването на аерозоли и поддържа строго асептични условия през цялата хомогенизация и лизис. За лаборатории, които обработват тъканни лизати с висока сложност или множество клетъчни линии, това означава по-чисти MS данни, по-висок добив на пептиди и по-надеждни биологични повторения.
Мащабиране към подготовка на проби с висок капацитет в плаки с множество ямки
С ултразвуковите апарати за микроплаки, модели UIP400MTP и UIP550MTP, обработката в епруветки може лесно да се мащабира до обработка на проби с висок капацитет във всяка стандартна плака с множество ямки.
Ултразвуков апарат за плаки с множество ямки UIP400MTP за извличане с висок капацитет на белтъци от проби
Често задавани въпроси за ултразвуковата обработка при подготовка на пептидни проби
Защо е необходима ултразвукова обработка преди обработката на пептиди със S-Trap™?
Ултразвуковата обработка е необходима за срязване на геномна ДНК с висока молекулна маса, освободена при лизис на клетки или тъкани. Нефрагментираната ДНК драстично увеличава вискозитета на пробата, което може да запуши микроколоната S-Trap™ и да задържи пептидите, като значително намали добива и съвместимостта с MS.
Как блоковият ултразвуков апарат VialTweeter подобрява подготовката на проби в сравнение с традиционните ултразвукови апарати със сонда?
За разлика от ултразвуковите апарати със сонда в пряк контакт с пробата, които изискват внимателно почистване между обработките и създават риск от пренос на аерозоли, VialTweeter обработва пробите изцяло в запечатани флакони и микроцентрофужни епруветки. Тази конструкция със затворени епруветки премахва кръстосаното замърсяване, предотвратява загубата на проби и поддържа строго асептични условия през цялата хомогенизация и клетъчен лизис.
Какви са оптималните параметри за ултразвукова обработка при подготовка на проби за протеомика?
За биологични проби като клетки и тъкани препоръчителният протокол използва ултразвуков апарат VialTweeter при 30% мощност с цикъл от 10 секунди включване / 10 секунди изключване, повторен 3 пъти. Пробите трябва да се държат върху лед по време на обработката, а цикълът да се повтори още два пъти, ако се обработват ≥5 милиона клетки. (вж. Wojtkiewicz и съавт., 2021)
Какво трябва да направя, ако колоната ми S-Trap™ се запуши при зареждането на пробата?
Запушването на колоната обикновено се причинява от висок вискозитет, дължащ се на ДНК, или недостатъчно избистряне. За да отстраните проблема, центрофугирайте щателно лизата си преди пипетиране и се уверете, че ДНК е достатъчно срязана чрез ултразвукова обработка.
Как безконтактната ултразвукова обработка подпомага работните процеси за количествена протеомика?
При количествени изследвания дори следи от кръстосано замърсяване между пробите могат да изкривят измерванията на пептиди с ниско съдържание. Обработката на множество затворени флакони с VialTweeter премахва въвеждането на сонда, осигурява възпроизводимост между партидите и запазва целостта на пробите за точни сравнителни анализи.
Какъв добив на белтъци и каква дълбочина на MS анализа мога да очаквам от този протокол?
Започвайки с 50 mg човешка сърдечна тъкан или 5 милиона клетки, работният процес със S-Trap™ обикновено осигурява достатъчно пептиди за 30–50 LC-MS инжектирания, като неизменно идентифицира над 4 000 уникални белтъка при всеки анализ. (вж. Wojtkiewicz и съавт., 2021)
Литература / Източници
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics доставя мощни безконтактни ултразвукови апарати за подготовка на проби и клиничен анализ. Ултразвуковият апарат за плаки с множество ямки UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn и проточният ултразвуков апарат GDmini2 обработват пробите, без да ги докосват.