Протокол за протеомика: Безконтактната ултразвукова обработка подобрява подготовката на пептидните проби за масс-спектрометрия
Протеомиката отдолу-нагоре се превърна в крайъгълен камък на съвременното откриване на биомаркери, структурната биология и клиничната диагностика. Чрез разграждането на протеините до пептиди преди анализа с масова спектрометрия (MS) изследователите могат да постигнат по-задълбочено покритие на последователността и по-надеждно количествено определяне. Подготовката на биологични проби с висока степен на сложност за MS обаче остава технически предизвикателна задача. Последните методологични постижения подчертават как контролираната ултразвукова обработка – по-конкретно с безконтактния ултразвуков апарат VialTweeter Multi-Tube и ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP – може значително да оптимизира този работен процес, да подобри възпроизводимостта и да предотврати често срещаните затруднения при работа с апаратурата.
Намерете подробен протокол за подготовка на проби, с който да се получат пептиди с подходящ размер за анализ чрез масс-спектрометрия.
Кой трябва да използва безконтактна ултразвукова обработка за подготовка на пептидни проби?
- Протеомика „отдолу нагоре“ & Discovery Labs: Изследователи, които подготвят проби с висока степен на сложност за LC-MS или MALDI процедури и за които е необходимо последователно извличане на пептиди с висока степен на добив от различни биологични матрици.
- S-Trap™ & Потребители, блокирани от системата за блокиране: Екипи, които използват пречистване чрез микроколони и се нуждаят от контролирано раздробяване на ДНК, за да предотвратят запушването на колоните и да осигурят безпроблемно зареждане и разграждане на пробите.
- клиничен & Групи за транслационни изследвания: Лаборатории, в които се обработват тъкани, клетки, плазма, серум или цереброспинална течност, където възпроизводимостта между партидите и целостта на пробите са от решаващо значение.
- Количествен & Целеви MS Teams: Лаборатории, провеждащи строги сравнителни изследвания, при които ултразвуковите апарати с многократно използваеми сонди създават риск от кръстосано замърсяване, което може да компрометира количественото определяне на пептиди с ниска концентрация.
- Основни съоръжения & Операции с висока производителност: Групи, които обработват едновременно множество биологични репликати и които извличат полза от ултразвукова обработка в затворени епруветки и в блокове с множество епруветки с помощта на VialTweeter, което елиминира необходимостта от почистване на сондата, намалява времето за ръчна работа и поддържа асептични условия.
- Родителско-учителска среща & Изследователи на структурните протеини: Изследователи, които се нуждаят от щадяща обработка при контролирана температура, за да запазят лабилните модификации и да постигнат максимално покритие на последователността по време на лизиса и хомогенизирането на клетките.
Соникатор с няколко проби “ФлаконВисокоговорител за високи честоти” за безконтактна подготовка на проби от множество запечатани флакони за протеомика
Общ преглед на протокола: От тъкани и клетки до пептиди, готови за MS анализ
Широко прилаганият „отдолу-нагоре“ работен процес в протеомиката, описан от Wojtkiewicz и др., предоставя надежден и мащабируем метод за подготовка на пептидни проби от разнообразни биологични матрици. Започвайки с 50–100 mg бързо замразена тъкан или 1–20 милиона клетки, протоколът интегрира технологията за улавяне на суспензия (S-Trap™) за ефективно отстраняване на детергенти, соли и замърсители преди ензимното разграждане.
След лизис, количествено определяне на протеините, редукция и алкилиране пробата се подкиселява и се нанася върху центрофужна колона S-Trap™, където се извършва разграждане с трипсин/лизC. Получените пептиди се елюират, изсушават и подлагат на LC-MS анализ. Когато се прилага към 50 mg човешка сърдечна тъкан, този работен процес последователно осигурява достатъчно пептиди за 30–40 инжекции, като идентифицира над 4 000 уникални протеина на цикъл. Въпреки че химията и пречистването чрез колона са добре дефинирани, успехът на процеса зависи в голяма степен от първоначалните етапи на физическо разграждане и управление на ДНК.
Протоколът препоръчва използването на ултразвуковия апарат VialTweeter Multi-Tube Sonicator за лизиране на клетките и раздробяване на ДНК чрез ултразвукова обработка – И двете стъпки са от решаващо значение за анализа на пептидите.
VialTweeter подлага на ултразвукова обработка запечатани епруветки Eppendorf с обем 1,0, 1,5 и 2,0 мл, както и различни флакони NUNC
Ултразвукова лизис на клетки и тъкани за извличане на протеини
В работния процес на протеомиката отдолу-нагоре ултразвуковата обработка е ключова стъпка в лизиса на клетъчните проби с цел извличане на протеини за последващ масс-спектрометричен анализ. След добавянето на SDS буфер за клетъчен лизис към клетъчния пелетен остатък пробите се подлагат на ултразвукова обработка с помощта на ултразвуковия апарат VialTweeter Multi-Tube Sonicator. Протоколът използва микроцентрофужни епруветки с обем 1,5 мл и предвижда соникаторът да работи при 30% мощност – 10 секунди включен и 10 секунди изключен, като цикълът се повтаря 3 пъти. След изчакване от 1 минута цикълът се повтаря още два пъти. Пробите се охлаждат непрекъснато с лед.
Този процес не само спомага за разрушаването на клетките, но е и от съществено значение за раздробяването на геномната ДНК, освободена по време на лизиса. Ефективното раздробяване на ДНК е от решаващо значение за намаляване на вискозитета на пробата и предотвратяване на запушването на колоните S-Trap™, като по този начин се осигурява оптимално извличане на протеини и надеждно последващо разграждане на пептидите.
Критичната роля на ултразвуковото раздробяване на ДНК
Една от най-често срещаните неизправности в работните процеси, основани на S-Trap™, е запушването на колоната, което се дължи почти изцяло на геномна ДНК с висока молекулна маса, освободена по време на хомогенизирането на клетките или тъканите. Неразградената ДНК значително повишава вискозитета на пробата, задържа пептидите и блокира микропорестото сорбентно легло на S-Trap™.
Ултразвуковата обработка решава този проблем чрез механично раздробяване на ДНК на малки, разтворими фрагменти. Чрез прилагане на контролирана акустична енергия, VialTweeter ефективно раздробява нуклеиновите киселини, без да генерира прекомерна топлина или да въвежда чужди примеси. Това намаляване на вискозитета осигурява безпроблемно зареждане на пробите, постоянни скорости на протичане и непрекъсната кинетика на разграждането.
Оптимизирани параметри за ултразвукова обработка с VialTweeter
Протоколът определя схема за ултразвукова обработка с висока степен на възпроизводимост, оптимизирана за запазване на целостта на биологичните проби и съвместимост с последващите масс-спектрометрични анализи. За проби в микроцентрофужни епруветки с обем 1,5 мл, при използване на безконтактния блоков ултразвуков апарат Hielscher VialTweeter, следните параметри осигуряват лизис и оптимално раздробяване на ДНК, като същевременно запазват структурата на протеините:
- Амплитуда: 30 % от мощността
- Цикличен режим: 10 секунди включено / 10 секунди изключено
- Продължителност: 3 цикъла (10 сек. „ВКЛ.“/10 сек. „ИЗКЛ.“) → 1 минута почивка с лед → повтаря се още 2 пъти
- Контрол на температурата: Пробите се поставят върху лед по време на обработката, за да се предотврати термична денатурация и преждевременна ензимна активност
Този метод на импулсно ултразвуково третиране предотвратява локализираното прегряване, свежда до минимум окисляването на пептидите и осигурява равномерно акустично въздействие върху всички флакони. Конфигурацията със затворена тръба също така елиминира необходимостта от почистване на сондата между отделните проби, което значително намалява времето за ръчна работа и вариативността, свързана с оператора.
Основни предимства за съвременните работни процеси в протеомиката
Интегрирането на VialTweeter във вашия „отдолу-нагоре“ протеомичен работен процес предлага редица оперативни и научни предимства:
- Постоянна фрагментация на ДНК: Равномерното подаване на акустична енергия във всички флакони гарантира възпроизводимо намаляване на вискозитета и предотвратява вариациите между отделните партиди при зареждането на S-Trap™.
- Запазване на лабилните модификации: Обработката при ниска температура в ледена баня запазва посттранслационните модификации (PTM) и предотвратява предизвиканата от топлината агрегация на протеините по време на лизиса на клетките.
- Оптимизирана последваща обработка: Лизатите, обработени с VialTweeter, могат да бъдат директно избистрени чрез центрофугиране и количествено определени без допълнителни етапи на пречистване, което ускорява процеса на разграждане с S-Trap™.
- Мащабируемост & Гъвкавост: Едни и същи настройки за ултразвукова обработка се прилагат както за тъканни проби с висока сложност, така и за клетъчни суспензии, като подпомагат работните процеси в областта на протеомиката за открития, целевото количествено определяне и гликопротеомиката. Ултразвуковите апарати за микроплаки на Hielscher позволяват лесно мащабиране до голям брой проби в мултилункови микроплаки.
Безконтактният мултитръбен ултразвуков апарат VialTweeter може да се използва в хладилни шкафове
Устройства за ултразвукова обработка за подготовка на проби за протеомика
Подготовката на висококачествени пептидни проби за масова спектрометрия изисква нещо повече от ефективен лизис – Това изисква прецизен контрол върху разрязването на ДНК, температурата и предотвратяването на замърсяване. Чрез включването на Hielscher VialTweeter във вашия „отдолу-нагоре“ работен процес по протеомика можете да елиминирате запушването на S-Trap™, да осигурите възпроизводимо извличане на протеини и да поддържате чистотата, необходима за чувствителни MS анализи. Независимо дали обработвате човешка тъкан, култивирани клетки или сложни лизати, ултразвуковата обработка на блокове осигурява надеждността, мащабируемостта и контрола върху процеса, които изискват съвременните протеомични лаборатории.
За да увеличите броя на пробите, възползвайте се от моделите на Hielscher за фокусирано, безконтактно ултразвуково обработване на микроплаки – UIP400MTP и UIP550MTP! Обработвайте всякакви стандартни мултилункови плаки за протеомика с висока производителност!
Обработка със затворена тръба в сравнение с традиционните ултразвукови апарати със сонда
В миналото изследователите са разчитали на ултразвукови апарати с сонда за директен контакт за раздробяване на ДНК. Въпреки че са ефективни, системите със сонди създават няколко сериозни ограничения в работните процеси в протеомиката:
- Риск от кръстосано замърсяване: Повторното използване на сонда за няколко проби води до пренасяне на аерозоли и въвежда кръстосани замърсители, които изкривяват количествените резултати от масс-спектрометрията.
- Загуба на проба: Прякото впръскване може да доведе до разпръскване, изпаряване и залепване на ценните пептиди по повърхността на сондата.
- Почистване: Цялостното деконтаминиране на сондата между отделните цикли отнема много време и често е непълно, което затруднява изследванията на протеини с ниска концентрация.
Устройството за ултразвукова обработка VialTweeter обработва пробите изцяло в запечатани микроцентрифужни епруветки. Тази конструкция със затворена система елиминира контакта между сондата и пробата, предотвратява образуването на аерозоли и поддържа строги асептични условия по време на хомогенизирането и лизиса. За лаборатории, работещи с висококомплексни тъканни лизати или множество клетъчни линии, това означава по-чисти данни от масс-спектрометрията, по-висока степен на извличане на пептиди и по-надеждни биологични репликати.
Преминаване към подготовка на проби с висока производителност в мултилункови плаки
С моделите микроплаков соникатор UIP400MTP и UIP550MTP, обработката в епруветки може лесно да се мащабира до обработка на проби с висока производителност във всяка стандартна плака с много лунки.
Многоямкови пластинчати соникатори UIP400MTP за високопроизводително извличане на протеини от проби
Често задавани въпроси относно ултразвуковата обработка при подготовката на пептидни проби
Защо е необходима ултразвукова обработка преди обработката на пептидите с S-Trap™?
Ултразвуковата обработка е необходима за разкъсване на геномната ДНК с висока молекулна маса, освободена по време на лизиса на клетките или тъканите. Неразградената ДНК драстично повишава вискозитета на пробата, което може да доведе до запушване на микроколоната S-Trap™ и задържане на пептиди, като значително намалява степента на извличане и съвместимостта с масс-спектрометрията.
По какъв начин соникаторът с блокова конструкция VialTweeter подобрява подготовката на пробите в сравнение с традиционните соникатори със сонди?
За разлика от ултразвуковите апарати с сонди за директен контакт, които изискват внимателно почистване между отделните цикли и създават риск от пренасяне на аерозоли, VialTweeter обработва пробите изцяло в запечатани флакони и епруветки за микроцентрифуга. Тази конструкция със затворени епруветки елиминира кръстосаното замърсяване, предотвратява загубата на проби и поддържа строги асептични условия по време на хомогенизирането и лизиса на клетките.
Какви са оптималните параметри на ултразвуковата обработка за подготовка на проби за протеомика?
За биологични проби като клетки и тъкани препоръчителният протокол предвижда използването на ултразвуков апарат VialTweeter при 30 % мощност с цикъл от 10 секунди включен / 10 секунди изключен, който се повтаря 3 пъти. Пробите трябва да се съхраняват на лед по време на обработката, а цикълът да се повтори още два пъти, ако се обработват ≥5 милиона клетки. (вж. Wojtkiewicz et al., 2021)
Какво да направя, ако колоната ми S-Trap™ се запуши по време на зареждането на пробата?
Запушването на колоната обикновено се дължи на високата вискозитет на ДНК или на недостатъчното избистряне. За да разрешите този проблем, центрофугирайте лизата си добре преди пипетирането и се уверете, че ДНК е подложена на достатъчно раздробяване чрез ултразвукова обработка.
Как безконтактната ултразвукова обработка допринася за работните процеси в количествената протеомика?
При количествените изследвания дори и минималното кръстосано замърсяване между пробите може да изкриви измерванията на пептидите с ниска концентрация. Технологията на VialTweeter за обработка на няколко епруветки в затворена тръба елиминира необходимостта от въвеждане на сонда, гарантира възпроизводимост между партидите и запазва целостта на пробите за точни сравнителни анализи.
Какъв добив на протеин и дълбочина на MS мога да очаквам от този протокол?
При изходна доза от 50 mg човешка сърдечна тъкан или 5 милиона клетки, работният процес S-Trap™ обикновено осигурява достатъчно пептиди за 30–50 LC-MS инжекции, като при всеки цикъл се идентифицират над 4 000 уникални протеина. (вж. Wojtkiewicz et al., 2021)
Литература / Препратки
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics предлага мощни безконтактни ултразвукови апарати за подготовка на проби и клиничен анализ. Ултразвуковият апарат за мулти-лункови плаки UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn и поточният ултразвуков апарат GDmini2 обработват пробите, без да ги докосват.