Ултразвукова обработка на микроплаки в протеомиката по метода „Шотган“ – Указания за употреба
Протеомиката от типа „Shotgun“ зависи от ефективна и възпроизводима подготовка на пробите, за да превърне сложния биологичен материал в пептиди, готови за LC-MS/MS. Устройството за ултразвукова обработка на микроплаки UIP400MTP подпомага този процес, като позволява стандартизирана, паралелна ултразвукова обработка на проби с малък обем, което помага на лабораториите да подобрят разбиването, екстракцията и повторното разтваряне в работните процеси, базирани на микроплаки. Настоящата бележка за приложение описва как UIP400MTP може да бъде интегриран в подготовката на проби за протеомика, като използва публикуван работен процес с екстрацелуларни везикули от проучвания на PLA2G12A/Th17 като лабораторно тестван пример.
Ултразвукова обработка на микроплаки за по-възпроизводима „шотган“ протеомика
За изследователите в областта на протеомиката възпроизводимата подготовка на пробите е от решаващо значение за получаването на висококачествени LC-MS/MS данни. Устройството за ултразвукова обработка на микроплаки UIP400MTP поддържа стандартизирана, паралелна ултразвукова обработка в работни процеси, базирани на микроплаки, както и в такива с малък обем и висока производителност.
Това е особено полезно за лаборатории, работещи с:
- Големи набори от проби, които изискват еднаква обработка в много лунки
- Материал с ограничено количество входяща информация, при който загубата на проби и вариативността трябва да бъдат сведени до минимум
- Проби с високо съдържание на липиди, като например извънклетъчни везикули
- Сложни биологични препарати, които изискват ефективно раздробяване, екстракция или повторно разтваряне
- Сравнителна протеомика от типа „shotgun“, при която възпроизводимостта при различни условия и повторения е от съществено значение
Чрез включването на ултразвукова обработка в микроплаки преди разграждането изследователите могат да подобрят подготовката на пробите за:
- Извличане и повторно разтваряне на протеини
- Разграждане с трипсин/Lys-C
- Събиране на данни чрез Nano-LC/MS/MS
- Количествен протеомичен анализ на крайните продукти
Разберете как ултразвуковата обработка на микроплаки спомага за намаляване на вариациите, свързани с ръчната работа, подобрява разбиването на пробите и подготвя сложни биологични проби за надежден LC-MS/MS анализ.
Ултразвуковата обработка на микроплаки може да бъде полезна за:
- Базови съоръжения за протеомика
- Изследователски лаборатории за електромобили
- Лаборатории по имунология и клетъчна биология
- Изследователски групи в областта на транслационната наука
- Екипи в областта на биологичните науки, които преминават от подготовка на единични проби към работни процеси с по-висока производителност
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
The UIP400MTP is not an ultrasonic bath. It'a a high intensity cup horn for focused sonication. This powerful non-contact sonicator delivers a uniform sonication across all wells of your standard well-plate. You have precise control over amplitude, power, and pulsing. A built-in timer and temperature probe ensures consistent results. The UIP400MTP plate sonicator cools samples with water bath (external chiller optional).
Подготовка на проби с висока производителност за анализ на протеома на екстрацелуларните везикули
Какво представлява „Shotgun Proteomics“?
Протеомиката от типа „Shotgun“ се превърна в основна аналитична стратегия за характеризиране на сложни биологични проби – от лизати на цели клетки и тъканни екстракти до пречистени органели, екстрацелуларни везикули и клинични проби с малък обем. Основното ѝ предимство се състои в съчетаването на разграждане на протеини, течна хроматография с висока разделителна способност, съчетана с тандемна масова спектрометрия, и компютърно извеждане на пептиди от протеини. Качеството на крайния набор от данни за протеома обаче се определя много преди пробата да достигне до масс-спектрометъра. Ефективното раздробяване на пробата, разтварянето на протеините, отстраняването на смущаващи вещества, възпроизводимото ензимно разграждане и надеждното извличане на пептиди са решаващи за дълбочината на покритие и количествената надеждност.
За изследователите в областта на протеомиката и лабораториите по биологични науки, които работят с ограничени или ценни проби, подготовката на пробите често се оказва пречка.
UIP400MTP осигурява надеждна подготовка на пробите и лесна интеграция със съществуващите лабораторни работни процеси
Предизвикателството, свързано с екстрацелуларните везикули в протеомиката
Извънклетъчните везикули (EV), например, представляват особено трудна за обработка група проби. Те са обградени с мембрана, богати на липиди, наноразмерни частици със сравнително нисък добив на протеини и висок риск от пренасяне на липиди, соли, детергенти, серумни протеини и други компоненти на матрицата. Тези характеристики могат да повлияят неблагоприятно на ефективността на разграждането, хроматографските показатели, стабилността при електроспрей и идентифицирането на пептидите. Поради това работният процес за подготовка при протеомиката на EV трябва да бъде достатъчно силен, за да разруши структурите на везикулите и да разтвори протеиновия товар, като същевременно остава съвместим с последващото ензимно разграждане и LC-MS/MS анализа.
В този контекст ултразвуковата обработка, съвместима с микроплаки, предлага практичен подход за възпроизводима и паралелна обработка на проби. Моделите соникатори за микроплаки на Hielscher UIP400MTP (400 W) и UIP550MTP (550 W) са проектирани за ултразвукова обработка на проби в многолункови плаки и съдове с малък обем, като поддържат работни потоци с по-висока производителност в сравнение с конвенционалните соникатори с една сонда. За протеомичните лаборатории този формат е привлекателен, тъй като може да намали вариативността, свързана с ръчната работа, да подобри паралелната обработка на множество проби и да се интегрира по-естествено в потоците за подготовка на проби, базирани на плаки.
Примерен работен процес
Един неотдавнашен работен процес за протеомика на екстрацелуларни везикули в областта на биологията на Th17-клетките, стимулирани от PLA2G12A, предоставя полезен, лабораторно тестван пример за това как соникаторът за микроплаки UIP400MTP може да бъде включен в подготовката на проби за „шотган“ протеомика. В тази серия от проучвания пробите от екстрацелуларни везикули (EV) бяха обработени за протеомни анализи чрез третиране с метанол, соникация с UIP400MTP, центрофугиране, сушене, разграждане с трипсин/Lys-C и нанопоточна течна хроматография (LC) с тандемна масс-спектрометрия (MS) с висока разделителна способност. Същата биологична работа беше първоначално публикувана като препринт в bioRxiv и впоследствие публикувана в списанието „Cell Reports“, където протеомният анализ помогна да се характеризира как PLA2G12A променя протеините в съдържанието на екзозомите в контекста на патогенните Т-клетъчни реакции.
Устройство за ултразвукова обработка UIP400MTP за 96-лункова плака, предназначено за екстракция на протеини с висока производителност
Устройство за ултразвукова обработка: UIP400MTP микроплачен ултразвук
Входни данни: 5 µg еквивалент на EV протеин
Храносмилане: Трипсин/Lys-C
Резултат: Нано-LC-MS/MS / DIA протеомика
Поетапни инструкции: Подготовка на проби от електромобили с помощта на UIP400MTP за „Shotgun“ протеомика
Този работен процес описва метод за подготовка на проби за „шотган“ протеомика на екстрацелуларни везикули (EV) с минимално количество изходни материали, като се използва ултразвуков апарат за микроплаки UIP400MTP. Той се основава на публикуван работен процес за протеомика на EV, при който пробите от EV са били нормализирани, изсушени, третирани с метанол, подложени на ултразвукова обработка, разградени с трипсин/Lys-C, подкиселени и анализирани чрез nano-LC-MS/MS.
Процедурата е предназначена за изследователи в областта на протеомиката и лаборатории по биологични науки, които подготвят екзозоми (EV) или други биологични проби с малък обем и високо съдържание на липиди за „bottom-up“ протеомика по метода „shotgun“.
Общ преглед на работния процес
| Етап | Цел | Основен резултат |
|---|---|---|
| Подготовка на електромобила | Изолиране, промиване и количествено определяне на пробите от екзозоми | Нормализирано входно напрежение на EV |
| Сушене на проби | Отстранете течността преди обработката с помощта на разтворител | Изсушен материал от електромобили |
| Обработка с метанол | Подпомага разграждането на материала на екзозомите, богат на липиди | Проба, напоена с метанол |
| Ултразвукова обработка с UIP400MTP | Насърчаване на разбиването, извличането и хомогенизирането | Обработена проба от електромобил |
| храносмилане | Синтезиране на пептиди от протеини на екзозомите | Пептидно разграждане с трипсин/Lys-C |
| LC-MS/MS анализ | Разделяне, откриване и количествено определяне на пептиди | Набор от данни за протеомика |
| Анализ на данни | Идентифициране и количествено определяне на пептиди и протеини | Резултати на ниво протеини |
Протокол „стъпка по стъпка“
| крачка | Инструкция | Критични параметри |
|---|---|---|
| 1 | Подгответе пречистени проби от екзосоми, като използвате установената в лабораторията процедура за изолиране. | Преди подготовката за протеомично изследване отстранете клетките, остатъците и основните замърсители. |
| 2 | Определете количествено съдържанието на EV протеини, например чрез BCA-анализ. | Нормализирайте всички проби, така че входните им стойности да бъдат равни на протеиновия еквивалент. |
| 3 | Прехвърлете 5 µg еквивалент на EV протеин в чисти PCR епруветки или съвместими епруветки с малък обем. | Използвайте епруветки с ниска адхезия, когато съществува риск от загуба на проба. |
| 4 | Изсушете напълно пробите от електромобилите. | Избягвайте прегряването; уверете се, че няма остатъци от течност. |
| 5 | Добавете по 25 µL метанол към всяка изсушена проба от EV. | Уверете се, че изсушеният материал е напълно напоен. |
| 6 | Обработете пробите със соникатор в продължение на 3 минути, като използвате соникатора за микроплаки UIP400MTP. | Използвайте еднакви настройки за ултразвукова обработка и логика на подреждане за всички проби. |
| 7 | Центрофугирайте обработените със ултразвук проби при 19 000 × g в продължение на 20 минути при 4 °C. | След центрофугирането избягвайте да разбърквате утайката или неразтворимите частици. |
| 8 | Внимателно отстранете 20 µL от супернатантата. | Прилагайте една и съща техника на пипетиране при всички проби. |
| 9 | Изсушете напълно останалата проба. | Преминавайте директно към разграждането или съхранявайте само при проверени условия. |
| 10 | Добавете 4 µL разтвор на трипсин/Lys-C с концентрация 100 ng/µL в 50 mM амониев бикарбонат. | Пригответе свеж ензимен разтвор или използвайте правилно съхранени аликвоти. |
| 11 | Обработете кратко с ултразвук, за да разтворите изсушения протеинов материал в разтвора за разграждане. | След ултразвуковата обработка съберете цялата течност, натрупана на дъното на епруветката. |
| 12 | Оставете да ферментира в продължение на 2 часа при 37 °C, като разклащате при 300 об./мин. | Дръжте капачките плътно затворени, за да предотвратите изпаряването. |
| 13 | Добавете 1 µL 1,25% TFA, за да подкиселите разградения материал. | Подкиселяването спира процеса на разграждане и подготвя пептидите за LC-MS/MS. |
| 14 | Прехвърлете хидролизата в флакони или плаки, съвместими с LC-MS. | Избягвайте пренасянето на неразтворими отпадъци. |
| 15 | Анализ чрез nano-LC-MS/MS. | Използвайте постоянни настройки за обем на инжектиране, LC градиент и събиране на данни за MS. |
| 16 | Обработете необработените данни с помощта на софтуер за DIA, DDA или целева протеомика, според случая. | Приложете подходяща база данни, специфичност на ензимите, настройки за модификация и прагове на FDR. |
Многоямкови пластинчати соникатори UIP400MTP
Защо да се използва ултразвукова обработка на микроплаки?
UIP400MTP позволява стандартизирано, паралелно ултразвуково обработване на проби с малък обем. Това е полезно, когато са важни възпроизводимостта, малкият обем на пробата и обработката на множество проби.
Използвайте всякаква стандартна микроплака! Подготовка на проби с висока производителност с UIP400MTP
В описания работен процес за протеомика на екзозомите (EV) се използваха 5 µg екзозоми, еквивалентни на протеин, 25 µL метанол, 3 минути ултразвукова обработка с UIP400MTP, разграждане с трипсин/Lys-C, подкисляване с TFA и анализ чрез нано-LC-MS/MS.
Препоръчителни стъпки за LC-MS/MS и анализ на данните
След разграждане и подкиселяване пробите могат да бъдат анализирани чрез нанопоточна обратнофазова течна хроматография, съчетана с тандемна масс-спектрометрия с висока разделителна способност. В публикувания работен процес пептидите бяха разделени в нано-LC система и анализирани чрез метод за събиране на данни, независим от данните, на масс-спектрометър Orbitrap.
| Етап | Препоръка | Цел |
|---|---|---|
| Зареждане на проби | Използвайте C18 уловител или еквивалентна система за натоварване с пептиди. | Концентрира пептидите и отстранява силно полярните примеси. |
| Разделяне на пептиди | Използвайте нанопоточна течностна хроматография с обратна фаза. | Подобрява разделянето на пептидите и чувствителността на масс-спектрометрията. |
| Придобиване на MS | Използвайте DIA, DDA или целенасочена MS в зависимост от дизайна на проучването. | Генерира спектрални данни на ниво пептиди. |
| Търсене в базата данни | Използвайте референтна база данни, подходяща за съответния вид. | Поддържа идентифицирането на пептиди и протеини. |
| Управление FDR | Прилагане на прагове за честотата на фалшивите открития при пептидите и протеините. | Определя степента на достоверност на идентификацията. |
| Количествено измерване | Експортиране на таблици с данни за изобилието на пептиди, прекурсори и протеини. | Позволява статистическо сравнение между групи. |
Контролен списък за контрол на качеството
- Уверете се, че количеството протеин, изразено в EV, е еднакво във всички проби.
- Използвайте схеми за обработка на извадки, основани на рандомизация или балансиране.
- Поддържайте постоянни обема на метанола, времето за ултразвукова обработка, времето за сушене и обема на разлагането.
- Проследявайте добива на пептиди и идентифицирането на общия протеин.
- Проверете процента на пропуснатите разцепвания и разпределението на дължините на пептидите.
- Проверете формата на хроматографските пикове и възпроизводимостта на времето на задържане.
- Включете празни места, за да следите пренасянето.
- За по-мащабни проучвания използвайте обединени проби за контрол на качеството.
- Изчислете коефициента на вариация на повторенията.
- Използвайте PCA или сродни методи за идентифициране на ефекти, свързани с партидата, или на изключения.
Препоръки за водене на протоколи
При публикуване или документиране на този работен процес посочете количеството на входящия електролит, формата на плаката, обема на метанола, амплитудата и времето на ултразвукова обработка с UIP400MTP, условията на центрофугиране, метода на сушене, буфера за разграждане, концентрацията на ензима, времето на разграждане, условията на подкиселяване, LC-MS/MS платформата, режима на събиране на данни, версията на софтуера, базата данни, прага на FDR, метода на нормализация и статистическия работен процес.
Всички ултразвукови апарати за микроплаки на Hielscher автоматично записват важни параметри на процеса, като амплитуда, продължителност на ултразвуковата обработка и температура, заедно с дата и час, като CSV-файл на вградената SD-карта. Записването на данни с цел възпроизводимост и контрол на качеството никога не е било по-лесно!
При DIA протеомиката използвайте еднакви настройки за събиране на данни за всички проби и, когато е възможно, включвайте обединени проби за контрол на качеството. Следете броя на прекурсорите, стабилността на времето на задържане и вариативността между повторенията.
Този работен процес е лабораторно тестван пример за протеомика на електромобили. За други видове проби оптимизирайте количеството на входящия материал, условията на разтворителя, времето за ултразвукова обработка, обема на разграждането и стратегията за инжектиране в LC-MS/MS, преди да преминете към пълномащабно проучване.
Подробно описание на проучването: Протеомика на EV Shotgun в проучването за PLA2G12A
Изследването на PLA2G12A предоставя конкретен пример за използването на UIP400MTP в работния процес на „шотган“ протеомиката. Биологичният въпрос беше как секретираната фосфолипаза PLA2G12A модифицира екстрацелуларните везикули, произхождащи от Th17-клетки, и по този начин влияе върху диференциацията на патогенните Т-клетки. Авторите показаха, че PLA2G12A въздейства върху мембраните на екстрацелуларните везикули (EV), като произвежда лизофосфолипиди, включително 1-олеоил-лизофосфатидил етаноламин, и че последващото сигнализиране чрез лизофосфатидинова киселина посредством LPA2 допринася за диференциацията на Th17. Освен липидния сигнализиращ път, проучванията разгледаха и съдържанието на екстрацелуларните везикули, включително РНК и протеини, което превърна „шотган“ протеомиката в важен компонент на стратегията за характеризиране.
В рамките на работния процес за подготовка на EV, Th17-клетките бяха култивирани в среда, съдържаща фетално телешко серум, от което са отстранени екзозомите. Супернатантите от културите първо бяха центрофугирани за отстраняване на клетките, филтрирани през 0,22 µm филтър, концентрирани чрез ултрафилтрация/ултрацентрофугиране, промити, ресуспендирани в PBS и количествено определени чрез BCA протеинов тест. Тази предварителна подготовка на EV гарантира, че определено количество EV материал, еквивалентно на протеини, може да бъде пренесено в протеомичния работен процес.
За протеомния анализ по метода „shotgun“ авторите използваха проби от екзозоми, съответстващи на 5 µg протеинови еквиваленти. Тези проби бяха изсушени в PCR епруветки, след което към тях бяха добавени 25 µL метанол. След това пробите бяха подложени на ултразвукова обработка в продължение на 3 минути с помощта на ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP. След ултразвуковата обработка пробите бяха центрофугирани при 4 °C в продължение на 20 минути при 19 000 × g. След отстраняване на 20 µL супернатант пробите бяха центрофугирани до изсушаване. След това протеините бяха разтворени чрез ултразвукова обработка в 4 µL разтвор на трипсин/Lys-C с концентрация 100 ng/µL в 50 mM амониев бикарбонат. Разграждането се извършваше в продължение на 2 часа при 37 °C при разклащане при 300 об./мин. Разграденият продукт се подкиселяваше с 1 µL 1,25% трифлуорооцетна киселина и се подлагаше на нанопоточна течна хроматография, съчетана с тандемна масова спектрометрия с висока разделителна способност.
Този работен процес подчертава няколко полезни принципа за протеомика на екзозомите с малък входящ обем. Първо, входящият обем беше нормализиран по протеинов еквивалент, което е важно при сравняване на екзозоми от различни генотипове или лечения. Второ, преди ултразвуковата обработка беше използван метанол, който подпомага разграждането и екстракцията, като същевременно се избягват детергентни системи, които могат да затруднят LC-MS/MS анализа. Трето, етапът на ултразвукова обработка беше кратък и стандартизиран, което е съвместимо с паралелната обработка на пробите. Четвърто, разграждането с трипсин/Lys-C беше извършено в много малък обем, което намали разреждането и подпомогна извличането на пептиди при ниско входящо количество. Накрая, преходът от разграждането към подкисляването и LC-MS/MS сведе до минимум ненужните етапи на обработка.
Приложеният метод за LC-MS/MS включваше разделяне с обратна фаза при нанопоток, съчетано с масс-спектрометър Q-Exactive HF Orbitrap. Пробите бяха уловени на C18 предколонка, след което бяха разделени на аналитична колона с вътрешен диаметър 50 µm при дебит 200 nL/min и температура 40°C. Градиентът варираше от ниско съдържание на органичен разтворител до 35% разтворител B в продължение на 60 минути, последвано от промиване с високо съдържание на органичен разтворител и повторно уравновесяване. Събирането на MS данни се извършваше в режим на положителни йони, като се използваше независимо от данните събиране с дисоциация при сблъсък с по-висока енергия. Суровите DIA файлове бяха анализирани с помощта на DIA-NN 1.8 с библиотека от спектри, предсказани in silico.
Екстракция на протеини с висока производителност с 96-ямковия пластинен соникатор UIP400MTP
Често задавани въпроси
Кой извлича най-голяма полза от ултразвуковата обработка на микроплаки в протеомиката по метода „шотган“?
Ултразвуковата обработка на микроплаки е особено полезна за протеомични лаборатории, които обработват множество проби едновременно, включително общи лабораторни центрове, изследователски групи в областта на протеомиката, имунологични лаборатории, екипи за транслационни изследвания и лаборатории в областта на биологичните науки, които преминават към работни процеси с LC-MS/MS с по-висока производителност. Тя е особено подходяща, когато възпроизводимостта между отделните проби е от решаващо значение.
Защо да използвате UIP400MTP вместо обикновен соникатор със сонда?
Обикновеният соникатор с сонда обикновено обработва пробите една по една и изисква внимателно почистване между отделните проби, за да се намали пренасянето на остатъци. Моделите соникатори за микроплаки UIP400MTP и UIP550MTP поддържат паралелна соникация в формат на микроплаки или с малък обем, което спомага за намаляване на ръчната работа, подобряване на последователността и оптимизиране на подготовката на множество проби. Те позволяват и лесна интеграция в автоматизирани работни процеси.
Къде се вписва ултразвуковата обработка в работния процес на „шотган“ протеомиката?
Ултразвуковата обработка обикновено се прилага по време на фазата на предварителна подготовка на пробите преди ензимното разграждане. Тя може да подпомогне разбиването, екстракцията, хомогенизирането и повторното разтваряне преди ензимното разграждане с трипсин, Lys-C или смес от трипсин и Lys-C.
Освен това ултразвуковото третиране може да се прилага и по време на разграждането, за да се ускори значително ензимното разграждане на протеините. Открийте потенциала на високопроизводителното разграждане на протеини чрез ултразвукова обработка за бърз протеомичен работен процес!
Полезна ли е ултразвуковата обработка на микроплаки за протеомиката на екстрацелуларните везикули?
Да. Извънклетъчните везикули са богати на липиди, обградени с мембрана частици, чиято обработка по възпроизводим начин може да се окаже трудна. В цитираните проучвания за PLA2G12A пробите от екстрацелуларни везикули бяха третирани с метанол, обработени с ултразвук с апарата UIP400MTP, изсушени, разградени с трипсин/Lys-C и анализирани чрез нано-LC/MS/MS.
За какви видове проби е подходящо ултразвуковото третиране в микроплаки?
Ултразвуковата обработка в микроплаки може да бъде полезна за клетъчни лизати, фракции от органели, имунопреципитати, протеинови агрегати, проби с високо съдържание на мембрани, екстрацелуларни везикули и други биологични препарати с малък обем. За всеки тип проба трябва да се оптимизират интензивността и продължителността на ултразвуковата обработка, условията на разтворителя, входящото количество и стратегията за разграждане.
Звуковата обработка замества ли ензимното разграждане?
Не. Ултразвуковата обработка спомага за подготовката на пробата за разграждане, като подобрява разбиването, екстракцията или повторното разтваряне. Протеолитичното разграждане все пак е необходимо за получаването на пептиди за „bottom-up“ протеомика по метода „shotgun“.
Прочетете повече за ускореното чрез ултразвук разграждане на протеини в протеомните работни процеси!
Съвместим ли е UIP400MTP с протеомика с малък обем проба?
Да, форматът с микроплаки е подходящ за работни процеси с малки обеми, при които съхранението на пробите и последователната обработка са от значение. В публикувания работен процес за EV подготовката за протеомика беше извършена с входящ материал от EV, еквивалентен на 5 µg протеин.
Може ли ултразвуковото третиране на микроплаки да подобри възпроизводимостта?
Устройствата за ултразвукова обработка на Hielscher подпомагат възпроизводимостта чрез прилагане на стандартизирани условия за ултразвукова обработка при множество проби. Въпреки това, други фактори, като изолирането на клетки или екзосоми, нормализирането на входните данни, ефективността на разграждането, стабилността на LC-MS/MS, обработката на данните и статистическият анализ, също допринасят за цялостната възпроизводимост в протеомиката.
Подобрява ли ултразвуковата обработка на микроплаки степента на идентифициране на протеините?
Това може да допринесе за по-голяма дълбочина на идентификация, когато разграждането или повторното разтваряне на пробата представляват ограничаващ фактор. Ефектът зависи от вида на пробата, химичните свойства на протеините, стратегията за пречистване, условията на разграждане и ефективността на метода LC-MS/MS.
Какво трябва да се оптимизира, преди работният процес да започне да се използва рутинно?
Ключовите параметри включват входящата проба, състава на буфера или разтворителя, формата на плаката, амплитудата и продължителността на ултразвуковото въздействие, условията на сушене, обема на разграждането, концентрацията на ензима, времето за инкубация и количеството на инжектирания проба за LC-MS/MS. Преди прилагането на работния процес към пълен експериментален набор се препоръчва провеждането на пилотни тестове.
Може ли този работен процес да се използва при DIA протеомиката?
Да. В посочения EV работен процес се използваше независимо от данните събиране на данни, последвано от DIA-NN анализ. Ултразвуковата обработка на микроплаките е част от предварителния процес на подготовка на пробите и може да бъде интегрирана с DIA, DDA или методи за целева протеомика.
Кои показатели за контрол на качеството трябва да се следят?
Препоръчителните показатели за контрол на качеството включват добив на пептиди, брой идентифицирани пептиди и протеинови групи, процент на пропуснато разцепване, разпределение на дължината на пептидите, форма на хроматографските пикове, стабилност на времето на задържане, коефициент на вариация при повторения, пренос и разделяне на биологичните групи чрез PCA или сродни методи.
Какво е основното предимство от използването на моделите соникатори за микроплаки UIP400MTP или UIP550MTP при подготовката на проби за протеомика?
Основното предимство е стандартизираната паралелна обработка на проби с малък обем. Това помага на лабораториите да намалят вариативността, свързана с ръчната работа, и да подготвят сложни биологични проби по по-последователен начин за разграждане, събиране на данни чрез LC-MS/MS и количествен протеомичен анализ.
Устройствата за ултразвукова обработка на микроплаки на Hielscher могат безпроблемно да се интегрират в автоматизирани работни процеси.
Литература / Препратки
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Hielscher Ultrasonics произвежда високоефективни ултразвукови хомогенизатори от лаборатория да индустриален размер.