Ултразвукова обработка в микроплаки за шотгън протеомика – бележка за приложението

Шотгън протеомиката зависи от ефективната и възпроизводима подготовка на пробите за превръщането на сложен биологичен материал в пептиди, готови за LC-MS/MS анализ. Ултразвуковият апарат за микроплаки UIP400MTP подпомага този процес, като позволява стандартизирана, паралелна ултразвукова обработка на проби с малък обем и помага на лабораториите да подобрят разрушаването, екстракцията и повторното разтваряне в работни процеси, базирани на микроплаки. Тази бележка за приложението описва как UIP400MTP може да се интегрира в подготовката на проби за протеомен анализ, като използва публикуван работен процес за извънклетъчни везикули от изследвания на PLA2G12A/Th17 като пример, изпитан в лабораторни условия.

Ултразвукова обработка в микроплаки за по-възпроизводима шотгън протеомика

За изследователите в областта на протеомиката възпроизводимата подготовка на пробите е от решаващо значение за висококачествени LC-MS/MS данни. Ултразвуковият апарат за микроплаки UIP400MTP подпомага стандартизираната, паралелна ултразвукова обработка в работни процеси, базирани на плаки, и в работни процеси с малък обем на пробите и висок капацитет за обработката им.

Той е особено полезен за лаборатории, работещи с:

• Големи набори от проби, които изискват еднаква обработка в множество ямки
• Материал в ограничено изходно количество, при който загубата на проба и вариабилността трябва да бъдат сведени до минимум
• Проби, богати на липиди, като извънклетъчни везикули
• Сложни биологични препарати, които изискват ефективно разрушаване, екстракция или повторно разтваряне
• Сравнителна шотгън протеомика, при която възпроизводимостта между условията и повторенията е от съществено значение

Чрез включване на ултразвукова обработка в микроплаки преди протеолитичното разграждане изследователите могат да подобрят готовността на пробите за:

• Екстракция и повторно разтваряне на протеини
• Разграждане с трипсин/Lys-C
• Събиране на данни чрез Nano-LC/MS/MS
• Последващ количествен протеомен анализ

Ултразвуковата обработка в микроплаки може да бъде полезна за:

• Централни лабораторни звена за протеомика
• Лаборатории за изследване на EV
• Лаборатории по имунология и клетъчна биология
• Групи за транслационни изследвания
• Екипи в областта на науките за живота, които преминават от подготовка на единични проби към работни процеси с по-висок капацитет за обработка на проби

Подготовка на проби с висок капацитет за обработка за анализ на протеома на извънклетъчни везикули

Какво представлява шотгън протеомиката?

Шотгън протеомиката се е превърнала в основна аналитична стратегия за характеризиране на сложни биологични проби – от целоклетъчни лизати и тъканни екстракти до пречистени органели, извънклетъчни везикули и клинични проби с малко изходно количество. Основното ѝ предимство се състои в съчетаването на протеолитично разграждане на протеините, течна хроматография, свързана с тандемна масспектрометрия с висока разделителна способност, и изчислително определяне на протеините въз основа на пептидите. Качеството на крайния набор от протеомни данни обаче се определя много преди пробата да достигне масспектрометъра. Ефективното разрушаване на пробите, разтварянето на протеините, отстраняването на пречещи вещества, възпроизводимото ензимно разграждане и надеждното извличане на пептидите са решаващи за дълбочината на покритие и количествената надеждност.
За изследователите в областта на протеомиката и лабораториите в областта на науките за живота, които работят с ограничени или ценни проби, подготовката на пробите често е ограничаващият етап.

Предизвикателството на извънклетъчните везикули в протеомиката

Извънклетъчните везикули (EV) например представляват особено труден за обработка клас проби. Те са ограничени от мембрана, богати на липиди частици с нанометрични размери, сравнително нисък добив на протеини и висока вероятност за пренасяне на липиди, соли, детергенти, серумни протеини и други компоненти на матрицата. Тези характеристики могат да нарушат ефективността на разграждането, хроматографските показатели, стабилността на електроспрея и идентифицирането на пептидите. Поради това работният процес за подготовка на проби за протеомика на EV трябва да е достатъчно ефективен, за да разруши везикулните структури и да разтвори съдържащите се в тях протеини, като същевременно остане съвместим с последващото ензимно разграждане и LC-MS/MS анализа.
В този контекст ултразвуковата обработка, съвместима с микроплаки, предлага практичен подход за възпроизводима, паралелна обработка на пробите. Моделите ултразвукови апарати за микроплаки на Hielscher UIP400MTP (400 W) и UIP550MTP (550 W) са предназначени за ултразвукова обработка на проби в многоямкови плаки и съдове с малък обем, като поддържат работни процеси с по-висок капацитет за обработка на проби от конвенционалните ултразвукови апарати с една сонда. За лабораториите по протеомика този формат е привлекателен, защото може да намали вариабилността при ръчната работа, да подобри паралелната обработка на множество проби и да се интегрира по-естествено в последователностите за подготовка на проби, базирани на плаки.

Примерен работен процес

Скорошен работен процес за протеомика на извънклетъчни везикули в изследвания на биологията на Th17 клетките, обусловена от PLA2G12A, предоставя полезен пример, изпитан в лабораторни условия, за това как ултразвуковият апарат за микроплаки UIP400MTP може да бъде включен в подготовката на проби за шотгън протеомика. В тази серия от изследвания пробите от EV са обработени за протеомен анализ чрез третиране с метанол, ултразвукова обработка с UIP400MTP, центрофугиране, изсушаване, разграждане с трипсин/Lys-C и LC с нанодебит, свързана с тандемна MS с висока разделителна способност. Биологичното изследване е публикувано през 2026 г. от Mochizuki-Ono и колеги, като протеомният анализ е помогнал да се характеризира как PLA2G12A променя протеините, съдържащи се в EV, в контекста на патогенните Т-клетъчни отговори.

Ултразвуков апарат за многоямкови плаки UIP400MTP

Защо ултразвукова обработка в микроплаки?
UIP400MTP позволява стандартизирана, паралелна ултразвукова обработка на проби с малък обем. Това е полезно, когато възпроизводимостта, малкото изходно количество проба и капацитетът за обработка на множество проби са важни.


Контролен списък за контрол на качеството

• Потвърдете еднакво изходно количество EV, изразено като протеинов еквивалент, за всички проби.
• Използвайте рандомизирани или балансирани схеми на подреждане за обработката на пробите.
• Поддържайте еднакви обем на метанола, време за ултразвукова обработка, време за изсушаване и обем за разграждане.
• Следете добива на пептиди и общия брой идентифицирани протеини.
• Проверявайте честотата на пропуснатите места на разцепване и разпределението на дължините на пептидите.
• Проверявайте формата на хроматографските пикове и възпроизводимостта на времената на задържане.
• Включвайте празни проби за проследяване на пренасянето между пробите.
• Използвайте обединени проби за контрол на качеството (QC) при по-големи изследвания.
• Оценявайте коефициента на вариация между повторенията.
• Използвайте PCA или сродни методи за установяване на ефекти на партидите или отклоняващи се проби.

Препоръки за документиране

При публикуване или документиране на този работен процес посочвайте изходното количество EV, формата на плаката, обема на метанола, амплитудата и времето за ултразвукова обработка с UIP400MTP, условията на центрофугиране, метода на изсушаване, буфера за разграждане, концентрацията на ензима, времето за разграждане, условията на подкиселяване, LC-MS/MS платформата, режима на събиране на данни, версията на софтуера, базата данни, прага за FDR, метода за нормализиране и работния процес за статистически анализ.
Всички ултразвукови апарати за микроплаки на Hielscher автоматично записват важни параметри на процеса, като амплитуда, продължителност на ултразвуковата обработка и температура, с отметка за дата и час като CVS файл върху вградената SD карта. Документирането на данни за възпроизводимост и контрол на качеството никога не е било по-лесно!

Изследването в подробности: шотгън протеомика на EV в изследване на PLA2G12A

Изследването на PLA2G12A предоставя конкретен пример за използването на UIP400MTP в работен процес за шотгън протеомика. Биологичният въпрос е как секретираната фосфолипаза PLA2G12A модифицира извънклетъчните везикули, произхождащи от Th17 клетки, и по този начин влияе върху диференциацията на патогенните Т-клетки. Авторите показват, че PLA2G12A действа върху мембраните на EV, за да образува лизофосфолипиди, включително 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine, и че последващото сигнализиране на лизофосфатидната киселина чрез LPA2 допринася за диференциацията на Th17 клетките. Освен липидното сигнализиране изследванията разглеждат и съдържанието на EV, включително РНК и протеини, което прави шотгън протеомиката важен компонент на стратегията за характеризиране.
В работния процес за подготовка на EV Th17 клетките са култивирани в среда, съдържаща фетален говежди серум с отстранени екзозоми. Супернатантите от културите първо са центрофугирани за отстраняване на клетките, филтрирани през филтър с размер на порите 0,22 µm, концентрирани чрез ултрафилтрация/ултрацентрофугиране, промити, ресуспендирани в PBS и количествено определени чрез BCA анализ за протеини. Тази предварителна подготовка на EV гарантира, че определено количество материал от EV, изразено като протеинов еквивалент, може да бъде въведено в работния процес за протеомен анализ.
За шотгън протеомния анализ авторите използват проби от EV, съответстващи на протеинов еквивалент от 5 µg. Тези проби са изсушени в PCR епруветки и са добавени 25 µL метанол. След това пробите са обработени с ултразвук в продължение на 3 минути с ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP. След ултразвуковата обработка пробите са центрофугирани при 4°C в продължение на 20 минути при 19 000 × g. След отстраняване на 20 µL супернатант пробите са центрофугирани до сухо. След това протеините са разтворени чрез ултразвукова обработка в 4 µL разтвор на трипсин/Lys-C с концентрация 100 ng/µL в 50 mM амониев бикарбонат. Разграждането е проведено в продължение на 2 часа при 37°C с разклащане при 300 rpm. Хидролизатът е подкиселен с 1 µL от 1,25% трифлуорооцетна киселина и подложен на течна хроматография с нанодебит, свързана с тандемна масспектрометрия с висока разделителна способност.
Този работен процес подчертава няколко полезни принципа за протеомика на EV с малко изходно количество. Първо, изходното количество е нормализирано по протеинов еквивалент, което е важно при сравняване на EV от различни генотипове или третирания. Второ, метанолът е използван преди ултразвуковата обработка, като подпомага разрушаването и екстракцията и същевременно избягва системи с детергенти, които могат да усложнят LC-MS/MS. Трето, етапът на ултразвукова обработка е кратък и стандартизиран, което е съвместимо с паралелната обработка на проби. Четвърто, разграждането с трипсин/Lys-C е извършено в много малък обем, което намалява разреждането и подпомага извличането на пептиди при малко изходно количество. Накрая, директният преход от разграждане към подкиселяване и LC-MS/MS свежда до минимум ненужните стъпки на манипулиране.
Последващият LC-MS/MS метод използва обратнофазово разделяне с нанодебит, свързано с масспектрометър Q-Exactive HF Orbitrap. Пробите са задържани върху предколона C18, след което са разделени върху аналитична колона с вътрешен диаметър 50 µm при 200 nL/min и 40°C. Градиентът се изменя от ниско съдържание на органичен разтворител до 35% разтворител B за 60 минути, последвано от промиване при високо съдържание на органичен разтворител и повторно уравновесяване. Събирането на MS данни е извършено в режим на положителни йони чрез независимо от данните събиране на данни с индуцирана чрез сблъсъци дисоциация при по-висока енергия. Необработените DIA файлове са анализирани с DIA-NN 1.8 със спектрална библиотека, предсказана in silico.