Лизис на дрождени клетки в микроплаки чрез ултразвукова обработка с висок интензитет
Микробиолозите и изследователите в областта на науките за живота, които работят със Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii, и с други дрождени системи, познават това предизвикателство: дрождените клетки са устойчиви, постигането на възпроизводим лизис може да бъде трудно, а ръчното разрушаване на пробите бързо се превръща в ограничаващ фактор, когато трябва да се извърши скрининг на много щамове, клонове, условия на култивиране или експресионни конструкти.
Лизис на дрожди с висок капацитет за обработка на проби за микробиология, молекулярна биология и белтъчни анализи
Ултразвуковите апарати за микроплаки на Hielscher, като UIP400MTP (400 W) и UIP550MTP (550 W), предоставят решение с висок капацитет за обработка на проби за механичен лизис на дрождени клетки директно в микроплаки. Вместо пробите да се обработват една по една със сонда, цели микроплаки могат да бъдат подложени на ултразвукова обработка при еднакви условия. Това прави ултразвуковия лизис на дрожди по-бърз, по-възпроизводим и по-лесен за интегриране в съвременните работни процеси в микробиологията, експресията на белтъци, ензимния скрининг и омикс изследванията.
Независимо дали трябва да освободите рекомбинантни белтъци от P. pastoris, да подготвите дрождени лизати за ензимни анализи, да разрушите S. cerevisiae за белтъчен анализ или да извършите паралелен скрининг на десетки дрождени клонове, ултразвуковите апарати за микроплаки на Hielscher осигуряват мощно разрушаване на клетките чрез кавитация с прецизен контрол на процеса.
Нуждаете се от възпроизводим лизис на S. cerevisiae, P. pastoris, или други дрождени щамове в микроплаки? Посочете ни формата на плаката, обема на пробата, клетъчната плътност и целевия аналит. Ще ви помогнем да определите подходящи параметри на ултразвуковата обработка за вашия работен процес с UIP400MTP или UIP550MTP.
Ултразвуков апарат за многоямкови плаки на Hielscher за лизис на дрожди – подготовка на проби с висок капацитет за обработка
Защо дрождените клетки изискват ефективен механичен лизис
Дрождените клетки се лизират по-трудно от много бактериални клетки или клетки на бозайници, защото са защитени от твърда клетъчна стена, съставена главно от полизахариди, глюкани, манопротеини и хитин. Тази клетъчна стена осигурява механична стабилност, но също така ограничава освобождаването на вътреклетъчни белтъци, нуклеинови киселини, метаболити и ензими.
Конвенционалните методи за лизис на дрожди включват механично разбиване с микросфери, ензимно разграждане, цикли на замразяване и размразяване, химичен лизис и ултразвукова обработка със сонда. Тези методи могат да бъдат ефективни, но имат и ограничения. Разбиването с микросфери може да внесе частици и да доведе до нагряване, ензимното разграждане може да увеличи разходите и вариабилността, а ултразвуковата обработка със сонда на отделни проби отнема много време, когато трябва да се обработи голям брой проби.
Фокусираната ултразвукова кавитация с висок интензитет преодолява тези ограничения, като подлага дрождената суспензия на силни механични сили на срязване, колебания на налягането и микропотоци. Резултатът е бързо разрушаване на клетъчните стени и мембрани, подобрено освобождаване на вътреклетъчните компоненти и подготовка на проби в плаки с висока възпроизводимост.
Ултразвукова обработка в микроплаки за паралелна подготовка на дрождени проби
Hielscher UIP400MTP и UIP550MTP са предназначени за равномерна ултразвукова обработка на микроплаки, многоямкови плаки, PCR плаки и подходящи стативи за проби. За разлика от ултразвуковата обработка със сонда, пробите не е необходимо да се обработват поотделно. Цялата плака се подлага на контролирана ултразвукова енергия, което прави работния процес особено подходящ за паралелна обработка на проби.
Това е особено полезно за:
- Скрининг на мутанти или експресионни щамове на S. cerevisiae
- Лизис на клонове на P. pastoris / K. phaffii след експресия на рекомбинантни белтъци
- Подготовка на дрождени лизати за ензимни анализи
- Екстракция на белтъци за SDS-PAGE, Western blot, ELISA, LC-MS/MS или изпитване на активността
- Освобождаване на вътреклетъчни метаболити за метаболомика
- Подготовка на ДНК и РНК проби след подходящо последващо пречистване
- Оптимизиране на лизисни буфери, добавки и условия на екстракция с висок капацитет за обработка на проби
Как ултразвуковата кавитация разрушава дрождените клетки
По време на ултразвуковата обработка фокусиран ултразвук с висока мощност генерира редуващи се цикли на сгъстяване и разреждане в течната проба. При достатъчен интензитет тези колебания на налягането създават акустична кавитация. Кавитационните мехурчета се образуват, осцилират и колабират, като създават локализирани сили на срязване, микроструи, турбулентност и силни градиенти на налягането.
В дрождените суспензии тези механични ефекти отслабват и разкъсват клетъчната стена и клетъчната мембрана. Вътреклетъчните белтъци, ензими, нуклеинови киселини и метаболити се освобождават в лизисния буфер. Тъй като процесът е механичен, той може да се използва с множество различни буферни системи и може да се комбинира с протеазни инхибитори, редуциращи агенти, детергенти, соли или щадяща предварителна ензимна обработка.
Общ протокол: лизис на дрождени клетки в микроплаки
Следният протокол предоставя практическа отправна точка за лизис на дрожди с ултразвуковия апарат за микроплаки Hielscher UIP400MTP или UIP550MTP. Параметрите трябва да бъдат оптимизирани според дрождения щам, клетъчната плътност, целевата молекула, състава на буфера, типа плака и последващия анализ.
1. Съберете и промийте дрождените клетки
Култивирайте Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces или друг дрожден щам при желаните условия на култивиране. Съберете клетките чрез центрофугиране и отстранете хранителната среда. Промийте утайката със студена дестилирана вода, PBS или избрания лизисен буфер, за да отстраните остатъчните компоненти на средата, които могат да попречат на последващия анализ.
За екстракция на белтъци поддържайте пробите студени и работете бързо. Ако протеазите представляват проблем, охладете предварително всички буфери и консумативи.
2. Ресуспендирайте клетъчната утайка
Ресуспендирайте дрождената утайка в подходящ студен лизисен буфер. За ефективно освобождаване на белтъците високата клетъчна плътност често е предимство. Като отправна точка използвайте приблизително 10–20% w/v влажна клетъчна утайка или гъста суспензия, съответстваща на OD600 > 10, в зависимост от анализа.
Типичният лизисен буфер за извличане на белтъци от дрожди може да съдържа:
- буферна система, като Tris-HCl, фосфатен буфер или HEPES
- сол, като NaCl или KCl
- коктейл от протеазни инхибитори
- по избор редуциращ агент, като DTT или β-меркаптоетанол
- по избор детергент, като Triton X-100, NP-40, SDS или CHAPS, в зависимост от съвместимостта с последващите процедури
- по избор фосфатазни инхибитори за изследвания на фосфорилирането
За трудни за лизиране дрождени щамове или за много щадяща екстракция на белтъци преди ултразвуковата обработка може да се използва кратка предварителна обработка със Zymolyase, Lyticase или друг ензим, разграждащ клетъчната стена. Тази предварителна ензимна обработка е незадължителна, но може да подобри ефективността на лизиса или да намали необходимия ултразвуков интензитет.
3. Прехвърлете пробите в подходяща микроплака
Разпределете дрождената суспензия в микроплака, съвместима с ултразвукова обработка. Често се предпочитат плаки с ямки със заоблено дъно, защото подобряват събирането на пробите и намаляват мъртвите зони. Използвайте еднакви обеми на пробите във всички ямки, за да подобрите възпроизводимостта.
Запечатайте плаката с подходяща уплътняваща подложка или фолио, за да предотвратите изпаряване, образуване на аерозоли и кръстосано замърсяване. Уверете се, че уплътнението е съвместимо с избраната температура и условията на ултразвукова обработка.
Типичните работни обеми зависят от формата на плаката и приложението. Обичайните формати включват плаки с 96 ямки, плаки с дълбоки ямки, PCR плаки или подходящи стативи за епруветки.
4. Осигурете охлаждане
Лизисът на дрожди изисква висок ултразвуков интензитет, а механичното разрушаване генерира топлина. Поради това контролът на температурата е критично важен, особено при анализ на белтъци, ензими, РНК или фосфорилиране.
Използвайте подходяща стратегия за охлаждане, като:
- предварително охладен лизисен буфер
- предварително охладени микроплаки
- паузи за охлаждане между интервалите на ултразвукова обработка
- външно охлаждане на платформата за ултразвукова обработка, когато е приложимо
Целта е пробата да се поддържа достатъчно студена, за да се предотвратят денатурация на белтъците, инактивиране на ензимите, разграждане на РНК и вариабилност на пробите, предизвикана от нагряването.
5. Подложете дрождената суспензия на ултразвукова обработка
Поставете запечатаната плака в ултразвуковия апарат за микроплаки Hielscher UIP400MTP или UIP550MTP и изберете програма за импулсна ултразвукова обработка. Препоръчва се импулсен режим, защото той позволява механично разрушаване през фазите на включване и отвеждане на топлината през фазите на изключване.
Като отправна точка за лизис на дрождени клетки:
| Параметър | Препоръчителен начален диапазон | Цел |
|---|---|---|
| Амплитуда | 60–100% | Висок интензитет на кавитацията за устойчиви дрождени клетки |
| Импулсен режим | 10–30 sec включено / 30–60 sec изключено | Ефективен лизис с контролирано натрупване на топлина |
| Сумарно време на включване | 5–15 min | Настройте според щама, плътността и целевата молекула |
| Температура | Поддържайте пробите студени | Защитете белтъците, ензимите, РНК и метаболитите |
| Запечатване на плаката | Препоръчително | Предотвратява изпаряване, образуване на аерозоли и кръстосано замърсяване |
За суспензии от силно устойчиви дрожди, гъста биомаса от P. pastoris или трудна екстракция на рекомбинантни белтъци увеличавайте сумарното време на включване поетапно. За топлочувствителни белтъци или ензимни анализи използвайте по-кратки импулси, по-дълги паузи за охлаждане и по-ниска начална амплитуда.
Лизис на дрожди с висок капацитет за обработка на проби в многоямкови плаки с UIP400MTP
6. Избистрете лизата
След ултразвуковата обработка центрофугирайте микроплаката или прехвърлете пробите в епруветки за центрофугиране. Отстранете клетъчните остатъци чрез центрофугиране при подходяща скорост и температура. Съберете супернатанта за последващ анализ.
В зависимост от приложението лизатът може да се използва за:
- количествено определяне на белтъци
- анализи на ензимната активност
- SDS-PAGE и Western blot
- ELISA и имуноанализи
- LC-MS/MS протеомика
- анализ на метаболити
- пречистване на ДНК или РНК
7. Оптимизирайте и документирайте метода
За възпроизводим лизис на дрожди документирайте всички съществени параметри, включително щама, условията на култивиране, OD600, влажната клетъчна маса, състава на буфера, типа плака, обема на пробата, амплитудата, импулсния цикъл, сумарното време на включване, метода на охлаждане и крайната температура на пробата.
Ако ултразвуковият апарат на Hielscher е оборудван с автоматично записване на данни, данните за процеса могат да се използват за документиране, разработване на метода, увеличаване на мащаба и контрол на качеството.
Съвети за оптимизиране на лизиса на дрожди
За максимално освобождаване на белтъци използвайте гъсти дрождени суспензии, висок ултразвуков интензитет и достатъчно сумарно време на включване. За чувствителни белтъци намалете амплитудата, удължете паузите за охлаждане и поддържайте плаката студена през цялата обработка.
Ако лизисът е непълен, увеличавайте времето на ултразвукова обработка поетапно, изпробвайте предварителна ензимна обработка, намалете вискозитета на пробата или оптимизирайте буфера. Ако белтъците се разграждат или губят активност, подобрете охлаждането, съкратете интервалите на включване, добавете инхибитори и проверете дали детергентната система е съвместима с целевия белтък.
Тъй като дрождените щамове се различават съществено по структурата на клетъчната стена, фазата на растеж, експресионната система и плътността на биомасата, се препоръчва кратка матрица за оптимизиране. Например изпробвайте три амплитуди, два импулсни цикъла и две общи времена на включване, след което оценете ефективността на лизиса и целостта на белтъците.
Независимо дали обработвате няколко плаки за анализи или извършвате скрининг на дрожди с висок капацитет за обработка на проби, Hielscher може да ви помогне да изберете подходящия ултразвуков апарат за микроплаки и да разработите надежден протокол за лизис. Свържете се с нас и посочете дрождения си щам, работния си процес и изискванията си за капацитет за обработка на проби!
Предимства на ултразвуковите апарати за микроплаки на Hielscher за лизис на дрожди
Ултразвуковите апарати за микроплаки на Hielscher са идеални за лаборатории, които се нуждаят от възпроизводим лизис на множество проби. Те премахват бавната обработка на пробите една по една при ултразвукова обработка със сонда и намаляват вариабилността, причинена от ръчното позициониране на сондата, дълбочината на потапяне и разликите в манипулациите между отделните проби.
Основните предимства включват:
- Висок капацитет за обработка на проби: Подлагайте множество дрождени проби на паралелна ултразвукова обработка в микроплаки или съвместими стативи за проби.
- Възпроизводими условия: Еднакви условия на ултразвукова обработка във всички ямки за равномерни, сравними резултати от лизиса.
- Без кръстосано замърсяване чрез сондата: Пробите остават запечатани по време на ултразвуковата обработка, което намалява пренасянето на материал между пробите и стъпките за почистване.
- Подходящи за устойчиви клетки: Ултразвукът с висок интензитет подпомага разрушаването на клетъчните стени на дрождите.
- Ефективен работен процес: Идеални за скрининг на щамове, клонове, условия на експресия и лизисни буфери.
- Ефективен работен процес: Програмируеми настройки, автоматизирано записване на данни и пригодност за лабораторна автоматизация.
Приложения в дрождените биотехнологии и изследванията в областта на науките за живота
Ултразвуковият лизис на дрожди в микроплаки подпомага множество изследователски и скринингови работни процеси. При експресия на рекомбинантни белтъци клонове на P. pastoris и S. cerevisiae могат да бъдат лизирани паралелно, за да се сравнят нивата на експресия или ензимната активност. В системната биология и омикс изследванията стандартизираният лизис подобрява сравнимостта между различните условия. В микробиологията ултразвуковата обработка подпомага бързата подготовка на лизати от множество щамове, условия на хранителната среда или стресови въздействия.
Типичните области на приложение включват:
- екстракция на белтъци от дрожди
- скрининг на рекомбинантни белтъци
- скрининг на ензимната активност
- селекция на клонове след трансформация
- оптимизиране на ферментацията
- подготовка на проби за протеомика
- подготовка на проби за метаболомика
- изследвания на разрушаването на клетъчната стена
- микробиологични анализи с висок капацитет за обработка на проби
Надеждният лизис на дрожди започва с контролирана ултразвукова обработка
Лизисът на дрожди може да бъде труден, когато броят на пробите се увеличава, но ултразвуковите апарати за микроплаки на Hielscher правят процеса по-бърз, по-чист и по-възпроизводим. UIP400MTP и UIP550MTP позволяват на изследователите да обработват цели плаки при определени ултразвукови условия, като увеличават капацитета за обработка на проби и същевременно намаляват ръчните манипулации.
За микробиолозите, молекулярните биолози, изследователите на белтъци и биотехнологичните лаборатории ултразвуковата обработка в микроплаки е мощен инструмент за ефективно и възпроизводимо освобождаване на вътреклетъчни компоненти от дрожди.
Често задавани въпроси за лизиса на дрождени клетки чрез ултразвукова обработка в микроплаки
Могат ли дрождените клетки да бъдат лизирани чрез ултразвукова обработка?
Да. Дрождените клетки, като Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris, могат да бъдат лизирани чрез ултразвукова обработка с висок интензитет. Ултразвуковата кавитация генерира силни механични сили на срязване, които разрушават клетъчната стена и мембраната на дрождите, освобождавайки белтъци, ензими, нуклеинови киселини и метаболити.
Защо дрождените клетки се лизират по-трудно от бактериалните клетки?
Дрождените клетки имат дебела и механично устойчива клетъчна стена, съставена главно от глюкани, манопротеини и хитин. Тази твърда структура прави дрождите по-трудни за разрушаване от много бактериални клетки или клетки на бозайници. Поради това лизисът на дрожди обикновено изисква по-висок интензитет, по-продължителна обработка или незадължителна предварителна ензимна обработка.
Кои ултразвукови апарати на Hielscher са подходящи за лизис на дрожди в микроплаки?
Hielscher UIP400MTP и UIP550MTP са подходящи за лизис на дрожди в микроплаки с висок капацитет за обработка на проби. UIP400MTP е идеален за рутинна паралелна подготовка на проби, докато UIP550MTP осигурява по-висока ултразвукова мощност за взискателни задачи по лизис, гъсти суспензии и устойчиви дрождени щамове.
Може ли Pichia pastoris да бъде лизирана в ултразвуков апарат за микроплаки?
Да. Pichia pastoris, известна също като Komagataella phaffii, може да бъде лизирана чрез ултразвукова обработка с висок интензитет в микроплаки. Тъй като P. pastoris може да образува гъста биомаса и има устойчива клетъчна стена, се препоръчва оптимизиране на амплитудата, импулсния цикъл, охлаждането и общото време на ултразвукова обработка.
Какви са типичните параметри на ултразвукова обработка за лизис на дрожди?
Полезен начален диапазон е 50–80% амплитуда, импулсен режим, например 10–30 секунди включено и 30–60 секунди изключено, и 5–15 минути сумарно време на включване. Точните параметри зависят от дрождения щам, клетъчната плътност, обема на пробата, типа плака, буфера и целевата молекула.
Защо лизисът на дрожди трябва да се извършва в импулсен режим?
Импулсният режим намалява натрупването на топлина по време на ултразвуковата обработка. През фазата на включване ултразвуковата кавитация разрушава клетките. През фазата на изключване пробата може да се охлади. Това е важно, защото прекомерното нагряване може да денатурира белтъците, да намали ензимната активност, да разгради РНК и да компрометира възпроизводимостта.
Необходима ли е предварителна ензимна обработка преди ултразвуковата обработка на дрождени клетки?
Предварителната ензимна обработка невинаги е необходима, но може да подобри ефективността на лизиса. Ензими като Zymolyase или Lyticase частично разграждат клетъчната стена на дрождите и могат да намалят ултразвуковия интензитет или времето, необходими за пълен лизис. Това може да е полезно за чувствителни белтъци или трудни за лизиране щамове.
Как може да се предотврати прегряването по време на ултразвуковата обработка на дрожди?
Използвайте предварително охладени буфери, импулсен режим, паузи за охлаждане и охладена система за плаката. Поддържайте микроплаката запечатана и следете температурата, когато е възможно. За чувствителни белтъци използвайте по-кратки интервали на включване, по-дълги интервали на изключване и обработвайте пробите при ниска температура.
Може ли ултразвуковата обработка в микроплаки да замени разбиването с микросфери при лизис на дрожди?
В много работни процеси – да. Ултразвуковата обработка в микроплаки може да замени разбиването с микросфери, когато е необходим чист, възпроизводим и паралелен лизис. Тя премахва необходимостта от работа с микросфери, опростява използването на консумативи и улеснява автоматизацията. Всяко приложение обаче трябва да бъде валидирано чрез сравняване на добива при лизиса, целостта на белтъците и показателите на анализа.
Подходяща ли е ултразвуковата обработка в микроплаки за екстракция на белтъци от дрожди?
Да. Ултразвуковата обработка в микроплаки е много подходяща за екстракция на белтъци от дрожди, особено когато трябва да се сравнят множество клонове или условия на култивиране. Протеазните инхибитори, студените буфери и контролираните настройки на импулсния режим помагат да се запази качеството на белтъците.
Може ли един и същ метод да се използва за екстракция на ДНК, РНК и белтъци?
Може да се използва един и същ основен принцип на ултразвукова обработка, но буферът и условията на процеса трябва да бъдат адаптирани към целевата молекула. Работните процеси за белтъци изискват инхибиране на протеазите и контрол на температурата. Работните процеси за РНК изискват работа без РНази и интензивно охлаждане. Работните процеси за ДНК може да изискват различни условия на лизис и пречистване в зависимост от това дали се цели получаване на интактна геномна ДНК или фрагментирана ДНК.
Какъв тип плака трябва да се използва за лизис на дрожди?
Използвайте микроплака или плака с дълбоки ямки, съвместима с ултразвукова обработка и с подходящо запечатване. Плаките с ямки със заоблено дъно често са полезни за работа със суспензии. Плаката трябва да издържа на избраните условия на ултразвукова обработка, температурата на пробата и стъпките на центрофугиране.
Как да разбера дали лизисът на дрожди е пълен?
Ефективността на лизиса може да се провери чрез микроскопия, добива на белтъци, ензимната активност, намаляването на вискозитета, SDS-PAGE анализ, добива на ДНК/РНК или сравнение с известен метод за лизис. При разработване на метода оценявайте както добива, така и качеството на освободената целева молекула.
UIP400MTP или UIP550MTP: кой ултразвуков апарат за микроплаки да изберете?
UIP400MTP е мощен ултразвуков апарат за микроплаки за рутинна подготовка на проби с висок капацитет за обработка, включително лизис на дрожди, екстракция на белтъци, срязване на ДНК, отделяне на биофилми и подготовка за анализи. Той е подходящ за лаборатории, които се нуждаят от възпроизводима ултразвукова обработка в стандартни формати на плаки.
UIP550MTP осигурява по-висока ултразвукова мощност и се препоръчва, когато по-взискателни приложения изискват по-висок акустичен интензитет, по-кратко време за обработка, по-голямо натоварване с проби или по-интензивни условия на разрушаване. За лизис на дрожди UIP550MTP е особено полезен при гъста биомаса, трудни за лизиране щамове, по-големи работни обеми и скрининг на експресията с висок капацитет за обработка на проби.
Може ли лизисът на дрожди чрез ултразвукова обработка в микроплаки да бъде автоматизиран?
Да. Ултразвуковата обработка в микроплаки е много подходяща за автоматизирани лабораторни работни процеси, защото пробите остават в плаки. Това подпомага интегрирането със системи за пипетиране, манипулиране на плаки, центрофугиране, подготовка за анализи и работни процеси за скрининг с висок капацитет за обработка на проби.
Литература / Източници
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics 2024.
