Лизис на дрождови клетки в микроплаки чрез ултразвукова обработка с висока интензивност

Микробиолози и изследователи в областта на биологичните науки, работещи с Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii, а и при други системи с дрожди това е добре известно: дрождовите клетки са устойчиви, постигането на възпроизводима лизис може да се окаже трудно, а ръчното разбиване на пробите бързо се превръща в пречка, когато трябва да се провери голям брой щамове, клони, условия на култивиране или експресионни конструкции.

Лизис на дрожди с висока производителност за микробиология, молекулярна биология и протеинов анализ

Ултразвуковите апарати за микроплаки на Hielscher, като моделите UIP400MTP (400 W) и UIP550MTP (550 W), предлагат решение с висока производителност за механична лизис на дрождови клетки директно в микроплаки. Вместо да се обработват пробите една по една със сонда, цели микроплаки могат да бъдат подложени на ултразвукова обработка при еднакви условия. Това прави ултразвуковата лизис на дрождови клетки по-бърза, по-възпроизводима и по-лесна за интегриране в съвременните работни процеси в микробиологията, експресията на протеини, скрининга на ензими и омичните изследвания.
Независимо дали трябва да извлечете рекомбинантни протеини от P. pastoris, да подготвите лизати от мая за ензимни анализи, да разрушите клетките на S. cerevisiae за протеинов анализ или да провеждате паралелен скрининг на десетки клони от мая, ултразвуковите апарати за микроплаки на Hielscher осигуряват мощно разрушаване на клетките чрез кавитация с прецизен контрол на процеса.

Защо дрождовите клетки се нуждаят от ефективна механична лиза

Клетките на дрождите се лизират по-трудно в сравнение с много бактериални или бозайнически клетки, тъй като са защитени от твърда клетъчна стена, състояща се предимно от полизахариди, глюкани, маннопротеини и хитин. Тази клетъчна стена осигурява механична стабилност, но също така ограничава освобождаването на вътреклетъчни протеини, нуклеинови киселини, метаболити и ензими.
Обичайните методи за лизис на дрожди включват разбиване с микросфери, ензимно разграждане, цикли на замразяване и размразяване, химичен лизис и ултразвукова обработка със сонди. Тези методи могат да бъдат ефективни, но имат и своите ограничения. Разбиването с перли може да доведе до образуване на отломки и загряване, ензимното разграждане може да повиши разходите и да доведе до вариабилност, а ултразвуковата обработка с сонда на единични проби отнема много време, когато трябва да се обработват големи количества проби.
Високоинтензивната, фокусирана ултразвукова кавитация преодолява тези ограничения чрез прилагане на силни механични срязващи сили, колебания на налягането и микропотоци върху суспензията от дрожди. Резултатът е бързо разрушаване на клетъчните стени и мембрани, подобрено вътреклетъчно освобождаване и подготовка на проби с висока възпроизводимост във формат на плаки.

Ултразвукова обработка на микроплаки за паралелна подготовка на проби от мая

Устройствата Hielscher UIP400MTP и UIP550MTP са предназначени за равномерно ултразвуково третиране на микроплаки, мултикулонови плаки, PCR-плаки и подходящи стойки за проби. За разлика от ултразвуковото третиране със сонда, пробите не се налага да се обработват поотделно. Цялата плака се подлага на контролирана ултразвукова енергия, което прави този работен процес изключително подходящ за паралелна обработка на проби.

Това е особено полезно за:

• Скрининг Пекарска мая мутанти или щамове за експресия
• Лизис на Бащата на пастора / K. phaffii клони след експресия на рекомбинантен протеин
• Приготвяне на лизати от мая за ензимни анализи
• Извличане на протеини за SDS-PAGE, Western blot, ELISA, LC-MS/MS или тестване на активността
• Освобождаване на вътреклетъчни метаболити за метаболомика
• Подготовка на проби от ДНК и РНК след подходящо последващо пречистване
• Оптимизация с висока производителност на буферите за лизис, добавките и условията за екстракция

Как ултразвуковата кавитация разрушава дрождовите клетки

По време на ултразвуковата обработка фокусираният ултразвук с висока мощност генерира редуващи се цикли на сгъстяване и разреждане в течната проба. При достатъчна интензивност тези колебания на налягането предизвикват акустична кавитация. Кавитационните мехурчета се образуват, колебаят се и се разрушават, като създават локализирани срязващи сили, микроструи, турбулентност и силни налягателни градиенти.
В суспензиите от мая тези механични въздействия отслабват и разрушават клетъчната стена и клетъчната мембрана. Вътреклетъчните протеини, ензими, нуклеинови киселини и метаболити се освобождават в лизисния буфер. Тъй като процесът е механичен, той може да се използва с много различни буферни системи и да се комбинира с инхибитори на протеази, редуциращи агенти, детергенти, соли или лека ензимна предварителна обработка.

Общ протокол: Лизис на дрождови клетки в микроплаки

Следващият протокол предоставя практическа отправна точка за лизис на дрожди с помощта на соникатора за микроплаки Hielscher UIP400MTP или UIP550MTP. Параметрите трябва да бъдат оптимизирани в зависимост от щама на дрождите, клетъчната плътност, целевата молекула, състава на буфера, типа на плаката и последващия анализ.

1. Събиране и измиване на дрождови клетки

Отгледайте Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces или друг щам дрожди при желаните условия на култивиране. Изолирайте клетките чрез центрофугиране и отстранете културалната среда. Измийте утайката със студена дестилирана вода, PBS или избрания лизисен буфер, за да отстраните остатъчните компоненти на средата, които могат да повлияят на последващия анализ.
За извличане на протеини поддържайте пробите охладени и работете бързо. Ако съществува риск от протеази, предварително охладете всички буфери и консумативи.

2. Разбъркайте клетъчния преципитат

Ресуспендирайте утайката от дрожди в подходящ студен лизисен буфер. За ефективно освобождаване на протеини често е предимство да се използва висока клетъчна плътност. Като отправна точка използвайте приблизително 10–20 % (тегло/обем) влажна клетъчна утайка или гъста суспензия, съответстваща на OD₆₀₀ > 10, в зависимост от теста.

Типичен буфер за лизис на дрождови протеини може да съдържа:

• буферна система, като например Tris-HCl, фосфатен буфер или HEPES
• сол, като например NaCl или KCl
• коктейл от инхибитор на протеазата
• незадължителен редуктор, като например DTT или β-меркаптоетанол
• по избор детергент като Triton X-100, NP-40, SDS или CHAPS, в зависимост от съвместимостта с последващите етапи
• незадължителни инхибитори на фосфатазата за изследвания на фосфорилирането

При трудни щамове дрожди или при необходимост от много щадящо извличане на протеини може да се приложи кратка предварителна обработка с Zymolyase, Lyticase или друг ензим, разграждащ клетъчната стена, преди ултразвуковата обработка. Тази ензимна предварителна обработка не е задължителна, но може да подобри ефективността на лизиса или да намали необходимата интензивност на ултразвука.

3. Прехвърлете пробите в подходяща микроплака

Пресипете суспензията с мая в микроплака, подходяща за ултразвукова обработка. Често се предпочитат плаки с кръгло дъно, тъй като те подобряват събирането на пробите и намаляват мъртвите зони. Използвайте еднакви обеми на пробите във всички лунки, за да подобрите възпроизводимостта.
Запечатайте плаката с подходяща уплътнителна подложка или фолио, за да предотвратите изпаряване, образуване на аерозоли и кръстосано замърсяване. Уверете се, че уплътнението е съвместимо с избраните условия за температура и ултразвукова обработка.
Типичните работни обеми зависят от формата на плаките и приложението. Сред често срещаните формати са плаките с 96 лунки, плаките с дълбоки лунки, ПЦР-плаките или подходящите стелажи за епруветки.

4. Настройка на охлаждането

Лизисът на дрождите изисква висока интензивност на ултразвука, а механичното разграждане генерира топлина. Поради това контролът на температурата е от решаващо значение, особено при анализа на протеини, ензими, РНК или фосфорилиране.

Използвайте подходяща стратегия за охлаждане, като например:

• предварително охладен буфер за лизис
• предварително охладени микроплаки
• паузи за охлаждане между интервалите на ултразвукова обработка
• външно охлаждане на платформата за ултразвукова обработка, когато е приложимо

Целта е пробата да се поддържа достатъчно студена, за да се предотврати денатурацията на протеините, инактивирането на ензимите, разграждането на РНК и промените в пробата, предизвикани от топлината.

5. Подложете суспензията от мая на ултразвукова обработка

Поставете запечатаната плака в ултразвуковия апарат за микроплаки Hielscher UIP400MTP или UIP550MTP и изберете програма за импулсно ултразвуково третиране. Препоръчва се импулсното третиране, тъй като то позволява механично разграждане по време на фазите „ON“ и отвод на топлината по време на фазите „OFF“.
Като отправна точка за лизиса на дрождови клетки:

При силно устойчиви дрождови суспензии, гъста биомаса от P. pastoris или трудна екстракция на рекомбинантни протеини, увеличавайте кумулативното време на включване поетапно. При термочувствителни протеини или ензимни анализи използвайте по-къси импулси, по-дълги паузи за охлаждане и по-ниска начална амплитуда.

Лизис на дрожди с висока производителност в мултикулонови плаки с помощта на UIP400MTP

6. Пречистване на лизата

След ултразвукова обработка центрофугирайте микроплатката или прехвърлете пробите в епруветки за центрофугиране. Отстранете клетъчните остатъци чрез центрофугиране при подходяща скорост и температура. Съберете супернатантата за последващ анализ.

В зависимост от приложението лизатът може да се използва за:

• Количествено определяне на протеина
• тестове за ензимна активност
• SDS-PAGE и Уестърн блот
• ELISA и имунологични тестове
• LC-MS/MS протеомика
• анализ на метаболитите
• Пречистване на ДНК или РНК

7. Оптимизиране и документиране на метода

За да се осигури възпроизводимост при лизиса на дрождите, документирайте всички значими параметри, включително щам, условия на култивиране, ОД₆₀₀, масата на мократа клетка, съставът на буфера, типът на плаката, обемът на пробата, амплитудата, импулсният цикъл, кумулативното време на включване, методът на охлаждане и крайната температура на пробата.
Ако ултразвуковият апарат на Hielscher е снабден с функция за автоматично записване на данни, данните от процеса могат да се използват за документиране, разработване на методи, мащабиране и контрол на качеството.

Съвети за оптимизиране на лизиса на дрождите

За максимално освобождаване на протеини използвайте гъсти малцови суспензии, висока ултразвукова интензивност и достатъчно кумулативно време на включване. При чувствителни протеини намалете амплитудата, удължете паузите за охлаждане и поддържайте плаката студена през целия цикъл.
Ако лизисът е непълноценен, увеличете постепенно времето за ултразвукова обработка, опитайте ензимна предварителна обработка, намалете вискозитета на пробата или оптимизирайте буфера. Ако протеините се разграждат или губят активност, подобрете охлаждането, съкратете интервалите на включване (ON), добавете инхибитори и проверете дали системата от детергенти е съвместима с целевия протеин.
Тъй като щамовете дрожди се различават съществено по отношение на структурата на клетъчната стена, фазата на растеж, системата за експресия и плътността на биомасата, се препоръчва използването на кратка матрица за оптимизация. Например, тествайте три амплитуди, два импулсни цикъла и две общо време на включване, след което оценете ефективността на лизиса и целостта на протеините.

Предимства на ултразвуковите апарати за микроплаки на Hielscher при лизиса на дрожди

Устройствата за ултразвукова обработка на микроплаки на Hielscher са идеални за лаборатории, в които е необходима възпроизводима лизис на голям брой проби. Те премахват бавната обработка на пробите една по една, характерна за ултразвуковата обработка със сонда, и намаляват вариативността, причинена от ръчното позициониране на сондата, дълбочината на потапяне и разликите в обработката на отделните проби.

Основните предимства включват:

• Обработка с висока производителност: Обработете с ултразвук множество проби от мая едновременно в микроплаки или съвместими стойки за проби.
• Условия за възпроизвеждане: Еднакви условия на ултразвукова обработка във всички лунки за получаване на еднородни и съпоставими резултати от лизиса.
• Няма кръстосано замърсяване на сондата: Пробите остават запечатани по време на ултразвуковата обработка, което намалява пренасянето на замърсявания и броя на етапите на почистване.
• Подходящо за устойчиви клетки: Ултразвукът с висока интензивност спомага за разрушаването на клетъчните стени на дрождите.
• Ефективен работен процес: Идеален за скрининг на щамове, клони, условия за експресия и буфери за лизис.
• Ефективен работен процес: Програмируеми настройки, автоматично записване на данни и подходящ за лабораторна автоматизация.

Приложения в биотехнологията на дрождите и научните изследвания в областта на биологичните науки

Ултразвуковата лизис на дрожди в микроплаки подпомага много изследователски и скринингови работни процеси. При експресията на рекомбинантни протеини клони от P. pastoris и S. cerevisiae могат да бъдат подложени на лизис паралелно, за да се сравнят нивата на експресия или ензимната активност. В системната биология и омиката стандартизираната лиза подобрява съпоставимостта при различни условия. В микробиологията ултразвуковата обработка подпомага бързото получаване на лизати от различни щамове, условия на култивиране или стресови обработки.
Типичните области на приложение включват:

• екстракция на протеини от мая
• скрининг на рекомбинантни протеини
• скрининг на ензимната активност
• подбор на клони след трансформация
• оптимизиране на ферментацията
• подготовка на проби за протеомика
• подготовка на проби за метаболомика
• изследвания на разрушаването на клетъчната стена
• микробиологични тестове с висока производителност

Надеждното разграждане на дрождите започва с контролирано ултразвуково третиране

Лизисът на дрождите може да се окаже труден при увеличаване на броя на пробите, но ултразвуковите апарати за микроплаки на Hielscher правят процеса по-бърз, по-чист и с по-висока възпроизводимост. Моделите UIP400MTP и UIP550MTP позволяват на изследователите да обработват цели плаки при определени ултразвукови условия, като подобряват производителността и същевременно намаляват необходимостта от ръчна работа.
За микробиолозите, молекулярните биолози, изследователите в областта на протеините и биотехнологичните лаборатории ултразвуковата обработка на микроплаки е мощен инструмент за ефективно и възпроизводимо извличане на вътреклетъчни компоненти от дрожди.

Литература / Препратки