Протокол за използване на ултразвукови устройства Hielscher за множество проби при анализ на биофилми и протеомен анализ

Използването на ултразвукови устройства за множество проби, като VialTweeter за множество епруветки и UIP400MTP за микроплаки, оптимизира лабораторните работни процеси при приложения с висок капацитет за обработка на проби. И двете устройства позволяват прецизна и равномерна ултразвукова обработка на множество проби, като свеждат до минимум вариабилността и подобряват възпроизводимостта. Това е особено полезно при експерименти, изискващи лизис на пробите, отделяне на биофилми, извличане на протеини или протеолитично разграждане с постоянни резултати, при които ръчните методи или методите за обработка на единични проби са по-малко ефективни и склонни да дават непостоянни резултати.

Оптимизирайте работните процеси с ултразвукови устройства за множество проби

UIP400MTP например позволява едновременна ултразвукова обработка на ямките на микроплаки, като осигурява равномерно отделяне на биофилми или клетъчен материал. Същевременно VialTweeter осигурява прецизен лизис и хомогенизация на множество проби в епруветки без кръстосано замърсяване. Тези ултразвукови устройства значително съкращават времето за обработка, подобряват възпроизводимостта на експериментите и запазват целостта на пробите в голяма степен, което ги прави незаменими инструменти в изследванията по микробиология, протеомика и молекулярна биология.
По-долу е представен подробен протокол, който илюстрира използването на моделите ултразвукови устройства Hielscher за множество проби – VialTweeter за множество епруветки и UIP400MTP за микроплаки – в изследване, включващо образуване на биофилм от E. coli и последващ протеомен анализ.

Протокол: образуване и отделяне на биофилми и протеомен анализ с ултразвукови устройства Hielscher за множество проби

1. Подготовка на бактериална култура

• Култивирайте бактерии E. coli (щам W3110) при 30°C – температура, благоприятна за образуването на биофилм от E. coli – в среда от триптонов бульон (TB), съдържаща:
  – 10 g/L триптон
  – 5 g/L NaCl
• При необходимост добавете антибиотици, за да осигурите запазването на плазмидите.
• За микроскопски изследвания и изследвания на промоторната активност използвайте щама W3110 на E. coli с геномно интегриран репортер за усилен GFP (eGFP) под контрола на промотора rplL.
• Използвайте GFP репортерни плазмиди за различни промотори (напр., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) за измерване на промоторната активност.

2. Култивиране и отделяне на биофилми

• Засейте по 1,5 mL разредена бактериална култура във всяка ямка на плака с 12 ямки (плаки CellStar с 12 ямки, Greiner Bio-One).
• Инкубирайте, за да се образува биофилм.
• Внимателно отстранете планктонната (неадхезивна) култура.

– Промийте всяка ямка с 500 µL PBS.
– Отделете прикрепените клетки чрез ултразвукова обработка на плаката с 12 ямки в ултразвуковото устройство UIP400MTP за микроплаки. UIP400MTP осигурява равномерно отделяне чрез подаване на еднаква ултразвукова енергия към всички ямки.
– Настройки за ултразвуковата обработка: 60% амплитуда, цикличен режим: 60 sec включено / 30 sec изключено.

3. Събиране и лизис на клетките

• Центрофугирайте отделените клетки от биофилма при 4 500 g за 5 минути.
• Промийте клетките в утайката с PBS.
• Ресуспендирайте клетките в 100 µL 2% натриев лауроилсаркозинат (SLS) и инкубирайте при 95°C за 15 минути.
• Обработете с ултразвук с помощта на устройството VialTweeter за множество епруветки, за да осигурите пълен лизис на клетките.
  – Настройки за ултразвуковата обработка: 100% амплитуда, 50 s включено / 10 s изключено при общо време на работа 10 min; дръжте пробите върху лед.

4. Редукция и алкилиране

• Добавете 5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) за редуциране на дисулфидните връзки и инкубирайте при 95°C за 15 минути.
• Алкилирайте протеините с 10 mM йодоацетамид за 30 минути при 25°C.

5. Количествено определяне и разграждане на протеините

• Центрофугирайте лизатите, за да отстраните клетъчните остатъци.
• Определете количествено общото съдържание на протеини с помощта на Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Разградете 50 µg общ протеин с 1 µg трипсин в разтвор, съдържащ 2% SLS и 100 mM амониев бикарбонат.
• Инкубирайте реакционната смес за разграждане през нощта при 30°C.

6. Пречистване на пептидите

• Утаете SLS чрез добавяне на 1,5% трифлуороцетна киселина (TFA), след което центрофугирайте.
• Пречистете пептидите с помощта на центрофужни микроколони C18.
• Изсушете пречистените пептиди и ги ресуспендирайте в 0,1% TFA.

7. Течна хроматография – масспектрометрия (LC-MS/MS)

• Анализирайте пептидите с масспектрометър Q-Exactive Plus, свързан със система Ultimate 3000 RSLC nano.
• Разделете пептидите с помощта на HPLC колона с обърната фаза (75 µm × 42 cm), напълнена със смола C18 (2,4 µm).
• Приложете градиент от 2% до 35% разтворител B (ацетонитрил с 0,15% мравчена киселина) в продължение на 140 минути.
• Съберете данни чрез MS сканирания с висока разделителна способност, последвани от тандемни MS/MS сканирания на 10-те йона с най-висок интензитет.

8. Анализ на данните

• Обработете необработените LC-MS данни със софтуера Progenesis.
• Експортирайте .mgf файлове и ги анализирайте с MASCOT.
• Извършете количествено определяне на пептидите с помощта на SafeQuant за контрол на качеството и корекция за фалшиви открития.
• Проведете всички експерименти в две или три повторения, за да осигурите възпроизводимост.

Ултразвукови устройства за множество проби за подготовка на проби с висок капацитет за обработка

Моделите ултразвукови устройства за множество проби VialTweeter и UIP400MTP значително подобряват прецизността и ефективността на експерименталните работни процеси, особено при изследвания на биофилми и в протеомиката. Способността им да обработват равномерно множество проби осигурява висок капацитет за обработка на проби, без да се компрометира качеството на данните. Тези предимства, съчетани с оптимизираните работни процеси, описани по-горе, правят ултразвуковите устройства Hielscher за множество проби основни инструменти за съвременните биологични изследвания.

Проектиране, производство и консултации – качество, произведено в Германия

Ултразвуковите устройства Hielscher са добре известни с най-високото си качество и стандарти за проектиране. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови устройства в промишлени инсталации. Ултразвуковите устройства Hielscher лесно се справят с тежки условия и взискателни среди.

Hielscher Ultrasonics е компания, сертифицирана по ISO, и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови устройства с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите устройства Hielscher съответстват на CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.