Протокол, използващ многопробни соникатори на Hielscher в биофилмов и протеомичен анализ

Използването на ултразвукори с няколко проби, като VialTweeter Multi-Tube Sonicator и UIP400MTP Microplate Sonicator, рационализира лабораторните работни процеси за приложения с висока производителност. И двете устройства позволяват прецизна и равномерна ултразвукова обработка на множество проби, минимизирайки променливостта и подобрявайки възпроизводимостта. Това е особено полезно при експерименти, изискващи последователен лизис на пробата, отделяне на биофилм, екстракция на протеини или протеолитично разграждане, където ръчните методи или методите с единична проба са по-малко ефективни и податливи на непоследователност.

Рационализирайте работните процеси с Multi-Sample Sonicators

UIP400MTP, например, позволява едновременно ултразвуково третиране на ямки с микроплочи, осигурявайки равномерно отделяне на биофилми или клетъчен материал. Междувременно VialTweeter предлага прецизен лизис и хомогенизиране на множество проби от епруветки без кръстосано замърсяване. Тези ултразвукови уреди значително намаляват времето за обработка, подобряват експерименталната възпроизводимост и поддържат висока цялост на пробата, което ги прави незаменими инструменти в изследванията в микробиологията, протеомиката и молекулярната биология.
По-долу е даден подробен протокол, илюстриращ използването на моделите на ултразвука на Hielscher с множество проби, VialTweeter Multi-Tube Sonicator и Microplate Sonicator UIP400MTP, в проучване, включващо образуване на биофилм на E. coli и последващ протеомен анализ.

Протокол: Образуване, отделяне и протеомен анализ на биофилм с помощта на многообразцови соникатори на Hielscher

1. Подготовка на бактериална култура

• Култивиране на бактерии E. coli (щам W3110) при 30°C, температура, благоприятна за образуването на биофилм на E. coli, в среда от триптонов бульон (TB), съдържаща:
  – 10 г/л триптон
  – 5 g/L NaCl
• Добавете антибиотици, ако е необходимо, за да осигурите задържане на плазмидите.
• За микроскопия и изследвания на активността на промотора използвайте щама W3110 E. coli с геномно подобрен GFP (eGFP) репортер под контрола на rplL промотора.
• Използвайте GFP репортерни плазмиди за различни промотори (напр. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) за измерване на дейностите на промоутърите.

2. Отглеждане и отделяне на биофилм

• Семена 1,5 ml разредена бактериална култура в ямка с 12 ямки (CellStar 12-ямкови плаки, Greiner Bio-One).
• Инкубирайте, за да позволите образуването на биофилм.
• Отстранете внимателно планктонната (неприлепнала) култура.

– Измийте всяка добре с 500 μL PBS.
– Отделете прикрепените клетки чрез ултразвук на 12-ямковата плоча в ултразвука на UIP400MTP микроплоча. UIP400MTP осигурява равномерно отделяне, като доставя постоянна ултразвукова енергия във всички кладенци.
– Настройки за уникиране: 60% амплитуда, режим на цикъл: 60 сек ВКЛ / 30 сек ИЗКЛ.

3. Събиране на клетки и лизис

• Центрофуга, отделени клетки от биофилм при 4,500 g за 5 минути.
• Измийте гранулираните клетки с PBS.
• Ресуспендират клетките в 100 μL 2% натриев лауроил саркозинат (SLS) и се инкубират при 95°C в продължение на 15 минути.
• Соникирайте с помощта на VialTweeter Multi-Tube Sonicator, за да осигурите пълен клетъчен лизис.
  – Настройки за уникиране: 100% амплитуда, 50 s ON / 10 s OFF за общо време на работа 10 минути; съхранявайте проби върху лед.

4. Редукция и алкилиране

• Добавете 5 mM трис(2-карбоксиетил)фосфин (TCEP), за да намалите дисулфидните връзки и инкубирайте при 95°C за 15 минути.
• Алкилатни протеини с 10 mM йодоацетамид за 30 минути при 25°C.

5. Количествено определяне и храносмилане на протеини

• Центрофуга лизира за почистване на отломки.
• Количествено определете общото съдържание на протеин с помощта на комплекта за анализ на протеин Pierce BCA.
• Разграждат се 50 μg общ протеин с 1 μg трипсин в разтвор, съдържащ 2% SLS и 100 mM амониев бикарбонат.
• Инкубирайте реакцията на храносмилане през нощта при 30°C.

6. Пречистване на пептиди

• Утаете SLS чрез добавяне на 1,5% трифлуороцетна киселина (TFA), след това центрофуга.
• Пречистете пептидите с помощта на C18 микроспинови колони.
• Сухи пречистени пептиди и ресуспендирани в 0,1% TFA.

7. Течна хроматография-масспектрометрия (LC-MS/MS)

• Анализирайте пептидите на масспектрометър Q-Exactive Plus, съчетан с нано система Ultimate 3000 RSLC.
• Пептидите се разделят с помощта на HPLC колона с обратна фаза (75 μm × 42 cm), пълна със смола C18 (2,4 μm).
• Нанесете градиент от 2% до 35% разтворител B (ацетонитрил с 0,15% мравчена киселина) в продължение на 140 минути.
• Получавайте данни с помощта на MS сканиране с висока разделителна способност, последвано от тандемно MS/MS сканиране на 10-те най-интензивни йона.

8. Анализ на данните

• Обработвайте необработени LC-MS данни с помощта на софтуера Progenesis.
• Експортирайте .mgf файлове и ги анализирайте с MASCOT.
• Извършете количествено определяне на пептидите с помощта на SafeQuant за контрол на качеството и корекция на фалшивото откриване.
• Провеждайте всички експерименти в два или тройни екземпляра, за да осигурите възпроизводимост.

Соникатори с няколко проби за високопроизводителна подготовка на проби

Моделите на ултразвуковия компютър с няколко проби VialTweeter и UIP400MTP значително подобряват прецизността и ефективността на експерименталните работни процеси, особено в изследванията на биофилми и протеомиката. Способността им да обработват множество проби равномерно осигурява висока производителност, без да се компрометира качеството на данните. Тези предимства, съчетани с рационализираните работни процеси, описани по-горе, правят ултразвуковите апарати на Hielscher с няколко проби основни инструменти за съвременните биологични изследвания.

Проектиране, производство и консултиране – Качество, произведено в Германия

Ултразвуковите апарати Hielscher са добре известни със своите най-високи стандарти за качество и дизайн. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Тежките условия и взискателните условия се справят лесно с ултразвуковите апарати на Hielscher.

Hielscher Ultrasonics е сертифицирана по ISO компания и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови уреди, отличаващи се с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher са съвместими с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.