Екстракция на извънклетъчния матрикс с ултразвуковия апарат за 96-ямкови плаки UIP400MTP

Традиционните методи за екстракция на извънклетъчния матрикс (EM) често включват множество стъпки за разрушаване на матрикса на биофилма. Тези техники обаче могат да отнемат много време и да дават непостоянни резултати, което води до вариабилност на резултатите. С ултразвуковия апарат за 96-ямкови плаки UIP400MTP процесът на екстракция на EM се улеснява значително, като се осигурява високоефективно, прецизно и равномерно разрушаване на биофилма във формати с висок капацитет за обработка на проби. UIP400MTP използва фокусиран ултразвук за генериране на контролирана кавитация, която ефективно разрушава матрикса на биофилма, като същевременно запазва жизнеспособността и целостта на клетките, включени в биофилма. Използването на UIP400MTP подобрява възпроизводимостта и точността на последващите изследвания, като метаболомни и протеомни анализи, тестове за жизнеспособност и изследвания на чувствителността към антимикробни средства. Като оптимизира екстракцията на EM, UIP400MTP позволява на изследователите да постигат постоянни и висококачествени резултати, предоставяйки по-задълбочено разбиране за динамиката на биофилмите и взаимодействията им с външни агенти.

Екстракция на извънклетъчния матрикс

Извънклетъчният матрикс (EM) е ключов компонент на биофилмите, образувани от микроорганизми като Candida albicans. Съставен от полизахариди, протеини, липиди и извънклетъчна ДНК, EM осигурява структурна цялост, посредничи при адхезията към повърхности и допринася значително за резистентността към антимикробни средства. Екстракцията и анализът на EM са от съществено значение за разбирането на биологията на биофилмите, изясняването на механизмите на лекарствена резистентност и идентифицирането на нови терапевтични мишени.

Протокол за екстракция на извънклетъчния матрикс (EM) от биофилми на Candida albicans с UIP400MTP

Този протокол е насочен към екстракцията на извънклетъчния матрикс (EM) на биофилми на Candida albicans, отгледани при статични условия. Включването на ултразвуковия апарат UIP400MTP замества традиционните стъпки с остъргване или използване на ензими за подобряване на ефективността и възпроизводимостта.

Необходими материали

Указания стъпка по стъпка за екстракция на EM

1. Образуване на биофилм при статични условия
   За биофилми, отглеждани при статични условия, инокулирайте C. albicans в ямките на 96-ямкова плака, като използвате среда RPMI-1640. Всяка ямка трябва да съдържа еднакъв обем инокулум (напр. 200 µL на ямка).
   Инкубирайте плаката при 37°C в статични условия за 24 часа, за да се образува биофилм върху повърхностите на ямките.
2. Подготовка на биофилма за екстракция
   След инкубацията внимателно аспирирайте и изхвърлете използваната среда от всяка ямка, без да нарушавате биофилма.
   Промийте внимателно всяка ямка със стерилен PBS (напр. 200 µL), за да отстраните слабо прикрепените клетки и планктонните клетъчни остатъци. Повторете тази стъпка два пъти.
   Добавете пресен PBS или екстракционния буфер (напр. 200 µL) във всяка ямка, за да я подготвите за ултразвукова обработка.
3. Ултразвукова обработка с UIP400MTP
   Поставете 96-ямковата плака, съдържаща PBS или екстракционен буфер, в тавата на ултразвуковия апарат UIP400MTP. За правилно поставяне на многоямковата плака следвайте указанията в ръководството.
   Обработвайте с ултразвук в продължение на 5–6 минути при щадяща настройка (60% амплитуда, импулсен режим), като осигурите равномерно разрушаване на структурата на биофилма и освобождаване на компонентите на EM.
   Използвайте температурния контрол на ултразвуковия апарат UIP400MTP (температурен сензор и настройки), за да избегнете прекомерно нагряване или увреждане на пробите.
4. Обработка с катионообменна смола (CER)
   Прехвърлете обработената с ултразвук течност от всяка ямка в нова 96-ямкова плака.
   Добавете във всяка ямка двукратен обем суспензия на CER (приготвена в PBS или буфер) (напр. 400 µL общ обем на ямка).
   Запечатайте плаката и я инкубирайте върху шейкър за плаки или ротатор при 400 rpm за 3 часа, за да се осъществят свързване и изолиране на компонентите на EM.
5. Разделяне и филтриране
   Центрофугирайте плаката при 2 000 × g за 10 минути, за да отделите смолата и клетките от супернатанта.
   Внимателно прехвърлете съдържащия EM супернатант от всяка ямка в нова 96-ямкова плака.
   Филтрирайте супернатанта през филтър с размер на порите 0,22 µm, като използвате система с вакуумен колектор за плаки или еквивалентна система, за да получите чист екстракт от EM.
6. Анализ на EM
   Използвайте техники като UPLC-Q-TOF-MS за нецелево профилиране на метаболити или прилагайте специфични тестове (напр. BCA за протеини и комплекти за количествено определяне на триглицериди и въглехидрати), за да характеризирате компонентите на EM.

Екстракция на извънклетъчния матрикс с висок капацитет за обработка на проби

Високата ефективност на екстракцията на извънклетъчния матрикс (EM) с ултразвуковия апарат UIP400MTP революционизира подготовката на проби за изследвания, изискващи точен анализ на свойствата на биофилмите. UIP400MTP използва ултразвукови вълни за прецизно и равномерно разрушаване на матрикса на биофилма, което позволява ефективно освобождаване на компонентите на EM, като същевременно запазва жизнеспособността и целостта на клетките. Този подход значително повишава надеждността на изследвания като тестове за жизнеспособност на биофилмите, протеомни и метаболомни изследвания и оценки на чувствителността към антимикробни средства.

При изследвания за възстановяване на растежа на биофилмите, като преброяване на колониеобразуващите единици (CFU), екстракцията на EM с UIP400MTP осигурява безпрепятствен достъп на реагентите до клетките, включени в биофилма. По подобен начин протеомните и метаболомните анализи, като UPLC-Q-TOF-MS, се възползват от изолирането на протеини, липиди и метаболити с висок добив. UIP400MTP също така подпомага прецизното изпитване на чувствителността към антимикробни средства, като позволява точно определяне на стойностите на MIC и MBEC за биофилмите. Освен това ефективната екстракция, улеснена от UIP400MTP, подпомага анализите на ензимна активност, количественото определяне на компоненти и структурните изследвания, предоставяйки ценни сведения за ролята на извънклетъчните матрикси в архитектурата на биофилмите, адхезията и механизмите на резистентност.

Този възпроизводим метод за екстракция с висок капацитет за обработка на проби оптимизира подготовката на EM, като осигурява превъзходни резултати при редица изследвания, свързани с биофилмите.