Протокол за култивиране и отделяне на стафилококови биофилми

Стандартизираните методи са от съществено значение за надеждните резултати от изследванията. Тук можете да намерите протокол за култивиране и отделяне на стафилококови биофилми. Този протокол се фокусира върху оптимизирана подготовка на проби с висок капацитет за обработка чрез ултразвуковия апарат за многоямкови плаки UIP400MTP за ефективно отделяне на биофилми с висока производителност в 96-ямкови плаки. Протоколът съдържа и ключови стъпки за култивиране, промиване и визуализация на биофилми, с акцент върху свеждането до минимум на вариабилността и осигуряването на възпроизводимост.

Изследвания на стафилококови биофилми и антибиотици

Стафилококовите биофилми играят ключова роля при персистиращите инфекции поради устойчивостта си към антибиотици и имунни реакции. Образуването на биофилми осигурява защитна среда за бактериите, което затруднява лечението на инфекциите. Изследванията на биофилмите често се фокусират върху разбирането на тяхното образуване, поведение и чувствителност към антимикробни средства, с акцент върху методи с висока производителност за оптимизиране на експерименталните работни процеси.
Ултразвуковият апарат за многоямкови плаки UIP400MTP предлага значително предимство при изследванията на биофилми, като позволява бързото и ефективното им отделяне от 96-ямкови плаки. Това устройство подава равномерно ултразвукова енергия към всички ямки, като осигурява последователни резултати и същевременно свежда до минимум вариабилността.

Протокол за култивиране и отделяне на стафилококови биофилми

По-долу ви водим стъпка по стъпка през процеса на култивиране и отделяне на стафилококов биофилм. Като примерна аналитична стъпка ви показваме как да определите количествено култивираната биомаса чрез спектрофотометрия след оцветяване с кристалвиолет.

Култивиране на стафилококов биофилм

Необходими материали:

• Стерилни 96-ямкови полистиренови микротитърни плаки с плоско дъно и капаци, с повърхност, обработена за тъканни култури
• Триптиказо-соев бульон (TSB) с 0,25% глюкоза
• Бокс за биологична безопасност

Стъпки:

1. Подгответе стерилна работна среда в бокс за биологична безопасност, за да сведете до минимум контаминацията.
2. Добавете TSB, съдържащ 0,25% глюкоза, в ямките на микротитърната плака. TSB без глюкоза обикновено не подпомага образуването на биофилми и трябва да се използва само като контрола, ако е необходимо.
3. Инокулирайте ямките с бактериални щамове, подготвени по описания по-долу начин:
4. Пригответе бактериални суспензии, като осигурите липсата на предварително образувани клетъчни струпвания чрез хомогенизиране на суспензиите с ултразвукова обработка или чрез разбиване на струпванията с игла 23 G и кратко разбъркване на вортекс.
5. Затворете плътно плаката с капака ѝ и инкубирайте при оптимални условия за образуване на биофилм (например 37°C за 24 часа).
6. Проведете експеримента в три повторения за всеки бактериален щам (три ямки на щам), за да осигурите надеждност.
7. Отделете шест ямки на плака за отрицателни контроли. В една 96-ямкова плака могат да бъдат изследвани до 30 щама.

Визуализация и промиване на биофилма

1. След инкубацията отстранете внимателно хранителната среда, за да избегнете нарушаване на биофилма.
2. Промийте всяка ямка четири пъти с физиологичен разтвор, за да отстраните планктонните бактерии.
3. Огледайте дъното на ямките за бели петна, показващи наличието на биофилм.

Отделяне на биофилма с ултразвуковия апарат за многоямкови плаки UIP400MTP

Настройка и параметри на устройството:

• Ултразвуков апарат за многоямкови плаки UIP400MTP
• Работни настройки: 60% амплитуда, цикличен режим с 60 секунди включено / 30 секунди изключено

Стъпки:

1. Поставете промитата микротитърна плака върху платформата на UIP400MTP.
2. Обработете пробите с ултразвук при препоръчителните настройки (60% амплитуда, 60 секунди включено, 30 секунди изключено). Адаптирайте настройките към бактериалния щам.
3. Стартирайте ултразвуковата обработка, за да отделите биофилма. Ултразвуковите вълни разрушават матрицата на биофилма, като освобождават прикрепените бактерии.
4. UIP400MTP осигурява равномерно въздействие във всички ямки за последователни резултати при отделянето.

Аналитична стъпка: количествено определяне на биомасата на отделения стафилококов биофилм с кристалвиолет (CV)

Необходими материали:

• 0,1% разтвор на кристалвиолет (CV)
• 95% етанол или 30% оцетна киселина (за солюбилизация)
• Четец за микроплаки, способен да измерва при 570 nm
• Стерилни микротитърни плаки за оцветяване

Стъпки:

1. Подготовка на плаката за оцветяване: Прехвърлете 100 µL от суспензията на отделения биофилм от всяка ямка на обработената с ултразвук плака в съответните ямки на чиста, стерилна 96-ямкова микротитърна плака. Това осигурява чиста и еднородна среда за оцветяване.
2. Оцветяване на отделения биофилм: Добавете 150 µL от 0,1% разтвор на кристалвиолет във всяка ямка, съдържаща суспензията на отделения биофилм. Пипетирайте внимателно, за да осигурите равномерно смесване на суспензията на биофилма и кристалвиолета.
3. Инкубация: Оставете плаката да се инкубира при стайна температура за 15 минути, за да може кристалвиолетът ефективно да оцвети биомасата.
4. Промиване: След инкубацията внимателно отстранете разтвора на кристалвиолет от ямките, без да нарушавате биомасата. Промийте всяка ямка три пъти със стерилен физиологичен разтвор, за да отстраните несвързаното багрило.
5. Изсушаване: Оставете плаката да изсъхне на въздух при стайна температура или в бокс със стерилен въздушен поток. Избягвайте нагряване, тъй като то може да промени резултатите.
6. Солюбилизация: Добавете 200 µL от 95% етанол (или 30% оцетна киселина, в зависимост от стандартните лабораторни практики) във всяка ямка, за да солюбилизирате свързания кристалвиолет. Разбъркайте внимателно чрез пипетиране или разклащане на плаката за 10 минути при стайна температура.
7. Измерване: Измерете оптичната плътност (OD) на разтвора на солюбилизирания кристалвиолет при 570 nm с четец за микроплаки.
8. Анализ на данните: Извадете средната стойност на OD570 на отрицателните контроли (ямки с TSB, но без бактериален инокулум) от стойностите за експерименталните ямки, за да отчетете фоновото оцветяване. Запишете и анализирайте данните.

Забележка: Проведете експеримента в три повторения за всяко условие, за да осигурите възпроизводимост. Осигурете правилно боравене с кристалвиолет и етанол, като спазвате протоколите за безопасност и обезвреждане.
 

Основните предимства на UIP400MTP с един поглед:

• Обработка с висока производителност: Проектиран специално за многоямкови плаки, което ви позволява да обработвате множество проби едновременно.
• Равномерно разпределение на ултразвука: Осигурява еднакъв ултразвуков интензитет във всички ямки, като дава последователни резултати за всички проби.
• Използвайте всяка стандартна плака: UIP400MTP може да обработва всякакви стандартни многоямкови плаки, петриеви блюда и стативи с епруветки. Не са необходими скъпи плаки, предназначени само за конкретния апарат!
• Удобен за потребителя интерфейс: Лесен за настройване и управление, което го прави отлично средство за повишаване на производителността в лабораторията. Програмируемите настройки и автоматизацията улесняват стандартизацията на процесите!