Протокол за отглеждане и отделяне на стафилококи от биофилм

Стандартизираните методи са от съществено значение за надеждните резултати от изследванията. Тук можете да намерите протокол за култивиране и отделяне на стафилококови биофилми. Този протокол се фокусира върху рационализирана подготовка на проби с висока производителност с помощта UIP400MTP многоямков плачен ултразвук за ефективно, високопроизводително отделяне на биофилм в 96-ямкови плочи. Протоколът също така съдържа ключови стъпки за отглеждане, измиване и визуализация на биофилм, с фокус върху минимизиране на променливостта и осигуряване на възпроизводимост.

Биофилм за стафилококи и изследване на антибиотици

Биофилмите на стафилококите играят критична роля при персистиращите инфекции поради тяхната резистентност към антибиотици и имунни отговори. Образуването на биофилм осигурява защитна среда за бактериите, което прави инфекциите трудни за лечение. Изследванията на биофилмите често се фокусират върху разбирането на тяхното образуване, поведение и чувствителност към антимикробни средства, с акцент върху методите с висока производителност за рационализиране на експерименталните работни процеси.
Многоямковият ултразвук UIP400MTP предлага значително предимство в изследванията на биофилми, като позволява бързо и ефективно отделяне на биофилми от 96-ямкови плочи. Това устройство осигурява равномерна ултразвукова енергия за всички кладенци, осигурявайки постоянни резултати, като същевременно минимизира променливостта.

Протокол за отглеждане и отделяне на стафилококов биофилм

По-долу ви насочваме с инструкция стъпка по стъпка през процеса на отглеждане и отделяне на стафилококов биофилм. Като примерна аналитична стъпка ви показваме как да определите количествено спектрофотометрично култивираната биомаса чрез кристално виолетово оцветяване.

Отглеждане на стафилококов биофилм

Необходими материали:

• Стерилни плоскодънни 96-ямкови полистиролови тъкани, обработени с микротитърни плочи с капаци
• Триптичен соев бульон (TSB) с 0,25% глюкоза
• Шкаф за биологична безопасност

Стъпки:

1. Подгответе стерилна работна среда в шкаф за биологична безопасност, за да сведете до минимум замърсяването.
2. Добавете TSB, съдържащ 0,25% глюкоза, в ямките на микротитърната плака. TSB без глюкоза обикновено не подпомага образуването на биофилм и трябва да се използва само като контрола, ако е необходимо.
3. Инокулирайте кладенците с бактериални щамове, приготвени, както е описано по-долу:
4. Пригответе бактериални суспензии, като се уверите, че няма вече съществуващи клетъчни клъстери, като хомогенизирате суспензиите с помощта на ултразвук или чрез разбиване на клъстерите с игла 23 калибър и кратко завихряне.
5. Запечатайте плочата с капака и инкубирайте при условия, оптимални за образуване на биофилм (напр. 37°C в продължение на 24 часа).
6. Извършете експеримента в три екземпляра за всеки бактериален щам (три ямки на щам), за да осигурите надеждност.
7. Разпределете шест кладенеца на плоча за отрицателни контроли. До 30 щама могат да бъдат тествани на 96-ямкова плоча.

Визуализация и измиване на биофилм

1. След инкубацията изхвърлете внимателно средата, за да избегнете нарушаване на биофилма.
2. Измийте всяка ямка четири пъти с физиологичен разтвор, за да премахнете планктонните бактерии.
3. Проверете дъното на кладенците за бели петна, показателни за наличие на биофилм.

Отделяне на биофилм с помощта на многоямковия соникатор UIP400MTP

Настройка и параметри на устройството:

• UIP400MTP многоямков пластинчат ултразвук
• Работни настройки: 60% амплитуда, режим на цикъл с 60 секунди ON / 30 секунди OFF

Стъпки:

1. Поставете измитата микротитърна плоча върху платформата за UIP400MTP.
2. Соникирайте пробите при препоръчителните настройки (60% амплитуда, 60 секунди ВКЛ., 30 секунди ИЗКЛЮЧЕНО). Регулирайте настройките за щам на бактерии.
3. Започнете процеса на ултразвук, за да отделите биофилма. Ултразвуковите вълни нарушават матрицата на биофилма, освобождавайки прилепналите бактерии.
4. UIP400MTP осигурява равномерно излагане във всички кладенци за постоянни резултати от отделянето.

Аналитична стъпка: Количествено определяне на биомаса от отделен стафилококов биофилм с помощта на кристално виолетово (CV)

Необходими материали:

• 0.1% кристално виолетов (CV) разтвор
• 95% етанол или 30% оцетна киселина (за разтваряне)
• Четец на микроплаки, способен да чете при 570 nm
• Стерилни микротитърни плочи за оцветяване

Стъпки:

1. Подготовка на оцветяваща плоча: Прехвърлете 100 μL от отделената суспензия на биофилма от всяка ямка на ултразвуковата плоча в съответните ямки на чиста, стерилна 96-ямкова микротитърна плоча. Това осигурява ясна и равномерна среда за оцветяване.
2. Оцветяване на отделения биофилм: Добавете 150 μL 0,1% кристално виолетов разтвор към всяка ямка, съдържаща отделената суспензия на биофилма. Внимателно пипетирайте, за да осигурите равномерно смесване на суспензията от биофилм и кристално виолетовото.
3. Инкубация: Оставете плочата да се инкубира при стайна температура за 15 минути, за да позволите на кристално виолетовото да оцвети ефективно биомасата.
4. Измиване: След инкубация внимателно изхвърлете кристално виолетовия разтвор от кладенците, без да нарушавате биомасата. Измийте всяка ямка три пъти със стерилен физиологичен разтвор, за да премахнете несвързаното петно.
5. Сушене: Оставете плочата да изсъхне на въздух при стайна температура или под стерилен аспиратор за въздушен поток. Избягвайте нагряването, тъй като това може да промени резултатите.
6. Разтваряне: Добавете 200 μL 95% етанол (или 30% оцетна киселина, в зависимост от стандартните лабораторни практики) към всяка ямка, за да разтворите свързания кристал виолетов. Разбъркайте внимателно чрез пипетиране или разклащане на чинията за 10 минути при стайна температура.
7. Измерване: Измерете оптичната плътност (OD) на разтворения кристално виолетов разтвор при 570 nm с помощта на четец на микроплаки.
8. Анализ на данните: Извадете средната стойност на OD570 на отрицателните контроли (ямки с TSB, но без бактериален инокулум) от експерименталните ямки, за да се отчете фоновото оцветяване. Записвайте и анализирайте данните.

Забележка: Извършете експеримента в три екземпляра за всяко условие, за да осигурите възпроизводимост. Осигурете правилно боравене с кристално виолетово и етанол, като се придържате към протоколите за безопасност и изхвърляне.
 

Основните предимства на UIP400MTP с един поглед:

• Обработка с висока производителност: Проектиран специално за пластини с много ямки, което ви позволява да обработвате няколко проби едновременно.
• Равномерно ултразвуково разпределение: Осигурява еднакъв ултразвуков интензитет в кладенците, осигурявайки постоянни резултати във всички проби.
• Използвайте всяка стандартна плоча: UIP400MTP може да се справи с всякакви стандартни плочи с много ямки, съдове на Петри и стелажи за тръби. Не се изискват скъпи патентовани плочи!
• Удобен за потребителя интерфейс: Лесен за настройка и управление, което го прави отличен инструмент за увеличаване на производителността на лабораторията. Програмируемите настройки и автоматизацията улесняват стандартизацията на процесите!