Протокол за анализ на минимална инхибиторна концентрация (MIC)

Анализът за минимална инхибиторна концентрация (MIC), базиран на биофилм, е основен метод за оценка на ефективността на антимикробните агенти срещу микроорганизми, свързани с биофилм, които проявяват повишена резистентност поради защитния си извънклетъчен матрикс. Решаваща стъпка в този анализ е разрушаването на структурите на биофилма, за да се освободят вградени клетки за точна оценка на жизнеспособността. Многоямковият ултразвук UIP400MTP улеснява този процес, като използва фокусиран ултразвук за генериране на контролирана кавитация, ефективно отделяне на клетките от биофилм и разпръскването им в равномерна суспензия. Това прецизно и възпроизводимо разрушаване на биофилма повишава надеждността и производителността на MIC анализите, което прави UIP400MTP основен инструмент за напредък в изследванията на биофилма.

Разпознаване за откъсване на биофилма

Базираният на биофилм MIC анализ обикновено измерва бактериалната жизнеспособност или инхибиране на растежа, като използва методи като покритие, преброяване на колонии или измерване на оптична плътност. Соникацията е критична стъпка в анализите на MIC на базата на биофилм при оценката на антимикробната чувствителност на микроорганизми, свързани с биофилми. Основната му функция е да отделя и диспергира клетките, вградени в матрицата на биофилма, в еднородна суспензия за точен анализ.
Биофилмите са значително по-устойчиви на антимикробни агенти в сравнение с планктонните клетки, което прави правилното отделяне от решаващо значение за точния анализ. По време на този процес ултразвуковите вълни генерират контролирана кавитация, разчупвайки матрицата на биофилма и освобождавайки вградените клетки в равномерна суспензия в средата за възстановяване. Тази стъпка позволява прецизни оценки на жизнеспособността на клетките, диспергирани с биофилм, чрез методи като покритие, разреждане и преброяване на колонии. Правилното разрушаване на биофилма чрез ултразвук предотвратява предпазването на остатъчните компоненти на матрицата от екраниране на клетките, което в противен случай може да доведе до подценяване на антимикробната активност. Многоямковият пластинов ултразвуков UIP400MTP е особено подходящ за тази цел, като предлага прецизни и възпроизводими условия на ултразвук, за да осигури надеждна и високопроизводителна подготовка на пробните плочи.

Защо е необходима сонация при анализи за минимална концентрация на инхибитория на базата на биофилм

За измерване на жизнеспособността и преброяване на клетките е необходимо пълно и надеждно отделяне и дисперсия на единични клетки. UIP400MTP насърчава равномерно, неувреждащо отделяне на биофилма и клетъчна дисперсия за стабилни резултати от анализа.

• Сложност на биофилма: Биофилмите са структурирани микробни съобщества, обвити в матрица от извънклетъчно полимерно вещество (EPS), която защитава микроорганизмите и ги прави по-устойчиви на антимикробни агенти.
• Равномерна дисперсия: За да се измери точно жизнеспособността на клетките, вградени в биофилм, или тяхната чувствителност към антимикробни средства, биофилмът първо трябва да бъде изместен и разграден до хомогенна суспензия.

Протокол за анализ на минимална инхибиторна концентрация на базата на биофилм

Анализът за минимална инхибиторна концентрация (MIC) определя най-ниската концентрация на антимикробен агент, необходима за инхибиране на видимия растеж на микроорганизмите. Този протокол е предназначен за микроорганизми, свързани с биофилм, като се използва UIP400MTP многоямков плачен ултразвук за разрушаване на биофилма.

Стъпка 1: Приготвяне на бактериален инокулум

1. Пригответе бактериалната суспензия:
   Отглеждайте бактерии в подходящи среди до средата на логаритмичната фаза.
   Разредете културата, за да постигнете стандартизирана клетъчна плътност (напр. 0,5 стандарт на Макфарланд или OD600 ~0,1).
2. Пригответе антимикробни разтвори:
   Антимикробният агент се разрежда в подходяща среда, за да се създаде диапазон от концентрации (напр. двойно серийно разреждане).
3. Дозирайте в плочата 96 ямки:
   Добавете антимикробните разтвори в ямките на стандартна плоча с 96 ямки, с краен обем на ямката ~150–200 μL.
   Включете контрол на растежа (без антимикробни средства) и контрол на стерилността (без бактериален инокулум).

Стъпка 2: Образуване на биофилм върху капака на колчето

• Прикрепете капака на колчето:
  Поставете специализирания капак на колчето върху инокулираните кладенци, като се уверите, че колчетата са напълно потопени в бактериалната суспензия.
• Инкубирайте чинията:
  Инкубира се при подходяща температура (напр. 37°C) за определена продължителност (напр. 24 часа) при статични условия, за да се даде възможност за образуване на биофилм върху колчетата.

Стъпка 3: Излагане на антимикробни средства

• Изплакнете колчетата:
  Отстранете капака на колчето от бактериалната суспензия и внимателно изплакнете със стерилен физиологичен разтвор или PBS, за да отстраните слабо прикрепените планктонни клетки.
• Излагане на антимикробни средства:
  Поставете капака на колчето в нова плоча 96 ямки, съдържаща антимикробните разреждания, приготвени по-рано.
  Инкубира се за определен период от време (напр. 24 часа) при статични условия, за да се даде възможност на антимикробния агент да действа върху биофилмите.

Стъпка 4: Уникиране с Microplate Sonicator UIP400MTP

Стъпката на ултразвук е от решаващо значение за отделянето на биофилмите от капаците на колчето, за да се оцени жизнеспособността. Следвайте тези стъпки за UIP400MTP sonicator:

1. Подгответе настройката:
   Напълнете прясна чиния с 96 ямки със среда за възстановяване (напр. неутрализиращ бульон или стерилна среда за растеж) във всяка ямка.
2. Прехвърлете капака на колчето:
   Свалете капака на колчето от плочата за антимикробно лечение.
   Изплакнете капака на колчето със стерилен физиологичен разтвор или PBS, за да отстраните остатъчните антимикробни агенти.
3. Поставете плочата в ултразвука:
   Прикрепете капака на колчето към плочата на средата за възстановяване.
   Поставете плочата на средата за възстановяване в UIP400MTP ултразвука, като се уверите, че плочата седи центрирана и стабилна, както е описано в ръководството.
4. Регулирайте параметрите на ултразвука:
   Задайте параметрите на ултразвука на UIP400MTP (настройките могат да се регулират според биофилма):
   Амплитуда: 70–100%.
   Време за уникиране: 1–3 минути (регулирайте въз основа на структурата на биофилма) в режим на цикъл.
5. Соникирайте:
   Започнете процеса на ултразвук. Ултразвуковите вълни ще нарушат матрицата на биофилма и ще изместят клетките в средата за възстановяване.
6. Наблюдавайте процеса:
   Използвайте щепселния температурен сензор, за да следите температурата на пробата в кладенците. UIP400MTP може да бъде свързан към лабораторен охладител за охлаждане.
7. Обработка след уникиране:
   Незабавно прехвърлете средата за възстановяване, съдържаща отделени биофилми, в нова стерилна плака за последващ анализ.

(A) Плака, съдържаща TSB с 2% глюкоза, използвана за образуване на биофилм, клетъчно възстановяване и определяне на MIC и MBEC; (Б) Капак с щифтове за образуване на стафилококови биофилми.
Клетките на биофилма, образувани върху щифтовете, са изместени чрез ултразвук (ултразвукова технология на Hielscher) за 5 минути в 96-ямкови плаки, съдържащи прясна хранителна среда за възстановяване на клетките.
(Снимка и проучване: ©de Oliveira et al., 2016)

Стъпка 4: Оценка на жизнеспособността

Отделени биофилми от плаки и култури:

1. Извършва се серийно разреждане на средата за възстановяване и плочата върху агар, за да се изброят колониеобразуващите единици (CFU).
2. Оценете MIC:
   Определете MIC като най-ниската концентрация на антимикробни средства, която напълно инхибира видимия растеж на микробите в средата за възстановяване.

MIC Минимална инхибиторна концентрация: Пример за микротитърна плака и интерпретация на резултатите от микроразреждането.
(Проучване и изображение: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Проектиране, производство и консултиране – Качество, произведено в Германия

Ултразвуковите апарати Hielscher са добре известни със своите най-високи стандарти за качество и дизайн. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Суровите условия и взискателната среда се справят лесно с ултразвуковите уреди на Hielscher.

Hielscher Ultrasonics е сертифицирана по ISO компания и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови уреди, отличаващи се с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher са съвместими с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.

Прочетете тук как UIP400MTP се използва за отделяне на биофилм в протокола ASTM E2799 – Тестване на ефикасността на дезинфектант срещу биофилм на Pseudomonas aeruginosa с помощта на MBEC анализа.