Протокол за определяне на минималната инхибираща концентрация (MIC)

Тестът за определяне на минималната инхибираща концентрация (MIC) при биофилми е основен метод за оценяване на ефективността на антимикробните средства срещу микроорганизми, свързани с биофилми, които проявяват повишена резистентност поради защитния си извънклетъчен матрикс. Ключова стъпка в този тест е отделянето на биофилмните структури за освобождаване на включените в тях клетки с цел точна оценка на жизнеспособността. Ултразвуковият апарат за многоямкови плаки UIP400MTP улеснява този процес, като използва фокусиран ултразвук за генериране на контролирана кавитация, която ефективно отделя клетките от биофилма и ги диспергира в равномерна суспензия. Това прецизно и възпроизводимо разрушаване на биофилма повишава надеждността и капацитета за обработка при MIC тестовете, което превръща UIP400MTP в основен инструмент за напредъка на изследванията на биофилми.

Защо да използвам ултразвукова обработка при MIC тестове?

• Точни, възпроизводими данни: Получете равномерни клетъчни суспензии, които премахват защитното действие на матрикса, така че броят на колониите и измерванията на оптичната плътност да отразяват действително антимикробната ефективност.
• Ефективност с висок капацитет за обработка: Обработете едновременно цяла 96-ямкова плака само за 1–3 минути, като замените бавното ръчно остъргване с непостоянни резултати с оптимизиран работен процес.
• Запазена жизнеспособност на клетките: Отделете внимателно включените клетки без физическото увреждане, причинявано от остъргването, като поддържате по-високи нива на преживяемост за надеждни изчисления на MIC/MBEC.
• Нулев риск от кръстосано замърсяване: Възползвайте се от безконтактна конструкция с чашков сонотрод, която обработва всички ямки равномерно, без сонди да докосват отделните проби или ямки.
• Готовност за съответствие със стандартите: Приведете методиката си в съответствие с валидирани отраслови протоколи като ASTM E2799-22, като придадете на данните си по-голяма достоверност за регулаторни цели или публикации.
• Надежден скрининг на лекарства и лечения: Доверете се на резултатите си за чувствителност, за да вземате по-информирани решения относно антимикробната ефикасност, профилирането на резистентността или разработването на терапии.

Ултразвукова обработка за отделяне на биофилми

MIC тестът при биофилми обикновено измерва жизнеспособността на бактериите или инхибирането на растежа чрез методи като посявка, броене на колонии или измервания на оптичната плътност. Ултразвуковата обработка е критична стъпка в MIC тестовете при биофилми, когато се оценява антимикробната чувствителност на микроорганизми, свързани с биофилми. Основната ѝ функция е да отдели и диспергира клетките, включени в матрикса на биофилма, в равномерна суспензия за точен анализ.
Биофилмите са значително по-резистентни към антимикробни средства в сравнение с планктонните клетки, което прави правилното отделяне критично за точния анализ. По време на този процес ултразвуковите вълни генерират контролирана кавитация, която разрушава матрикса на биофилма и освобождава включените клетки в равномерна суспензия в средата за възстановяване. Тази стъпка позволява прецизни оценки на жизнеспособността на клетките, диспергирани от биофилма, чрез методи като посявка, разреждане и броене на колонии. Правилното разрушаване на биофилма чрез ултразвукова обработка предотвратява защитното действие на остатъчните компоненти на матрикса върху клетките, което иначе би могло да доведе до подценяване на антимикробната активност. Ултразвуковият апарат за многоямкови плаки UIP400MTP е особено подходящ за тази цел, като предлага прецизни и възпроизводими условия за ултразвукова обработка, осигуряващи надеждна подготовка на плаки за тестове с висок капацитет за обработка.

Защо ултразвуковата обработка е необходима при тестове за минимална инхибираща концентрация при биофилми

За измерване на жизнеспособността и броене на клетките е необходимо пълно и надеждно отделяне и диспергиране на единични клетки. UIP400MTP подпомага равномерното отделяне на биофилми и диспергиране на клетки без увреждане за надеждни резултати от тестовете.

• Сложност на биофилмите: Биофилмите са структурирани микробни общности, обгърнати от матрикс от извънклетъчни полимерни вещества (EPS), който защитава микроорганизмите и ги прави по-резистентни към антимикробни средства.
• Равномерно диспергиране: За да се измери точно жизнеспособността на клетките, включени в биофилма, или тяхната чувствителност към антимикробни средства, биофилмът трябва първо да бъде отделен и раздробен до хомогенна суспензия.

Протокол за определяне на минималната инхибираща концентрация при биофилми

Тестът за определяне на минималната инхибираща концентрация (MIC) определя най-ниската концентрация на антимикробно средство, необходима за инхибиране на видимия растеж на микроорганизмите. Този протокол е предназначен за микроорганизми, свързани с биофилми, като използва ултразвуковия апарат за многоямкови плаки UIP400MTP за разрушаване на биофилми.

Стъпка 1: Подготовка на бактериалния инокулум

1. Пригответе бактериалната суспензия:
   Култивирайте бактериите в подходящи среди до средата на логаритмичната фаза.
   Разредете културата до постигане на стандартизирана клетъчна плътност (напр. стандарт 0,5 McFarland или OD600 ~0,1).
2. Пригответе антимикробните разтвори:
   Разредете антимикробното средство в подходяща среда, за да получите диапазон от концентрации (напр. серийни двукратни разреждания).
3. Разпределете в 96-ямковата плака:
   Добавете антимикробните разтвори в ямките на стандартна 96-ямкова плака с краен обем във всяка ямка ~150–200 µL.
   Включете контроли за растеж (без антимикробно средство) и контроли за стерилност (без бактериален инокулум).

Стъпка 2: Образуване на биофилм върху капак с щифтове

• Поставете капака с щифтове:
  Поставете специализирания капак с щифтове върху инокулираните ямки, като се уверите, че щифтовете са изцяло потопени в бактериалната суспензия.
• Инкубирайте плаката:
  Инкубирайте при подходяща температура (напр. 37°C) за определено време (напр. 24 часа) при статични условия, за да позволите образуването на биофилм върху щифтовете.

Стъпка 3: Експозиция на антимикробни средства

• Изплакнете щифтовете:
  Извадете капака с щифтове от бактериалната суспензия и внимателно го изплакнете в стерилен физиологичен разтвор или PBS, за да отстраните слабо прикрепените планктонни клетки.
• Изложете на антимикробни средства:
  Прехвърлете капака с щифтове в нова 96-ямкова плака, съдържаща приготвените по-рано антимикробни разреждания.
  Инкубирайте за определен период (напр. 24 часа) при статични условия, за да позволите на антимикробното средство да действа върху биофилмите.

Стъпка 4: Ултразвукова обработка с ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP

Стъпката на ултразвукова обработка е критична за отделянето на биофилми от капаците с щифтове с цел оценка на жизнеспособността. Следвайте тези стъпки за ултразвуковия апарат UIP400MTP:

1. Подгответе постановката:
   Напълнете всяка ямка на нова 96-ямкова плака със среда за възстановяване (напр. неутрализиращ бульон или стерилна хранителна среда).
2. Прехвърлете капака с щифтове:
   Отстранете капака с щифтове от плаката за антимикробно третиране.
   Изплакнете капака с щифтове в стерилен физиологичен разтвор или PBS, за да отстраните остатъчните антимикробни средства.
3. Позиционирайте плаката в ултразвуковия апарат:
   Поставете капака с щифтове върху плаката със среда за възстановяване.
   Поставете плаката със среда за възстановяване в ултразвуковия апарат UIP400MTP, като се уверите, че плаката е центрирана и стабилна, както е описано в ръководството.
4. Настройте параметрите на ултразвуковата обработка:
   Задайте параметрите на ултразвуковата обработка на UIP400MTP (настройките могат да се адаптират към биофилма):
   Амплитуда: 70–100%.
   Време на ултразвукова обработка: 1–3 минути (адаптирайте според структурата на биофилма) в цикличен режим.
5. Обработете с ултразвук:
   Стартирайте процеса на ултразвукова обработка. Ултразвуковите вълни ще разрушат матрикса на биофилма и ще отделят клетките в средата за възстановяване.
6. Наблюдавайте процеса:
   Използвайте включваемия температурен сензор, за да следите температурата на пробите в ямките. UIP400MTP може да бъде свързан към лабораторен чилър за охлаждане.
7. Действия след ултразвуковата обработка:
   Незабавно прехвърлете средата за възстановяване, съдържаща отделените биофилми, в нова стерилна плака за последващ анализ.

(A) Плака, съдържаща TSB с 2% глюкоза, използвана за образуване на биофилм, възстановяване на клетки и определяне на MIC и MBEC; (B) Капак с щифтове за образуване на стафилококови биофилми.
Клетките на биофилма, образувал се върху щифтовете, бяха отделени чрез ултразвукова обработка (Hielscher Ultrasound Technology) за 5 min в 96-ямкови плаки, съдържащи прясна културална среда за възстановяване на клетките.
(Изображение и изследване: ©de Oliveira et al., 2016)

Стъпка 4: Оценка на жизнеспособността

Направете посявка и култивирайте отделените биофилми:

1. Извършете серийни разреждания на средата за възстановяване и направете посявка върху агар, за да преброите колониеобразуващите единици (CFU).
2. Оценете MIC:
   Определете MIC като най-ниската антимикробна концентрация, която напълно инхибира видимия микробен растеж в средата за възстановяване.

MIC – минимална инхибираща концентрация: Пример за микротитърна плака и интерпретация на резултатите от микроразреждането.
(Изследване и изображение: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Кой има полза от ултразвуковата обработка при MIC тестове?

• Производители на медицински изделия: За изпитване на ефикасността на повърхностни покрития и валидиране на протоколи за почистване на изделия, склонни към образуване на биофилми.
• Клинични микробиолози: За точно диагностициране на инфекции, свързани с импланти (като PJI), чрез извличане на бактерии от медицински изделия.
• Разработчици на фармацевтични продукти: За оценяване на ефективността на нови антимикробни средства срещу устойчиви патогени, включени в биофилми.
• Академични изследователи: За провеждане на възпроизводими изследвания с висок капацитет за обработка върху биологията на биофилмите и механизмите на антимикробна резистентност.
• Екипи за промишлен контрол на качеството: За оценяване на биологичното обрастване и ефикасността на дезинфектантите в промишлени условия (напр. чрез използване на стандартите ASTM E2799-22).

Проектиране, производство и консултации – качество, произведено в Германия

Ултразвуковите апарати Hielscher са добре известни със своето най-високо качество и стандарти за проектиране. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Ултразвуковите апарати Hielscher лесно се справят с тежки условия и взискателна работна среда.

Hielscher Ultrasonics е компания, сертифицирана по ISO, и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови апарати, отличаващи се с най-съвременни технологии и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати Hielscher съответстват на CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.

Прочетете тук как UIP400MTP се използва за отделяне на биофилми в протокола ASTM E2799 – изпитване на ефикасността на дезинфектанти срещу биофилм на Pseudomonas aeruginosa чрез MBEC теста.