Протокол за MBEC анализ с ултразвуковия апарат за 96-ямкови плаки UIP400MTP

MBEC анализът се използва за определяне на концентрацията на антимикробните средства, необходима за елиминиране на биофилми, образувани върху капаци с щифтове. За да се оцени жизнеспособността на биофилмите, те трябва първо да бъдат отделени от капаците с щифтове на 96-ямкова плака. Ултразвуковата обработка е най-надеждният и ефективен метод за това отделяне. Ултразвуковият апарат за многоямкови плаки UIP400MTP е специално проектиран за обработка на аналитични плаки с максимална ефективност и удобство, като улеснява и ускорява MBEC анализите с висок капацитет за обработка на проби.

Ултразвукова обработка за отделяне на биофилми

Ултразвуковата обработка е ключова стъпка в анализите за определяне на минималната концентрация за ерадикация на биофилм (MBEC), която позволява ефективно отделяне на клетките на биофилма от повърхността, към която са прикрепени. Биофилмите по своята същност са структурирани общности от микроорганизми, обвити в извънклетъчен матрикс, което ги прави значително по-устойчиви на антимикробни средства в сравнение с планктонните клетки. При MBEC анализите ултразвуковата обработка използва ултразвукови вълни за генериране на контролирана кавитация, която разрушава матрикса на биофилма и освобождава включените в него клетки в суспензия. Тази стъпка гарантира, че клетките на биофилма са равномерно диспергирани в средата за възстановяване, като улеснява точната оценка на жизнеспособността чрез посяване, разреждане или спектрофотометрични методи. Без правилно отделяне на биофилма остатъчните компоненти на матрикса биха могли да защитят клетките, което да доведе до подценяване на антимикробната ефикасност. Ето защо ултразвуковата обработка е незаменима за получаване на надеждни и възпроизводими стойности на MBEC, отразяващи действителния потенциал за ерадикация на изпитваните средства. Ултразвуковият апарат за многоямкови плаки UIP400MTP позволява лесна подготовка на проби в аналитични плаки с висок капацитет за обработка.

Протокол за анализ на минималната концентрация за ерадикация на биофилм (MBEC)

Стъпка 1: Образуване на биофилм

1. Подгответе бактериалната суспензия:
   Култивирайте бактериите в подходящи среди до логаритмичната фаза на растеж.
   Разредете бактериалната култура до определена оптична плътност (напр. OD600 ~0,1).
2. Инокулирайте 96-ямковата плака:
   Добавете бактериалната суспензия (напр. 150–200 µL) във всяка ямка на стандартна 96-ямкова микротитърна плака.
3. Поставете капака с щифтове:
   Поставете капака с щифтове върху инокулираната плака, за да се образува биофилм върху повърхностите на щифтовете.
4. Инкубирайте плаката:
   Инкубирайте системата при подходяща температура (напр. 37°C) за 24–48 часа без разклащане, за да стимулирате растежа на биофилма.

Стъпка 2: Третиране с антимикробни средства

• Подгответе антимикробни разтвори:
  Подгответе серия от концентрации на антимикробни средства в пресни среди.
  Изложете биофилмите на действието на антимикробни средства:
  Свалете капака с щифтове от бактериалната култура и го изплакнете в стерилен физиологичен разтвор или PBS, за да отстраните планктонните клетки.
  Поставете капака с щифтове в нова 96-ямкова плака, съдържаща антимикробните разтвори.
• Инкубирайте плаката:
  Инкубирайте за определен период (напр. 24 часа), за да осигурите излагане на действието на антимикробните средства.

Стъпка 3: Ултразвукова обработка с ултразвуковия апарат за 96-ямкови плаки UIP400MTP

Етапът на ултразвукова обработка е от решаващо значение за отделяне на биофилмите от капаците с щифтове с цел оценка на жизнеспособността. Следвайте тези стъпки за ултразвуковия апарат UIP400MTP:

1. Подгответе системата:
   Добавете среда за възстановяване (напр. неутрализиращ бульон или прясна среда за растеж) във всяка ямка на нова 96-ямкова плака.
2. Прехвърлете капака с щифтове:
   Свалете капака с щифтове от плаката за антимикробно третиране.
   Изплакнете капака с щифтове в стерилен физиологичен разтвор или PBS, за да отстраните остатъчните антимикробни средства.
3. Позиционирайте плаката и ултразвуковия апарат:
   Поставете капака с щифтове върху плаката със средата за възстановяване.
   Поставете плаката със средата за възстановяване върху платформата на ултразвуковия апарат UIP400MTP, като се уверите, че плаката е центрирана и стабилна.
4. Настройте параметрите на ултразвуковата обработка:
   Задайте параметрите на ултразвуковата обработка на UIP400MTP (настройките могат да се адаптират към биофилма):
   Амплитуда: 70–100%.
   Време за ултразвукова обработка: 1–3 минути (адаптирайте според устойчивостта на биофилма) в цикличен режим.
5. Обработете с ултразвук:
   Стартирайте процеса на ултразвукова обработка. Ултразвуковите вибрации ще отделят биофилмите от повърхностите на щифтовете в средата за възстановяване.
6. Следете процеса:
   Използвайте включваемия температурен сензор, за да следите температурата на пробите в ямките. UIP400MTP може да бъде свързан с лабораторен чилър за охлаждане.
7. Действия след ултразвуковата обработка:
   Незабавно прехвърлете средата за възстановяване (която вече съдържа отделените биофилми) в нова стерилна плака за последващ анализ.

(A) Плака, съдържаща TSB с 2% глюкоза, използвана за образуване на биофилм, възстановяване на клетките и
определяне на MIC и MBCB; (B) Капак с щифтове за образуване на стафилококови биофилми. определяне на MIC и MBCB; (B) Капак с щифтове за образуване на стафилококови биофилми.
Клетките на биофилма, образуван върху щифтовете, бяха отделени чрез ултразвукова обработка (ултразвукова технология на Hielscher) за 5 min в 96-ямкови плаки, съдържащи прясна хранителна среда за възстановяване на клетките.
(Изображение и проучване: ©de Oliveira et al., 2016)

Стъпка 4: Оценка на жизнеспособността

Посейте и култивирайте отделените биофилми:

1. Извършете серийни разреждания на средата за възстановяване и посейте върху агар, за да преброите колониеобразуващите единици (CFU).
   Като алтернатива използвайте колориметричен или флуоресцентен анализ на жизнеспособността.
2. Запишете резултатите:
   Определете MBEC като най-ниската концентрация на антимикробното средство, която е елиминирала откриваемата жизнеспособност на биофилма.

Проектиране, производство и консултации – качество, произведено в Германия

Ултразвуковите апарати на Hielscher са добре известни със своите най-високи стандарти за качество и дизайн. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени инсталации. Ултразвуковите апарати на Hielscher лесно се справят със сурови условия и взискателни работни среди.

Hielscher Ultrasonics е компания, сертифицирана по ISO, и поставя специален акцент върху високопроизводителни ултразвукови апарати, отличаващи се с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher са в съответствие с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.

Прочетете тук как UIP400MTP се използва за отделяне на биофилми като стъпка при подготовката на проби в протокола ASTM E2799 за изпитване на ефикасността на дезинфектанти срещу биофилм на Pseudomonas aeruginosa чрез MBEC анализ.