Zülal çöküntülərinin ultrasəslə solubilizasiyası

Proteomikada nümunənin hazırlanması heç vaxt əhəmiyyətsiz bir detal deyil. İdentifikasiyanın dəqiqliyi, miqdar təyininin etibarlılığı və təkrarlana bilən nəticələr məhz bu təməl üzərində qurulur. Zülal nümunələrinin hazırlanmasında ən davamlı çətinliklərdən biri çökdürmə və ya qatılaşdırma mərhələlərindən sonra zülal çöküntülərinin səmərəli şəkildə yenidən həll edilməsidir. Məhz burada zülal çöküntülərinin ultrasəslə solubilizasiyası getdikcə daha böyük əhəmiyyət qazanır. Nəzarət olunan sonikasiya tətbiq etməklə laboratoriyalar zülalların bərpa olunmasını yaxşılaşdıra, çöküntünün həllini sürətləndirə və nümunələri sonrakı kütlə spektrometriyası və biokimyəvi analiz üçün daha effektiv hazırlaya bilərlər.

Zülalların solubilizasiyası: müasir proteomikada sonikasiya nə üçün vacibdir

Zülal çöküntüləri çox vaxt aseton, etanol, metanol–xloroform, ammonium sulfat və ya TCA ilə çökdürmə zamanı yaranır. Bu iş prosesləri analizdən əvvəl çirkləndiriciləri uzaqlaşdırmaq, zülalları qatılaşdırmaq və ekstraktları təmizləmək üçün geniş istifadə olunur. Lakin çökdürmə başa çatdıqdan sonra yaranan çöküntünü yenidən solubilizasiya etmək çətin ola bilər. Sıx aqreqatlar, hidrofob domenlər, membranla əlaqəli zülallar və güclü qarşılıqlı təsir göstərən zülal kompleksləri çox vaxt adi qarışdırmaya və ya vortekslə qarışdırmaya davamlı olur. Natamam solubilizasiya isə nümunə itkisinə, zülalların nümunədə qeyri-obyektiv təmsil olunmasına və təcrübələr arasında nəticələrin zəif təkrarlana bilməsinə səbəb ola bilər.
Sonikasiya məhz bu maneəni aradan qaldırır. Maye mühitdə mexaniki enerji yaratmaqla sonikasiya yığcam çöküntü strukturlarını parçalayır, buferin nüfuz etməsini asanlaşdırır və aqreqatlaşmış materialı məhlulda dispersləşdirir. Nəticədə zülallar daha sürətlə və çox vaxt daha tam şəkildə yenidən məhlula keçirilir; bu, məhdud miqdarda nümunələrlə, mürəkkəb lizatlarla və ya çətin proteomik hədəflərlə işləyərkən xüsusilə dəyərlidir.

Zülal çöküntülərini solubilizasiya etmək nə üçün çətindir

Zülalların çökdürülməsi effektivdir, çünki zülalları məhluldan çıxarır. Bununla belə, çökdürməni faydalı edən eyni proses çöküntüdən zülalların bərpa olunması problemini də yaradır. Çöküntü əmələ gəldikdən sonra zülallar sıx şəkildə yığıla və qismən denaturasiya oluna bilər. Hidrofob qarşılıqlı təsirlər güclənə, molekullararası bağlanma arta bilər və bəzi zülallar duzları, lipidləri, nuklein turşularını və ya matrisin digər komponentlərini öz daxilində saxlaya bilər. Hətta güclü solubilizasiya buferi istifadə edildikdə belə, passiv resuspenziya çox vaxt yavaş və natamam olur.
Proteomikada bu əhəmiyyətlidir, çünki çöküntünün natamam həlli yalnız ümumi çıxımı azaltmır. Bu, müəyyən zülal siniflərini, xüsusilə membran zülallarını, struktur zülallarını və ya aqreqatlaşmaya meyilli növləri seçici şəkildə istisna edə bilər. Bu isə yekun analitik nəticənin ilkin nümunənin həqiqi tərkibini artıq əks etdirməyə biləcəyi deməkdir. Miqdarda və ya posttranslyasion modifikasiyada cüzi fərqlərin bioloji baxımdan həlledici ola bildiyi yüksək ayırdetmə qabiliyyətli proteomikada hazırlıqdan qaynaqlanan belə təhrif ciddi məhdudiyyətdir.

Sonikasiya zülal çöküntülərinin solubilizasiyasını necə yaxşılaşdırır

Ultrasəs emalı nümunəyə yüksək tezlikli mexaniki enerji ötürməklə solubilizasiyanı yaxşılaşdırır. Bu enerji yığcam çöküntü materialının parçalanmasına kömək edir və solubilizasiya buferi ilə çöküntünün daxilindəki zülallar arasındakı təması artırır. Proses yalnız diffuziyaya və əl ilə qarışdırmaya əsaslanmaq əvəzinə çöküntünü həll edilməsi daha asan olan kiçik fraksiyalara fəal şəkildə dispersləşdirir.

Praktik təsir əhəmiyyətlidir. Sonikasiya aşağıdakılara imkan verə bilər:

• sıx və ya çətin həll olan zülal çöküntülərinin həllini sürətləndirmək
• zəif həll olan və aqreqatlaşmış zülalların bərpa olunmasını yaxşılaşdırmaq
• proteomika iş proseslərində hazırlıq müddətini azaltmaq
• parçalanma və analiz üçün daha homogen nümunələrin əldə olunmasını dəstəkləmək

Bu təkmilləşdirilmiş dispersləşmə çöküntülər karbamid, tiokarbamid, detergentlər, xaotrop maddələr və ya proteomikada geniş istifadə olunan digər reagentlər olan buferlərdə yenidən suspenziya halına gətirildikdə xüsusilə faydalıdır. Sonikasiya bu komponentlərin çöküntüyə daha səmərəli çatmasına və onu solubilizasiya etməsinə kömək edir, nəticədə daha vahid nümunə məhlulu yaranır.

Proteomikada ultrasəslə solubilizasiyanın üstünlükləri

Ultrasəslə solubilizasiyanın əsas üstünlüyü çox vaxt əhəmiyyəti lazımınca qiymətləndirilməyən bir hazırlıq mərhələsini idarə olunan və səmərəli prosesə çevirməsidir. Proteomikada bunun birbaşa analitik nəticələri var.

1. Birincisi, təkmilləşdirilmiş solubilizasiya fermentativ parçalanmaya daxil olan nümunənin bütün zülal populyasiyasını təmsil etməsi ehtimalını artırır. Məsələn, tripsinlə parçalanma zülalların kifayət qədər açılmış və məhlulda əlçatan olmasından asılıdır. Çöküntünün bəzi hissələri həll olunmamış qalarsa, həmin zülallar faktiki olaraq peptidlərin yaranmasından və buna görə də aşkarlanmadan kənarda qalır.
2. İkincisi, sonikasiya nəticələrin təkrarlana bilməsini yaxşılaşdıra bilər. Çöküntünün əl ilə yenidən suspenziya halına gətirilməsi mahiyyətcə dəyişkəndir, xüsusilə müxtəlif operatorlar, çöküntü ölçüləri və ya nümunə matrisləri olduqda. Nəzarət olunan ultrasəs emalı nümunəyə tətbiq edilən fiziki enerjini standartlaşdırır; bu, hazırlıqlar arasındakı dəyişkənliyi azalda və sonrakı LC-MS və ya gel əsaslı iş proseslərində nəticələrin uyğunluğunu yaxşılaşdıra bilər.
3. Üçüncüsü, ultrasəs emalı az miqdarda və qiymətli nümunələr üçün çox dəyərlidir. Klinik proteomika, biomarkerlərin aşkarlanması, hüceyrə kulturası təcrübələri və toxuma tədqiqatları çox vaxt məhdud miqdarda materiala əsaslanır. Solubilizasiya zamanı hər hansı zülal itkisi nümunənin informasiya dəyərini azaldır. Ultrasəslə səmərəli yenidən həll etmə mümkün qədər çox analitin qorunmasına kömək edir.
4. Nəhayət, sonikasiya iş prosesini sürətləndirməyə kömək edir. Çoxsaylı nümunələri emal edən proteomika laboratoriyalarına etibarlı, vaxta qənaət edən hazırlıq üsulları lazımdır. Tez və tam həll olan çöküntü yalnız rahatlıq yaratmır; o, gecikmələri azaldır, nümunə ilə işləmə səhvlərinin riskini aşağı salır və nümunələrin emal məhsuldarlığını artırır.

Sonikasiya və ənənəvi resuspenziya üsullarının müqayisəsi

Çöküntünün ənənəvi resuspenziya üsulları adətən pipetləmə, qarışdırma, vortekslə qarışdırma, uzunmüddətli inkubasiya və ya təkrar qızdırma mərhələlərini əhatə edir. Bu üsullar zəif sıxlaşmış çöküntülər üçün işləyə bilsə də, çox sıx və ya hidrofob zülal materialı ilə çox vaxt çətinlik çəkir. Təkcə mexaniki qarışdırma çöküntü strukturunu tam parçalamağa kifayət etməyə bilər və geridə görünən hissəciklər və ya görünməyən həll olmayan fraksiyalar qala bilər.
Sonikasiya daha fəal və məqsədyönlü yanaşma təqdim edir. Yavaş bufer diffuziyasından asılı olmaq əvəzinə çöküntünü fiziki olaraq parçalayır və sürətli homogenləşməni təşviq edir. Bu, uyğun resuspenziya buferinə ehtiyacı aradan qaldırmır, lakin həmin buferin effektivliyini əhəmiyyətli dərəcədə artırır.
Sırf əl ilə aparılan üsullarla müqayisədə ultrasəslə solubilizasiya çox vaxt prosesə daha yaxşı nəzarət, daha yüksək səmərəlilik və yüksək tələbləri olan proteomika tətbiqlərinə daha yaxşı uyğunluq təmin edir. Həm analitik keyfiyyət, həm də əməliyyat etibarlılığı axtaran laboratoriyalar üçün bu, sonikasiyanı cəlbedici seçimə çevirir.

Zülal çöküntülərinin ultrasəslə solubilizasiyası üçün ən uyğun tətbiq halları

Ultrasəslə solubilizasiya aşağıdakıları əhatə edən iş proseslərində xüsusilə faydalıdır:

• kütlə spektrometriyasından əvvəl zülalların çökdürülməsi,
• hüceyrə lizatlarından və ya toxuma ekstraktlarından alınmış çöküntülərin yenidən məhlula keçirilməsi,
• membranla zəngin və ya aqreqatlaşmaya meyilli zülalların bərpa olunması,
• və nəticələrin təkrarlana bilməsinin vacib olduğu kəmiyyət proteomikası üçün nümunələrin hazırlanması.

Bu üsul çöküntülər saxlanıldıqda, həddindən artıq qurudulduqda və ya mürəkkəb bioloji matrislərdən alındıqda da çox aktualdır. Belə hallarda passiv resuspenziya xüsusilə səmərəsiz ola bilər, sonikasiya isə daha az əl müdaxiləsi ilə nümunənin istifadəyə yararlılığını bərpa etməyə kömək edir.

Zülalların solubilizasiyası iş prosesiniz üçün ən yaxşı sonikatoru tapın!

Qiymətli nümunələrlə, az miqdarda materialla və ya yüksək nümunə emal məhsuldarlığı olan proteomika ilə işləyən laboratoriyalar üçün Hielscher portfeli iş prosesinə dəqiq uyğunlaşdırıla bilən bir neçə sonikasiya formatı təqdim edir.
İstər Hielscher zond tipli sonikatorunu, istər VialTweeter çoxsınaqşüşəli sonikatorunu, istərsə də UIP400MTP mikroplitə sonikatorunu seçin – hər ultrasəs cihazı modeli fərqli nümunə hazırlama ssenarisinə uyğundur və eyni əsas üstünlüyü paylaşır: nümunələrin səmərəli və nəzarət olunan emalı üçün təkrarlana bilən ultrasəs enerjisi.

Zond tipli sonikatorlar

UP200Ht kimi ultrasəs zondları ayrı-ayrı nümunələrin birbaşa sonikasiyası üçün xüsusilə uyğundur. Proteomika laboratoriyalarında zülal çöküntülərinin kiçik və orta həcmlərdə intensiv resuspenziyası tələb olunduqda, xüsusilə üsula nəzarətin və təkrarlana bilmənin vacib olduğu hallarda UP200Ht yaxşı seçimdir. Zondla birbaşa sonikasiya yığcam çöküntü materialını sürətlə parçalaya və solubilizasiya buferlərinin əks halda qismən həll olunmamış qalacaq zülallara çatmasına kömək edə bilər.
Bütün zond tipli sonikatorlara ümumi baxış!
 
 
 

VialTweeter çoxsınaqşüşəli sonikatoru

Bir neçə qapalı flakonun eyni şəraitdə emal edilməsi tələb olunduqda VialTweeter çoxsınaqşüşəli sonikatoru xüsusi üstünlük təqdim edir. VialTweeter steril şəraitdə bir neçə qapalı flakonu sonikasiya etməklə kiçik həcmlərin intensiv sonikasiyasına imkan verir. Bir neçə sınaq şüşəsində nümunələrin eyni şəraitdə eyni vaxtda hazırlanması, eləcə də qapalı flakonlarda emal zamanı çarpaz çirklənmə, nümunə itkisi və aerozol yaranması riskinin azalması VialTweeter cihazını nümunə hazırlığı üçün etibarlı alətə çevirir. Proteomikada bu, çoxsaylı təkrar nümunələrdən və ya klinik nümunələrdən alınmış qiymətli çöküntülərlə işləyərkən xüsusilə aktualdır, çünki sınaq şüşələri arasında şəraitin uyğunluğu həlledicidir.
VialTweeter haqqında daha çox məlumat əldə edin!

UIP400MTP mikroplitə sonikatoru

Yüksək nümunə emal məhsuldarlığı olan laboratoriyalar üçün UIP400MTP mikroplitə sonikatoru sonikasiyanın üstünlüklərini plitə əsaslı iş proseslərinə də gətirir. UIP400MTP, 96 yuvalı formatlar daxil olmaqla standart plitələrdə vahid ultrasəs emalı üçün mikroplitə və çoxyuvalı plitə sonikatoru kimi təqdim olunur və onun proteomika, diaqnostika və dərman kəşfi kimi sahələrdə avtomatlaşdırılmış nümunə hazırlığına uyğunluğu vurğulanır. Platforma çoxsaylı nümunələrin eyni vaxtda emalı üçün nəzərdə tutulub və çarpaz çirklənmə riskinin azalması, daha az əmək sərfi, nümunələrin bərpa olunmasının yaxşılaşması və avtomatlaşdırılmış iş proseslərinə inteqrasiya kimi üstünlüklər təqdim edir.
Praktik proteomikada bu, çöküntünün solubilizasiyası, hüceyrə lizisi, ekstraksiya və əlaqəli hazırlıq mərhələlərinin miqyasının daha səmərəli artırıla bilməsi deməkdir. Laboratoriyalar nümunələri bir-bir emal etmək əvəzinə bütün plitələri eyni enerji ötürülməsi ilə sonikasiya edə bilərlər. Bu, iş proseslərində nümunə emal məhsuldarlığını analitik ciddiliklə birləşdirmək lazım olduqda, məsələn, skrininq tədqiqatlarında, kəmiyyət proteomikasında və ya standartlaşdırılmış nümunə hazırlama proseslərində dəyərlidir. Buna görə UIP400MTP sadəcə rahatlıq yaradan alət deyil; o, avtomatlaşdırmaya, nəticələrin təkrarlana bilməsinə və etibarlı, yüksək nümunə emal məhsuldarlığı olan proteomikaya doğru daha geniş tendensiyanı dəstəkləyən platformadır.
UIP400MTP mikroplitə sonikatoru haqqında daha çox məlumat əldə edin!

Layihələndirmə, istehsal və məsləhət xidmətləri – Almaniya istehsalı keyfiyyət

Hielscher ultrasəs cihazları ən yüksək keyfiyyət və layihələndirmə standartları ilə tanınır. Möhkəmlik və istifadənin asanlığı ultrasəs cihazlarımızın sənaye müəssisələrinə problemsiz inteqrasiyasına imkan verir. Hielscher ultrasəs cihazları ağır şəraitin və yüksək tələbləri olan mühitlərin öhdəsindən asanlıqla gəlir.

Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatlı şirkətdir və ən müasir texnologiyaya, eləcə də istifadə rahatlığına malik yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs cihazlarına xüsusi diqqət yetirir. Əlbəttə, Hielscher ultrasəs cihazları CE tələblərinə uyğundur və UL, CSA və RoHs tələblərinə cavab verir.

Ədəbiyyat / İstinadlar

• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Susana Jorge, Kevin Pereira, Hugo López-Fernández, William LaFramboise, Rajiv Dhir, Javier Fernández-Lodeiro, Carlos Lodeiro, Hugo M. Santos, Jose L. Capelo-Martínez (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, Volume 206, 2020.
• Lindemann C, Lupilova N, Müller A, Warscheid B, Meyer HE, Kuhlmann K, Eisenacher M, Leichert LI. (2013): Redox proteomics uncovers peroxynitrite-sensitive proteins that help Escherichia coli to overcome nitrosative stress. Journal of Biological Chemistry 288(27); 2013. 19698-714.
• Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.