Ultrasəslə filtr dəstəkli nümunə hazırlığı (FASP): qabaqcıl sonikasiya ilə proteomik iş axınlarının təkmilləşdirilməsi

Ultrasəslə filtr dəstəkli nümunə hazırlığı (FASP) müasir proteomikada yüksək səmərəli və təkrarlana bilən nəticələr verən üsul kimi ön plana çıxır. Nəzarət olunan sonikasiyanı mövcud FASP iş axınlarına inteqrasiya etməklə tədqiqatçılar zülal ekstraksiyasını, parçalanma səmərəliliyini və məlumatların ümumi keyfiyyətini əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdıra bilərlər. Yüksək nümunə emalı məhsuldarlığına və təkrarlana bilən nümunə hazırlığına tələbat artdıqca, UIP400MTP mikroplitə sonikatoru kimi fokuslanmış sonikatorların elmi və praktik əhəmiyyəti artır.

Elmi kontekst: FASP proteomika üçün nə üçün əhəmiyyətlidir

Filtr dəstəkli nümunə hazırlığı (FASP) effektiv fermentativ parçalanmanı təmin etməklə yanaşı, detergentləri, duzları və digər çirkləndiriciləri uzaqlaşdırmaq qabiliyyəti sayəsində aşağıdan yuxarı proteomikada qızıl standarta çevrilmişdir. Bununla belə, klassik FASP protokolları çox vaxt natamam lizis, qeyri-sabit parçalanma və nümunələr arasındakı dəyişkənliklə bağlı məhdudiyyətlərlə üzləşir – xüsusilə mürəkkəb və ya davamlı bioloji hüceyrə və toxumalarla işləyərkən.
Məhz burada fokuslanmış ultrasəs enerjisi (sonikasiya) həlledici üstünlük təmin edir. Mexaniki kəsilmə qüvvələri və kavitasiya yaratmaqla sonikasiya zülalların bütövlüyünü pozmadan FASP iş axınının bir neçə mühüm mərhələsini təkmilləşdirir.

Ultrasəsli FASP-da sonikasiyanın müsbət təsirləri

Sonikasiya nəzarət olunan akustik kavitasiya – mikroskopik qabarcıqların yaranması və çökməsi – yaradır və bu, lokal kəsilmə qüvvələri və mikroaxınlar əmələ gətirir.
Sonikasiya kütlə ötürülməsini yaxşılaşdırmaq və reaksiya kinetikasını sürətləndirməklə ultrasəsli FASP-da həm alkilləşmə, həm də parçalanma mərhələlərini təkmilləşdirir. Ultrasəs enerjisinin tətbiqi kavitasiya yaradır; bunun nəticəsində əmələ gələn lokal mikroaxınlar və qısamüddətli kəsilmə qüvvələri sürətli qarışmanı və reagentlərin zülal matrisinə və ya filtr mühitinə effektiv nüfuzunu təmin edir. Alkilləşmə zamanı bu, sistein qalıqlarının yodasetamidlə daha bərabər və daha sürətli modifikasiyasına səbəb olur. Parçalanma mərhələsində sonikasiya proteolitik parçalanma sahələrinin əlçatanlığını artırır və ferment–substrat qarşılıqlı təsirlərini yaxşılaşdırır, bununla da tripsinin aktivliyini sürətləndirir və parçalanma səmərəliliyini artırır. Ümumilikdə, ultrasəs emalı reaksiyanın tamamlanma dərəcəsini və nəticələrin təkrarlana bilməsini qoruyaraq və ya yaxşılaşdıraraq emal müddətini azaldır.

Proteomika üçün nümunə hazırlığında ultrasəsli FASP aşağıdakı nəticələri təmin edir:

• Hətta davamlı toxumalarda və ya mikrob nümunələrində belə daha effektiv hüceyrə dağıdılması və zülal ekstraksiyası
• Zülalların solubilizasiyasının yaxşılaşdırılması
• Parçalanma zamanı fermentin əlçatanlığının yaxşılaşdırılması
• Emal müddətinin azaldılması və nəticələrin təkrarlana bilməsinin artırılması

Ənənəvi mexaniki və ya kimyəvi lizis üsullarından fərqli olaraq, ultrasəs emalı yüksək dərəcədə idarə oluna bilir və miqyası artırıla bilir; bu da onu standartlaşdırılmış proteomika iş axınları üçün xüsusilə uyğun edir.

Ultrasəsli FASP-ın ənənəvi yanaşmalarla müqayisədə üstünlükləri

Sonikasiyanın FASP protokollarına inteqrasiyası sonrakı kütlə spektrometriyası nəticələrinə birbaşa təsir edən ölçülə bilən faydalar təmin edir.
Ultrasəsli FASP xüsusilə lifli toxumalar və ya bioplyonkalar kimi çətin nümunələrdən zülalların daha tam əldə edilməsinə imkan verir. Enerjinin bərabər paylanması təkrar nümunələrin eyni şəkildə emalını təmin edərək dəyişkənliyi azaldır – bu, kəmiyyət proteomikası üçün əsas tələbdir.
Bundan əlavə, sonikasiya ferment–substrat qarşılıqlı təsirini yaxşılaşdırmaqla parçalanma kinetikasını sürətləndirir. Bu, çox vaxt ardıcıllığın əhatə dərəcəsini qoruyaraq parçalanma müddətinin qısalmasına və peptid çıxımının artmasına səbəb olur.
İş axını baxımından ultrasəs sistemləri əl ilə müdaxiləni azaldır və aqressiv kimyəvi emala ehtiyacı aradan qaldıraraq nümunənin bütövlüyünü qoruyur və protokolun standartlaşdırılmasını sadələşdirir.

Gecə ərzində aparılan FASP ilə müqayisədə ultrasəsli FASP vasitəsilə müəyyən edilmiş zülalların sayının artmasını göstərən Venn diaqramı
Şəkil və tədqiqat: ©Carvalho et al., 2020

Protokol: UIP400MTP ilə yüksək nümunə emalı məhsuldarlığına malik ultrasəsli FASP

Böyük nümunə qruplarını emal edən laboratoriyalar üçün UIP400MTP mikroplitə sonikatoru standart çoxyuvalı plitələrin (məsələn, 96 yuvalı plitələrin) eyni vaxtda sonikasiyasına imkan verərək nümunə emalı məhsuldarlığını və nəticələrin təkrarlana bilməsini əhəmiyyətli dərəcədə artırır.
Bu formatda nümunələr (adətən hər yuva üçün 50–200 µL) birbaşa ultrafiltrasiyaya və ya sonrakı emala uyğun mikroplitələrdə hazırlanır. Lizis buferləri standart FASP protokollarında istifadə olunanlara bənzəyir.

UIP400MTP bütün yuvalara bərabər ultrasəs enerjisi tətbiq edir. Sonikasiya adətən nümunənin növündən asılı olaraq 60–80% amplitudada 2–4 dəqiqə ərzində aparılır. Qoşula bilən temperatur sensorundan istifadə edərək temperatura nəzarət edin. İmpuls rejimində sonikasiyadan və istəyə görə laboratoriya soyuducusundan istifadə edin.

Nümunə protokol:

1. Alkilləşmə mərhələsi üçün nümunələr mikroplitə sonikatorundan (UIP400MTP) istifadə etməklə 40% amplitudada 7 dövr ərzində sonikasiya olunur (30 s aktiv, 15 s fasilə; ümumi sonikasiya müddəti: 5 min 45 s).
2. Sonikasiyadan sonra yodasetamid (IAA) məhlulu sentrifuqalama ilə uzaqlaşdırılır. Tripsinlə parçalanmadan əvvəl fermentativ aktivliyi inhibə edən güclü xaotrop agent olan qalıq karbamidi uzaqlaşdırmaq üçün nümunələr yuyulmalıdır. Buna görə nümunələr 200 μL həcmində 25 mM ammonium bikarbonat (AmBic) məhlulu ilə iki dəfə yuyulur.
3. Daha sonra 12,5 mM ammonium bikarbonat məhlulunda hazırlanmış 100 μL tripsin məhlulu (fermentin zülala nisbəti 1:30) əlavə edilir. Ardınca zülalların parçalanması UIP400MTP cihazından istifadə etməklə eyni sonikasiya şəraitində aparılır (40% amplituda, 7 dövr, 30 s aktiv / 15 s fasilə; ümumi müddət: 5 min 45 s).
4. Sonikasiyadan sonra nümunələr filtr plitələrinə köçürülür və ya plitə əsaslı FASP sistemlərindən istifadə etməklə emal olunur. Reduksiya və alkilləşmə mərhələləri plitə daxilində aparılaraq səmərəli iş axını qorunur.
5. Tripsinlə parçalanma nəzarət olunan şəraitdə (məsələn, 37°C, 4–16 saat) aparılır; fermentativ aktivliyi sürətləndirmək və peptid çıxımını artırmaq üçün qısamüddətli ultrasəs stimullaşdırılması tətbiq edilə bilər.
6. Peptidlər sentrifuqalama ilə əldə edilir və LC-MS/MS analizinə hazır olur.

Bu sistemin əsas üstünlüyü bütün yuvalarda eyni emal şəraitini təmin etmək qabiliyyətindədir; bu, partiya təsirlərini minimuma endirir və genişmiqyaslı proteomika tədqiqatlarında etibarlı kəmiyyət müqayisələrinə imkan verir.

Layihələndirmə, istehsal və məsləhət xidmətləri – Almaniya istehsalı keyfiyyət

Hielscher ultrasəs cihazları ən yüksək keyfiyyət və dizayn standartları ilə tanınır. Möhkəmlik və asan istismar ultrasəs cihazlarımızın sənaye müəssisələrinə problemsiz inteqrasiyasına imkan verir. Hielscher ultrasəs cihazları sərt şəraitin və yüksək tələblər qoyan mühitlərin öhdəsindən asanlıqla gəlir.

Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatlı şirkətdir və ən müasir texnologiyaya və istifadə rahatlığına malik yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs cihazlarına xüsusi diqqət yetirir. Əlbəttə, Hielscher ultrasəs cihazları CE tələblərinə uyğundur və UL, CSA və RoHs tələblərinə cavab verir.

Ədəbiyyat / İstinadlar

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).