Yüksək nümunə emal məhsuldarlığı ilə zülal həzmini əhatə edən proteomik iş axınları

Proteomika bioloji prosesləri və sistemləri anlamaq üçün mühüm sahədir və zülal həzmi onun iş axınlarında əsas mərhələlərdən biridir. Ənənəvi olaraq, zülal həzmi məhlulda tripsin kimi proteolitik fermentlərdən istifadə etməklə aparılır; tripsin lizin və arginin qalıqlarındakı peptid rabitələrini spesifik olaraq hidroliz edir. Bu proses kütlə spektrometriyası (MS) tətbiqlərində ionlaşma və fraqmentləşmə üçün əlverişli peptidlər yaradır. Lakin ənənəvi həzm üsullarının tamamlanması üçün 12–24 saat tələb olunur ki, bu da proteomik iş axınlarında ciddi ləngimələr yaradır.
Ultrasəslə işləmə güclü alternativ təqdim edərək həzm müddətini saatlardan cəmi bir neçə dəqiqəyə qədər kəskin şəkildə qısaldır. Hielscher CupHorn, VialTweeter və 96 quyulu lövhə sonikatoru UIP400MTP kimi qabaqcıl, çoxsaylı nümunələr üçün sonikatorlarla birləşdirildikdə, ultrasəslə işləmə sürətləndirilmiş və yüksək nümunə emal məhsuldarlığına malik proteomikanı mümkün edir. Bu texnologiyalar təkrarlanabilirliyə və ya məlumatların keyfiyyətinə xələl gətirmədən nümunələrin hazırlanma müddətini azaldaraq və səmərəliliyi artıraraq iş axınlarını sadələşdirir.

Zülal həzmində ultrasəs enerjisinin rolu

Ultrasəslə işləmə fokuslanmış ultrasəs dalğalarından istifadə edərək kavitasiya yaradır – lokal mikroqabarcıqlar çökərək güclü kəsilmə qüvvələri əmələ gətirir. Bu hadisə kütlə ötürülməsini gücləndirir, fermentlərin substratlarla qarışmasını yaxşılaşdırır və zülal strukturlarını açaraq parçalanma sahələrini tripsin kimi proteolitik fermentlər üçün əlçatan edir.
Nəticə? Səmərəliliyə və ya təkrarlanabilirliyə xələl gətirmədən həzm müddətinin əhəmiyyətli dərəcədə azalması.

Ultrasəslə gücləndirilmiş proteolitik həzm: metodologiya və nəticələr

Sürətləndirilmiş həzm protokolu

Ultrasəsin köməyi ilə həzm iş axınlarını sürətləndirmək üçün proteolitik fermentləri və ultrasəs enerjisini birləşdirir. Məsələn, Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) istifadə edildikdə, həzm iş axını aşağıdakı kimi aparılır:

1. Reduksiya: Zülal nümunələri (0,5 mg/mL, 20 µL) ammonium bikarbonat buferində (12,5 mM) DTT (2 µL, 110 mM) ilə işlənir. 5 dəqiqə ərzində 50% amplitudada ultrasəs tətbiq edilir.
2. Alkilləşmə: IAA (2 µL, 400 mM) əlavə edildikdən sonra eyni şəraitdə ultrasəslə işləmə təkrarlanır.
3. Həzm: Nümunələr durulaşdırılır və üzərində tripsin immobilizə edilmiş nanohissəciklərlə inkubasiya edilir. Son ultrasəslə işləmə mərhələsi (5 dəqiqə) həzmi tamamlayır. Peptidlər ayrılır, qurudulur və MS analizi üçün saxlanılır.

Bu ultrasəs üsulu ümumi hazırlıq müddətini 12 saatdan 30 dəqiqədən az müddətə endirir. Prosesin sürətləndirilməsinə baxmayaraq, peptid çıxımı və keyfiyyəti ənənəvi gecəboyu üsullarla uyğun səviyyədə qalır.

Ultrasəslə zülal həzminin səmərəliliyi

E. coli proteomlarından istifadə edilən müqayisəli tədqiqatlarda:

• Zülalların identifikasiyası: Ultrasəslə həzm edilmiş nümunələrdə 5 dəqiqə ərzində 777 zülal identifikasiya edilmişdir; müqayisə üçün, 12 saat ərzində 817 zülal identifikasiya edilmişdir. Hər iki üsulla identifikasiya edilən ortaq zülalların payı 70%-dən çox olmuşdur.
• Təkrarlanabilirlik: Təkrar analizlər hər bir üsul daxilində 98%-dən yüksək korrelyasiya qiymətləri göstərərək etibarlılığı nümayiş etdirmişdir.
• Seçicilik: Hər bir üsul müəyyən zülalları üstünlüklə həzm etmişdir: ultrasəs həzmi 65 zülala, gecəboyu həzm isə 54 zülala üstünlük vermişdir. Belə incə fərqlər ultrasəslə işləmənin spesifik tətbiqlər üçün özünəməxsus potensialını vurğulayır.

Markalanmadan zülal kəmiyyət təyininin nəticələri: yeddi zülalın əlavə edildiyi E. coli
nümunəsi. Aşağıdakı zülallar iki fərqli səviyyədə əlavə edilmişdir; bu səviyyələr
“Theo Ratio” adlı sütunda göstərilmişdir. Theo Ratio bu
təcrübədə istifadə edilən iki səviyyə arasındakı nəzəri nisbətdir. İnək serum albumini (ALBU), β-laktoqlobulin (LACB), α-S1 kazein (CASA1),
α-S2 kazein (CASA2), sitoxrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) və karboanhidraza 2
(CAH2). Nisbətlər LFQ zülal intensivlikləri əsasında hesablanmışdır; bu intensivliklər MaxQuant
analizindən əldə edilmişdir. Hər bir üsulla əldə edilən qiymətləri müqayisə etmək üçün Styudentin t testi tətbiq edilmişdir (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Tədqiqat və qrafik: © Martins et al., 2019)

Nanohissəciklər üzərində immobilizə edilmiş tripsin

Üzərində tripsin immobilizə edilmiş nanohissəciklərin (məsələn, T-FMNPs) ultrasəslə işləmə ilə birləşdirilməsi proteomika iş axınlarını daha da təkmilləşdirir. Bu nanohissəciklər ferment–substrat qarşılıqlı təsirləri üçün böyük səth sahəsi təmin edərək səmərəliliyi artırır. E. coli kimi mürəkkəb proteomlara tətbiq edildikdə, birləşdirilmiş üsul aşağıdakıları təmin edir:

• Sürət: 5 dəqiqə ərzində tam həzm.
• Dəqiqlik: Ənənəvi üsullarla müqayisə edilə bilən zülal kəmiyyət təyini (p > 0,01, n=3).
• Miqyaslandırıla bilmə: UIP400MTP kimi çoxquyulu platformalara uyğunlaşdırma yüksək nümunə emal məhsuldarlığını mümkün edir.

Addım-addım təlimatları olan ətraflı protokol üçün buraya klikləyin!
(bax: Martins et al., 2019)

Hielscher sonikatorları ilə yüksək sürətli və yüksək nümunə emal məhsuldarlığına malik proteolitik həzm

Proteomika üçün ən yaxşı sonikator modelləri

Hielscher Ultrasonics yüksək nümunə emal məhsuldarlığına malik iş axınlarını asanlaşdıran, çoxsaylı nümunələrin eyni vaxtda hazırlanması üçün müxtəlif sonikator modelləri təklif edir. Flakonlarla, sınaq boruları ilə, çoxquyulu lövhələrlə (məsələn, 6, 24, 96 quyulu lövhələr) və ya Petri qabları ilə işləməyinizdən asılı olmayaraq – təcrübələriniz üçün ideal sonikatorları sizə təklif edirik.

UIP400MTP çoxquyulu lövhə sonikatoru

Ən yüksək nümunə emal məhsuldarlığı üçün UIP400MTP 96 quyulu lövhələri ultrasəslə işləmək imkanı verir. İstənilən standart mikrolövhə ilə uyğun olan UIP400MTP bahalı, istehsalçıya məxsus birdəfəlik sərf materialları tələb etmir və tədqiqatınız üçün ən yaxşı çoxquyulu lövhəni seçmək azadlığı verir. Lövhə boyunca enerjini bərabər paylayaraq cəmi 1 saat ərzində 200-ə qədər mürəkkəb proteomun sürətli reduksiyasını, alkilləşməsini və həzmini mümkün edir. Bu avtomatlaşdırma və səmərəlilik səviyyəsi yüksək nümunə emal məhsuldarlığına malik proteomika və klinik tətbiqlər üçün həlledici əhəmiyyət daşıyır. Çoxquyulu lövhə sonikatoru haqqında daha çox məlumat əldə edin!

VialTweeter

VialTweeter 10-a qədər flakonun və ya sınaq borusunun eyni vaxtda ultrasəslə işlənməsini tələb edən laboratoriyalar üçün uyğunlaşdırılmışdır. Onun qeyri-invaziv yanaşması təkrarlanabilən zülal həzmini təmin etməklə yanaşı, çarpaz çirklənmə risklərini aradan qaldırır. Bu cihaz məhdud nümunə həcmləri və ya müxtəlif nümunə növləri ilə işləyən tədqiqatçılar üçün idealdır.
Çoxsaylı borular üçün VialTweeter sonikatoru haqqında daha çox məlumat əldə edin!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn sonikatoru hermetik qablarda çoxsaylı nümunələrin eyni vaxtda işlənməsi üçün nəzərdə tutulmuş güclü cihazdır. O, ultrasəs enerjisinin bərabər paylanmasını və temperaturun dəqiq idarə edilməsini təmin edir. Beşə qədər nümunəni eyni vaxtda işləmək imkanı və reduksiya, alkilləşmə və həzm mərhələlərini əhatə edən iş axınları ilə uyğunluğu sayəsində CupHorn MS əsaslı proteomika üçün etibarlı alətdir.
CupHorn SonoReactor haqqında daha çox məlumat əldə edin!

Nanohissəciklər üzərində immobilizə edilmiş tripsindən istifadə etməklə ultrasəsin köməyi ilə proteolitik həzm üçün addım-addım protokol

Martins et al. (2019) tərəfindən hazırlanmış bu protokol ultrasəs enerjisindən və nanohissəciklər üzərində immobilizə edilmiş tripsindən (T-FMNPs) istifadə etməklə sürətli zülal həzmi üçün optimallaşdırılmışdır. Göstərilən addımlar kütlə spektrometriyası (MS) tətbiqlərinə uyğun səmərəli reduksiya, alkilləşmə və proteolizi təmin edir.
Protokolun mərhələləri

1. Disulfid rabitələrinin reduksiyası
   • AmBic buferindəki 20 µL zülal nümunəsinə (0,5 mg/mL) 2 µL DTT məhlulu (110 mM) əlavə edin.
   • Nümunə borusunu UP200St-CupHorn sonoreaktoruna yerləşdirin.
   • Nümunəni 2,5 dəqiqə ərzində 50% amplitudada ultrasəslə işləyin (200 W, 26 kHz).
   • Soyumaya imkan vermək üçün qısa fasilə verin, sonra eyni şəraitdə daha 2,5 dəqiqə ultrasəslə işləyin.
2. Reduksiya edilmiş sistein qalıqlarının alkilləşməsi
   • Reduksiya edilmiş zülal nümunəsinə 2 µL IAA məhlulu (400 mM) əlavə edin.
   • Alkilləşməni asanlaşdırmaq üçün 2,5 dəqiqə ərzində 50% amplitudada ultrasəslə işləyin.
   • Soyuma üçün fasilə verin, sonra əlavə 2,5 dəqiqə ultrasəslə işləyin.

   Qeyd: IAA-nın parçalanmasının qarşısını almaq üçün alkilləşmiş nümunənin işığa məruz qalmasını minimuma endirin.

3. Nümunənin durulaşdırılması
   • 4% asetonitril (v/v) ehtiva edən 25 mM AmBic buferindən istifadə edərək alkilləşmiş zülal nümunəsini son həcmi 100 µL olacaq şəkildə durulaşdırın.
   • Yumşaq pipetləmə ilə yaxşıca qarışdırın.
4. Nanohissəciklər üzərində immobilizə edilmiş tripsinlə proteolitik həzm
   • Durulaşdırılmış zülal nümunəsinə 20 µL T-FMNP məhlulu (3 mg/mL) əlavə edin.
   • Qarışığı sonoreaktorda 2,5 dəqiqə ərzində 50% amplitudada ultrasəslə işləyin.
   • Soyuma üçün fasilə verin, sonra eyni şəraitdə daha 2,5 dəqiqə ultrasəslə işləyin.
5. Tripsin daşıyan nanohissəciklərin ayrılması
   • T-FMNPs-i həzm nəticəsində alınmış peptidləri ehtiva edən supernatantdan ayırmaq üçün maqnitdən istifadə edin.
   • Supernatantı yeni mikrosentrifuqa borusuna köçürün.
6. Peptidlərin MS analizi üçün hazırlanması
   • Peptidləri ehtiva edən supernatantı vakuum sentrifuqasında qurudun.
   • Qurudulmuş peptidləri kütlə spektrometriyası ilə sonrakı analizə qədər -20°C-də saxlayın.