Yüksək məhsuldarlıqlı protein həzmi ilə proteomik iş axınları

Proteomika bioloji prosesləri və sistemləri başa düşmək üçün vacib bir sahədir, zülal həzmi onun iş prosesində kritik bir addım təşkil edir. Ənənəvi olaraq, zülalın həzmi lizin və arginin qalıqlarında peptid bağlarını xüsusi olaraq hidroliz edən tripsin kimi proteolitik fermentlərdən istifadə edərək məhlulda həyata keçirilir. Bu proses kütləvi spektrometriya (MS) tətbiqlərində ionlaşma və parçalanma üçün yaxşı uyğun gələn peptidlər yaradır. Bununla belə, adi həzm üsulları proteomik iş axınlarında əhəmiyyətli darboğazlar yaradaraq, tamamlanması üçün 12-24 saat tələb edir.
Ultrasonication güclü alternativ təklif edir, həzm müddətini saatlardan bir neçə dəqiqəyə qədər kəskin şəkildə qısaldır. Hielscher CupHorn, VialTweeter və 96 quyu boşqab sonikatoru UIP400MTP kimi qabaqcıl çox nümunəli sonikatorlarla birləşdirildikdə, ultrasəs sürətləndirilmiş, yüksək məhsuldarlıqlı proteomikaya imkan verir. Bu texnologiyalar iş axınlarını sadələşdirir, nümunənin hazırlanması vaxtını azaldır və təkrar istehsal və məlumat keyfiyyətinə xələl gətirmədən səmərəliliyi artırır.

Protein həzmində ultrasəs enerjisinin rolu

Ultrasonikasiya kavitasiya yaratmaq üçün fokuslanmış ultrasəs dalğalarından istifadə edir - sıx kəsmə qüvvələri yaratmaq üçün dağılan lokallaşdırılmış mikro qabarcıqlar. Bu fenomen kütlə ötürülməsini artırır, fermentlərin substratlarla qarışmasını təşviq edir və protein strukturlarını açır, parçalanma yerlərini tripsin kimi proteolitik fermentlərə məruz qoyur.
Nəticə? Səmərəliliyə və ya təkrar istehsal qabiliyyətinə zərər vermədən həzm müddətinin əhəmiyyətli dərəcədə azalması.

Ultrasonik-Təkmilləşdirilmiş Proteolitik Həzm: Metodologiya və Nəticələr

Sürətlənmiş həzm protokolu

Ultrasonik yardımlı həzm iş axını sürətləndirmək üçün proteolitik fermentləri və ultrasəs enerjisini birləşdirir. Məsələn, Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) istifadə edərək, həzm iş prosesi aşağıdakı kimi davam edir:

1. Azaldılması: Zülal nümunələri (0,5 mq/mL, 20 µL) ammonium bikarbonat tamponunda (12,5 mM) DTT (2 µL, 110 mM) ilə müalicə olunur. Sonikasiya 5 dəqiqə ərzində 50% amplituda tətbiq olunur.
2. Alkilasiya: IAA (2 µL, 400 mM) əlavə edildikdən sonra sonikasiya eyni şəraitdə təkrarlanır.
3. Həzm: Nümunələr seyreltilir və hərəkətsizləşdirilmiş tripsin nanohissəcikləri ilə inkubasiya edilir. Sonikasiya mərhələsi (5 dəqiqə) həzmi tamamlayır. Peptidlər ayrılır, qurudulur və MS analizi üçün saxlanılır.

Bu ultrasəs metodu ümumi hazırlıq müddətini 12 saatdan 30 dəqiqəyə qədər azaldır. Sürətləndirilmiş prosesə baxmayaraq, peptid məhsuldarlığı və keyfiyyəti ənənəvi gecələmə üsullarına uyğun olaraq qalır.

Ultrasonik Protein Həzminin Səmərəliliyi

E. coli proteomlarından istifadə edilən müqayisəli tədqiqatlarda:

• Protein İdentifikasiyası: Ultrasəslə həzm olunan nümunələr 12 saatda 817 zülal olduğu halda, 5 dəqiqə ərzində 777 zülal müəyyən etdi. Paylaşılan protein identifikasiyası 70%-i keçdi.
• Təkrarlanma qabiliyyəti: Təkrarlanan təhlillər etibarlılığı nümayiş etdirərək hər bir metodda 98%-dən yuxarı korrelyasiya dəyərlərini göstərdi.
• Seçicilik: Müəyyən zülallar üstünlüklə hər bir üsulla həzm olundu, ultrasəs həzmində 65 zülal və bir gecədə 54 zülal həzm olundu. Belə nüanslı fərqlər xüsusi tətbiqlər üçün ultrasəslənmənin unikal potensialını vurğulayır.

Yeddi sünbüllü zülalın E. coli halına gətirdiyi etiketsiz zülalın kəmiyyət göstəriciləri
nümunə. Aşağıdakı zülallar sütunda qeyd edildiyi kimi iki fərqli səviyyədə əlavə edilmişdir
“Theo Ratio” olaraq adlandırılır. Theo Ratio, burada istifadə olunan iki səviyyə arasındakı nəzəri nisbətdir
təcrübə. İnək serum albumini (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1 kazein (CASA1),
α-S2 kazein (CASA2), sitoxrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) və karbonik anhidraz 2
(CAH2). Nisbətlər MaxQuant-dan əldə edilən LFQ zülal intensivliyindən istifadə etməklə hesablanmışdır
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Tədqiqat və qrafika: © Martins et al., 2019)

Nanohissəciklər-immobilizasiya olunmuş tripsin

İmmobilizasiya olunmuş tripsin nanohissəciklərinin (məsələn, T-FMNPs) ultrasəslə inteqrasiyası proteomik iş axınını daha da artırır. Bu nanohissəciklər ferment-substrat qarşılıqlı əlaqəsi üçün yüksək səth sahəsi təmin edərək səmərəliliyi artırır. E. coli kimi mürəkkəb proteomlara tətbiq edildikdə, birləşdirilmiş üsul aşağıdakılara nail olur:

• Sürət: 5 dəqiqə ərzində həzmi tamamlayın.
• Dəqiqlik: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Ölçeklenebilirlik: UIP400MTP kimi çox quyulu platformalara uyğunlaşma yüksək məhsuldarlıqlı emal etməyə imkan verir.

Addım-addım təlimatlarla ətraflı protokol üçün buraya basın!
(müq. Martins və başqaları, 2019)

Hielscher sonikatorları ilə yüksək sürətli və yüksək məhsuldarlıqla proteolitik həzm

Proteomika üçün Ən Yaxşı Sonicator Modelləri

Hielscher Ultrasonics, yüksək məhsuldarlıqlı iş axınlarını asanlaşdıran eyni vaxtda çox nümunəli hazırlıq üçün müxtəlif sonikator modelləri təklif edir. İstər flakonlar, istər sınaq boruları, istərsə də çox quyulu boşqablar (məsələn, 6, 24, 96 quyu boşqabları) və ya Petri qabları ilə işləsəniz – biz sizə təcrübələriniz üçün ideal sonikatorları təklif edirik.

UIP400MTP çox quyulu boşqab sonikatoru

Son məhsuldarlıq üçün UIP400MTP 96 quyulu lövhələri ultrasəs üsulu ilə emal etmək qabiliyyətini təmin edir. İstənilən standart mikroplata ilə uyğun gələn UIP400MTP bahalı birdəfəlik istifadəlik əşyalara ehtiyac duymur və sizə tədqiqatınız üçün ən yaxşı çoxlu quyu boşqabını seçmək azadlığı verir. Plitə boyunca vahid enerji ötürməklə, cəmi 1 saat ərzində 200-ə qədər kompleks proteomun sürətli reduksiyasını, alkilləşməsini və həzmini təmin edir. Bu avtomatlaşdırma və səmərəlilik səviyyəsi yüksək məhsuldarlıqlı proteomika və klinik tətbiqlər üçün çox vacibdir. Çox quyulu boşqab sonikatoru haqqında daha çox məlumat əldə edin!

VialTweeter

VialTweeter 10 flakon və ya sınaq borusunun eyni vaxtda sonikasiyası tələb olunan laboratoriyalar üçün hazırlanmışdır. Onun qeyri-invaziv yanaşması təkrarlanan zülal həzmini təmin edərkən çarpaz çirklənmə risklərini aradan qaldırır. Bu cihaz məhdud nümunə həcmləri və ya müxtəlif nümunə növləri ilə işləyən tədqiqatçılar üçün idealdır.
VialTweeter çox borulu sonikator haqqında daha çox məlumat əldə edin!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn sonikatoru möhürlənmiş qablarda çoxsaylı nümunələrin eyni vaxtda emalı üçün nəzərdə tutulmuş güclü cihazdır. Bu, ultrasəs enerjisinin vahid paylanmasını və dəqiq temperatur nəzarətini təmin edir. Beş nümunəyə qədər eyni vaxtda emal etmək qabiliyyəti, azaldılmış, alkilləşdirilmiş və həzm olunmuş iş axınları ilə uyğunluğu ilə birlikdə CupHorn-u MS əsaslı proteomika üçün etibarlı alətə çevirir.
CupHorn SonoReactor haqqında daha çox məlumat əldə edin!

Nanohissəciklər-immobilizasiya edilmiş tripsindən istifadə edərək ultrasəslə dəstəklənən proteolitik həzm üçün addım-addım protokol

Bu protokol Martins et al. (2019) ultrasəs enerjisi və nanohissəciklərlə immobilizasiya olunmuş tripsin (T-FMNPs) istifadə edərək sürətli zülal həzmi üçün optimallaşdırılmışdır. Göstərilən addımlar kütləvi spektrometriya (MS) tətbiqləri üçün uyğun olan səmərəli reduksiya, alkilləşmə və proteolizi təmin edir.
Protokol addımları

1. Disulfid Bağlarının Azaldılması
   • AmBic buferində 20 µL protein nümunəsinə (0,5 mq/mL) 2 µL DTT məhlulu (110 mM) əlavə edin.
   • Nümunə borusunu UP200St-CupHorn sonoreaktoruna yerləşdirin.
   • Nümunəni 2,5 dəqiqə 50% amplituda (200 Vt, 26 kHz) sonikasiya edin.
   • Soyumağa imkan vermək üçün qısa bir fasilə verin, sonra eyni şəraitdə daha 2,5 dəqiqə sonikləşdirin.
2. Azaldılmış sistein qalıqlarının alkilasiyası
   • Azaldılmış protein nümunəsinə 2 µL IAA məhlulu (400 mM) əlavə edin.
   • Alkilləşməni asanlaşdırmaq üçün 50% amplituda 2,5 dəqiqə sonikasiya edin.
   • Soyutma üçün fasilə verin, sonra əlavə 2,5 dəqiqə sonikləşdirin.

   Qeyd: IAA deqradasiyasının qarşısını almaq üçün alkilləşdirilmiş nümunənin işığa məruz qalmasını minimuma endirin.

3. Nümunə Seyreltmə
   • Tərkibində 4% asetonitril (v/v) olan 25 mM AmBic buferindən istifadə edərək alkilləşdirilmiş zülal nümunəsini 100 µL yekun həcmə qədər seyreltin.
   • Zərif pipetləmə ilə hərtərəfli qarışdırın.
4. Nanohissəciklər-immobilizasiya olunmuş tripsinlə proteolitik həzm
   • Seyreltilmiş zülal nümunəsinə 20 µL T-FMNP məhlulu (3 mq/mL) əlavə edin.
   • Qarışığı sonoreaktorda 2,5 dəqiqə 50% amplituda sonikləşdirin.
   • Soyutma üçün fasilə verin, sonra eyni şəraitdə daha 2,5 dəqiqə sonikləşdirin.
5. Tripsin nanohissəciklərinin ayrılması
   • T-FMNP-ləri həzm olunmuş peptidləri olan supernatantdan ayırmaq üçün maqnitdən istifadə edin.
   • Supernatantı yeni mikrosentrifuqa borusuna köçürün.
6. MS Analizi üçün Peptid Hazırlanması
   • Tərkibində peptidlər olan supernatantı vakuum sentrifuqasında qurutun.
   • Qurudulmuş peptidləri -20°C-də kütləvi spektrometriya ilə sonrakı analizə qədər saxlayın.