Ultrasonik DNT kəsimi

DNT və RNT-nin kəsilməsi zamanı uzun DNT molekulları daha kiçik parçalara parçalanır ki, bu da gələcək nəsil ardıcıllıq (NGS) kitabxanasının qurulması üçün nümunələrin hazırlanmasında mühüm addımdır. Ultrasonik DNT kəsmə DNT və ya RNT-ni 100 bp ilə 5 kb arasında dəyişən parçalara parçalamaq üçün akustik kavitasiya qüvvələrini istifadə edir. Bu üsul, optimal ardıcıllıq nəticələri üçün istənilən DNT uzunluğuna fərdiləşdirməni asanlaşdıraraq, fraqment ölçüsünə dəqiq nəzarət etməyə imkan verir.

Ultrasonication istifadə edərək DNT kəsmə

Hielscher Ultrasonics DNT, RNT və xromatin kəsilməsi üçün müxtəlif ultrasəs əsaslı həllər təklif edir. Mikrotipdən istifadə edərək birbaşa sonikasiya üçün zond tipli ultrasəs aparatları (məsələn, UP100H) arasında seçim edin və ya eyni vaxtda müxtəlif nümunələrin dolayı DNT hazırlanması üçün VialTweeeter və ya ultrasəs kubokundan istifadə edin. Hielscher ehtiyaclarınızı nəzərə alaraq ideal cihazı təklif edir: 1 və ya 10-a qədər nümunəniz olsun, həcmlər mikrolitrdən litrə qədər olsun. – Hielscher sonicators DNT, RNT və xromatin fraqmentlərini düzgün uzunluqda hazırlamaq üçün tələblərinizə cavab verəcəkdir. Təkrarlanma, asan əməliyyat və dəqiq nəzarət növbəti nəsil ardıcıllıq üçün etibarlı kitabxana yaratmağa imkan verir.
Enzimatik DNT parçalanmasından fərqli olaraq, ultrasəs kəsmə heç bir kimyəvi maddə əlavə etmədən təmiz mexaniki kəsmə qüvvələri tətbiq edir. Proses parametrlərinin dəqiq təyin edilməsi ilə ultrasəs kəsmə yüksək molekulyar ağırlıqlı DNT fraqmentlərini (plazmid və genomik DNT) istehsal edir.
Təmizlənmiş nuklein turşuları parçalanma mərhələsindən əvvəl və ya sonra gücləndirilə bilər.
Sonication parametrləri (güc, nəbz dövrü / partlayışlar, vaxt və temperatur) proqram parametrləri vasitəsilə təhlükəsiz şəkildə idarə edilə bilər.

Ultrasonik DNT kəsilməsi üçün protokollar

Xromatin İmmunoprecipitation Assay üçün

Qısaca, hüceyrələr 60 mm diametrli qablara (hər qabda 400,000) döşəndi və RhoA siRNA ilə transfeksiya edildi (təsvir edildiyi kimi); 72 saatdan sonra zülalları DNT-yə çarpaz bağlamaq üçün formaldehidlə (son konsentrasiya, 1%) 37°C-də 10 dəqiqə inkubasiya edildi. Çapraz bağlanma reaksiyası 125 mmol/L son konsentrasiyanı verən 1,25 mol/L qlisinin onda bir hissəsinin əlavə edilməsi ilə söndürüldü. Hüceyrələr iki dəfə buz kimi soyuq PBS ilə yuyuldu, radioimmunopresipitasiya test tamponunda [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksixolat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-H80p. )] tərkibində 1 mmol/L fenilmetilsulfonil flüorid, 1 Ag/mL aprotinin və 1 Ag/ml pepstatin A ehtiva edir və 30 dəqiqə buz üzərində saxlanılır. Sonra hüceyrə lizatları buz üzərində a Hielscher UP200S ultrasəs sonikatoru (3 x 40 s, amplituda 40%, dövr 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) çarpaz bağlı xromatinlər 200 ilə 1000 bp arasında DNT fraqmentləri əldə etmək üçün kəsilənə qədər. Bütün lizatın onda biri müxtəlif nümunələrdə mövcud olan DNT miqdarını ölçmək üçün istifadə edildi və belə hesab edildi. “ümumi giriş DNT”. Qeyri-spesifik fonu azaltmaq üçün supernatantlar somon sperma DNT/protein agaroza-50% şlamı ilə inkubasiya edilmişdir. İmmunopresipitasyon sonra gecə ərzində 4°C-də 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) və ya antikor olmadan (mənfi nəzarət) aparıldı. Bu supernatantlara 5 mol/L NaCl əlavə edildi və protein-DNT çarpaz əlaqələrini bərpa etmək üçün bir gecədə 65°C-də qızdırıldı. İmmunokomplekslər daha sonra DNase və RNase-siz proteinaz K ilə müalicə olundu və DNT fenol/xloroformun çıxarılması və etanol çöküntüsü ilə təmizləndi. PCR insan iNOS geninin promotor bölgəsindəki ardıcıllığa uyğun gələn spesifik primerlərlə aparılmışdır (p1 primeri: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primeri: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-ifadə tədqiqatları

Ekspressiya tədqiqatları üçün, xromosomal ssu inteqrasiya olunmuş EGFP (Genişləndirilmiş Yaşıl Floresan Protein) geni ilə rekombinant ştammı L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Almaniya) əvvəllər təsvir olunduğu kimi müxtəlif mühitlərdə becərildi və əlavə olaraq 100 mq l ilə əlavə olunur^-1 Nurseotrisin (Jena Bioscience, Almaniya). Kultivasiya zamanı 1 ml nümunə götürülmüş, sentrifuqalanmış (2000 × g, 20°C, 10 dəq) və 0,9% NaCl məhlulu ilə yuyulmuşdur. Pellet tamponda (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) yenidən dayandırıldı və ultrasəs prosessoru ilə sonlandırma ilə parçalandı. UP400S (enerjinin tətbiqi ~ 400 Ws). Hüceyrə zibilləri sentrifuqalama (6000 × g, 4°C, 5 dəq) ilə çıxarıldı və 12,5% poliakralamid gellərlə Laemmli (1970) üsuluna uyğun olaraq reduksiya şəraitində natrium dodesil sulfat – poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) ilə təhlil edildi. . EGFP-ifadəsi həyəcanlı mədəniyyətdə araşdırıldı. (Fritsche et al. 2007)

xromatinin immunopresipitasiyası

Xromatin immunoprecipitation analizi ChIP-IT istifadə edərək həyata keçirilmişdir^TM Ekspress (Active Motif, Carlsbad, CA, ABŞ) istehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq bəzi dəyişikliklərlə. Qısaca, differensiasiya edilmiş insan podositləri otaq temperaturunda 10 dəqiqə ərzində 1% formaldehid ilə çarpaz bağlandı. Hüceyrələr buz kimi soyuq PBS ilə yuyuldu və fiksasiya reaksiyası otaq temperaturunda 5 dəqiqə ərzində 0,125 M qlisin əlavə edilərək dayandırıldı. Hüceyrələr yenidən buz kimi soyuq PBS ilə yuyuldu və qabdan çıxarıldı. Hüceyrələr sentrifuqalama yolu ilə qranullandı və lizis tamponunda yenidən suspenziya edildi. Santrifüjdən sonra, qranullaşmış nüvələr kəsmə tamponunda yenidən dayandırıldı, 30 dəqiqə buz üzərində inkubasiya edildi və xromatin sonikasiya ilə kəsildi, məsələn UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Almaniya) 25% gücdə təxminən 200-600 bp-lik parçalara buz üzərində hər biri 20 saniyəlik 5 impuls. Kəsilmiş xromatin daha sonra sentrifuqa edildi və supernatant toplandı. İmmunopresipitasiyalar üçün 60 μl xromatin 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ABŞ), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) və ya NF-κB p50 (Abcam) anticisimləri və ya dovşan ilə inkubasiya edilmişdir. IgG (Zymed Laboratories), mənfi idarə olaraq, gecədə 4°C yumşaq fırlanma ilə. Maqnit muncuqlarına bağlanmış immunokomplekslər maqnit stendindən istifadə edərək toplanmış, geniş şəkildə yuyulmuş və zülal/DNT çarpaz əlaqələri dəyişdirilmiş və real vaxt PCR analizi üçün DNT elüt edilmişdir. (Ristola et al. 2009)

Çip sıra analizi üçün EHEC DNT hazırlığı

Hüceyrə lizatlarının və çıxarılan DNT-lərin təşkili
İstənilən son konsentrasiyaya qədər PBS-də dayandırılmış bakteriya qranulları ilə müalicə edilmişdir ultrasəs pozucusu UP100H (Hielscher GmbH, Almaniya) mikrotip MS1 (diametri 1 mm) ilə təchiz edilmişdir. Əməliyyat tezliyi 30 kHz və effektiv çıxış gücü 100 Vt idi. Əməliyyat zamanı nümunələr buzlu su banyosunda soyudulmuş, qarışdırılmış və sentrifuqa edilmişdir. Nümunələr axın sitometriyası tədqiqatları üçün istifadə edildi, daha sonra işləmə üçün nümunələr istilik müalicəsinə (95°C, 5 dəqiqə) məruz qaldı. Xam hüceyrə lizatları fenol:xloroform:izoamil spirti (25:24:1) qarışığı ilə işlənmişdir. Bu qarışığın bərabər həcmi lizat nümunəsinə əlavə edildi, məhlul 15 saniyə ərzində güclü şəkildə burulğan edildi və otaq temperaturunda (RT) 22°C ətrafında 2 dəqiqə ərzində 15000 xg-də sentrifuqa edildi. Genomik DNT-ni ehtiva edən üst sulu faza diqqətlə ayrıldı və yeni steril Eppendorf borusunda toplandı.
Daha sonra nümunələr DNT-ni parçalamaq üçün sonikləşdirildi. Sonikasiya addımı yuxarıda göstərildiyi kimi eyni şəraitdə həyata keçirilmişdir. Genomik DNT-yə parçalanma təsirini qiymətləndirmək üçün nümunələr agaroz gel elektroforezindən istifadə etməklə təhlil edilmişdir.
(…) Əvvəllər 2,5 dəqiqə ərzində sonikasiya edilmiş nümunələr istilik müalicəsi və sentrifuqadan sonra ekstraksiya mərhələsinə məruz qalmışdır. Sərbəst buraxılan DNT iki dəfə fenol:xloroform:izoamil spirti qarışığı ilə çıxarıldı və sonra 0-15 dəqiqə ərzində ikinci sonikasiyaya məruz qaldı. Agaroz gel elektroforezi ekstraksiyadan sonrakı ultrasəs parçalanmasına məruz qalmış DNT-nin ölçü paylanmasını müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir (şəkil yuxarı sağ tərəfdə). Yüksək dərəcədə parçalanmış DNT, 2,5 dəqiqə və ya daha uzun müddətə sonikasiya edilmiş nümunələrdən çıxarılan yüksək molekulyar ağırlıqlı zolaqlar deyil, DNT yaxmasının mövcudluğundan aydın oldu. Daha uzun ultrasonikasiya tədricən fraqment uzunluğunu təxminən 150-600 bp-ə endirdi və 15 dəqiqəlik sonikasiya bu fraqmentləri daha da pisləşdirdi, bunu əsasən yaxmanın yuxarı hissəsindən görmək olar. Beləliklə, orta DNT fraqmentinin ölçüsü ultrasəsləmə vaxtı ilə tədricən azaldı və 5 dəqiqəlik müalicə çip sıra analizləri üçün ən uyğun olan DNT fraqmentlərinin ölçülərini əldə etməyə imkan verdi. Nəhayət, ilk 2 dəqiqəlik ultrasəs müalicəsi, DNT çıxarılması (2×) və sonrakı 5 dəqiqəlik sonikasiyadan ibarət DNT analitinin hazırlanması proseduru quruldu. (Basselet et al. 2008)

Xromatin İmmunoprecipitation (ChIP)

HEK293 hüceyrələri yuxarıda təsvir olunduğu kimi becərildi və otaq temperaturunda 45 dəqiqə ərzində 2 mM disuksinimidil-qlutarat ilə sabitləndi. Daha sonra hüceyrələr iki dəfə PBS ilə yuyuldu. Xromatin 1% (v/v) formaldehid istifadə edərək otaq temperaturunda 10 dəqiqə ərzində çarpaz bağlandı və iki dəfə buz kimi soyuq PBS ilə yuyuldu. Çarpaz birləşmə reaksiyası otaq temperaturunda 5 dəqiqə ərzində 0,125 M son konsentrasiyada qlisin ilə inkubasiya yolu ilə dayandırıldı. Tripsin ilə inkubasiya edildikdən sonra hüceyrələr hüceyrə mədəniyyəti qabından çıxarıldı və iki dəfə PBS ilə yuyuldu. Hüceyrə qranulları liziz tamponunda (5 mM Borular, pH 8.0, 85 mM KCl və 0.5% (h/v) Nonidet P-40) yenidən dayandırıldı, 10 dəqiqə buz üzərində inkubasiya edildi və Dounce homogenizatoru ilə homogenləşdirildi. Daha sonra nüvələr sentrifuqalama (3500 xg, 5 dəq, 4 °C) ilə qranullara salındı və nüvə tamponunda (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA və 1% (ağırlıq/həc) SDS) yenidən dayandırıldı. Nüvələr üç 20-s impuls ilə sonikasiya ilə pozuldu UP50H səs aparatı (Hielscher Ultraschall Technologie) dövrü 0,5 və amplituda 30% qəbul edərək, 200 - 1000 bp toplu ölçüsü olan genomik DNT fraqmentləri verir. ChIP üçün 50 q DNT immunopresipitasiya tamponunda (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (h/v) Triton X-100 (w/v) və 0/01) 4 dəfə seyreltildi. v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Xromatin immunoprecipitation (ChIP) ilə histon modifikasiyası təhlili

Qısaca, 6 x 10⁶ hüceyrələr iki dəfə PBS ilə yuyuldu və 0,5% formaldehidin iştirakı ilə otaq temperaturunda 15 dəqiqə mədəniyyət lövhəsində çarpaz bağlandı. 0,125 M qlisin əlavə edilməklə çarpaz bağlanma reaksiyası dayandırıldı. Bütün sonrakı addımlar 48°C-də aparıldı. Bütün tamponlar əvvəlcədən soyudulmuş və tərkibində proteaz inhibitorları (Complete Mini, Roche) olmuşdur. Hüceyrələr iki dəfə PBS ilə yuyuldu və sonra qırıldı. Yığılan qranullar 1 ml lizis tamponunda (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) həll edildi və soyuq etanol banyosunda 10 dövr ərzində 100% amplitüddə sonikasiya edildi. UP50H səs aparatı (Hielscher, Teltow, Almaniya). Xromatinin parçalanması 1% agaroza gelində görüntülənmişdir. Əldə edilən fraqmentlər 200-500pb aralığında idi. Həll olunan xromatin sonikləşdirilmiş nümunələri 14000 q-da 10 dəqiqə 48°C-də sentrifuqa etməklə əldə edilmişdir. Həll olunan fraksiya 1/10 nisbətində seyreltmə tamponunda (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) seyreltildi və istifadə olunana qədər 80°C-də saxlanıldı. (Rodriguez et al. 2008)