• DNT və RNT kəsmə zamanı DNT molekulları daha kiçik parçalara bölünür. DNA / RNA parçalanması, gələcək nəsil ardıcıllığı (NGS) üçün kitabxanalar yaratmaq üçün lazım olan vacib nümunə hazırlıq addımlarından biridir.
• Ultrasonik DNA kesme 100 ədəd DNT və ya RNT qırmaq akustik çuxurluq qüvvələr istifadə edir – 5KB bp.
• Ultrasonik kesme istədiyiniz DNA uzunluğu dəqiq DNA parçalanma və uyğunlaşması üçün imkan verir.

Ultrasonikasiya istifadə edərək DNA kəsmə

Hielscher ultrason DNA, RNT və Xromatin shearing üçün müxtəlif ultrasəs-based həllər təklif edir. bir microtip istifadə birbaşa sonication üçün probe tipli ultrasonicators (məsələn UP100H) arasında seçin, və ya VialTweeeter və ya eyni zamanda müxtəlif nümunələri dolayı DNA hazırlanması üçün ultrasəs cuphorn istifadə edin. Hielscher sizin ehtiyaclarını nəzərə ideal cihaz təklif edir: 1 və ya 10 nümunələri, microliter olan litr həcmlə həcmi var erkək – Hielscher ultrasəs prosessorları sağ uzunluğu DNT, RNT və Xromatin fraqmentləri hazırlamaq üçün tələblərə cavab mövcuddur. Reproducibility, asan əməliyyat və dəqiq nəzarət nəsil sequencing üçün etibarlı kitabxana üçün imkan verir.
ferment DNT parçalanma fərqli olaraq, ultrasəs kesme heç bir kimyəvi etmədən təmiz mexaniki kəsmək qüvvələri aiddir. proses parametrlərin dəqiq qəbulu ilə, ultrasəs kesme yüksək molekulyar çəki DNT fraqmentləri (plasmid və genom DNT) istehsal edir.
Təmizlənmiş nuklein turşuları əvvəl və ya bir parçalanma addım sonra amplified bilər.
Sonication parametrləri (güc, pulse dövrü / bursts, vaxt və temperatur) software parametrləri vasitəsilə təhlükəsiz idarə oluna bilər.

Ultrasonik DNA Kesme üçün protokollar

Kromatin immunoprecipitation Assay üçün

Qısaca, hüceyrələr 60 mm diametrli qablarda (hər yeməkdə 400 min) plastinka edilmiş və RhoA siRNA ilə təsvir olunmuşdur (təsvir olunduğu kimi); 72 saat sonra, DNA'ya cross-link proteinlər üçün 37 ° C-də 10 dəqiqə formaldehid (son konsantrasyon, 1%) ilə inkubasiya edilmişdir. Çapraz bağlama reaksiyası, 1.25 mol / L glisinin onda bir həcminin əlavə edilməsi ilə söndürüldü və 125 mmol / L son konsantrasyonu verildi. Hüceyrələr buzlu soyuq PBS ilə iki dəfə yuyulurdu, radioimmunoprecipitation sınaq tamponunda [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0.5% deoksikolat, 0.1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0 1 mmol / L fenilmetilsülfonil flüorür, 1 Ag / mL aprotinin və 1 Ag / mL pepstatin A, 30 dəqiqə buzda saxlanılır. Sonra, hüceyrə lizatları buz ilə buz üzərində sonicated edilmişdir Hielscher UP200S ultrasəs sonicator (3 x 40 s, amplitude 40%, dövrü 1; Hielscher ultrason GmbH) cross-bağlı chromatins qədər 200 və 1000 bp şirkəti arasında DNT fraqmentləri verir qırxılmış edildi. bütün lysate biri onuncu müxtəlif nümunələri DNT indiki məbləği quantitate üçün istifadə kimi qəbul edildi “ümumi giriş DNA”. Supernatants qeyri-spesifik fon azaltmaq üçün qızıl sperma DNA / protein agarose-50% məhlulu ilə kürt edilmişdir. Immunoprecipitation sonra 5 anti-NF-NB p65 of Ag (Upstate) və ya antikor olmadan (mənfi nəzarət) ilə 4 ° C gecə edildi. Bu supernatants 5 mol / L NaCl əlavə və protein-DNA cross-links qayıtmağa 65 ° C gecə qızdırılıb edilmişdir. immunocomplexes daha DNase- və RNase pulsuz proteinase K ilə müalicə və DNA fenol / xloroform hasilatı və etanol yağıntı ilə təmizlənmiş edilmişdir. PCR insan İnose gen Promoter regionda bir ardıcıllıqla müvafiq xüsusi astar ilə həyata keçirilmişdir (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-ifadə tədqiqatlar

əvvəllər təsvir kimi ifadə tədqiqatlar, rekombinant gərginlik L. tarentolae P10 :: # 12 F9Begfp1.4dBsat (Jena Bioscience, Almaniya) EGFP (Enhanced Green Floresan Zülal) üçün gen ilə, xromosom müxtəlif media becərilmişdir inteqrasiya SDU və əlavə 100 mq l əlavə^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Almaniya). becərilməsi zamanı 1 ml nümunələri mərkəzdənqaçma, (2000 × q, 20 ° C, 10 min) çəkildi və 0,9% NaCl həlli ilə yuyulur. Pellet bufer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) və resuspended və ultrasəs prosessor ilə sonification tərəfindən parçalandı edildi UP400S (Enerji tətbiqi ~ 400 Ws). 12,5% polyacralamide gel ilə Laemmli üsulu (1970) görə azaldılması şəraitində poliakrilamid gel elektroforez (SDS-PAGE) - Cell zibil sentrifuqa (6000 × q, 4 ° C, 5 min) tərəfindən çıxarılır və natrium dodecyl sulfat təhlil edilmişdir . EGFP ifadə həyəcanlı mədəniyyət müayinə etdi. (Fritsche et al. 2007)

Kromatin immunoprecipitation

Xromatin immunoprecipitation təhlil çip-IT istifadə edərək həyata keçirilib^TM bəzi dəyişikliklər ilə istehsalçının təlimatları uyğun olaraq (Active Motif, Carlsbad, CA, ABŞ) bildirirəm. Qısaca, fərqli insan podocytes cross-bağlı idi otaq temperaturunda 10 min 1% formaldehid ilə. Cells buz PBS ilə yuyulur edilmişdir və fiksasiya reaksiya otaq temperaturunda 0.125 M GHSİM 5 min əlavə dayandırıldı. Cells buz PBS ilə yenidən yuyulur və yeməyi həkk olunub. Cells sentrifuqa ilə dənəvər və lizisi bufer resuspended edildi. sentrifuqa sonra yemlə nuclei, kesme bufer resuspended edildi 30 min buz üzərində kürt və Xromatin sonication, məsələn tərəfindən qırxılmış edildi UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Almaniya) 25% gücündə hər 20 saniyədə 5 ədəd paxlada təxminən 200-600 bp olan parçalara buz. Daha sonra kəsilmiş kromatin santrifüj edilmiş və supernatant toplanmışdır. İmmunoprecipitasyonlar üçün 60 mk kromatin 1 ug Sp1 (Santa Cruz Biotexnologiya, Santa Cruz, CA, ABŞ), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Böyük Britaniya) və ya NF-κB p50 (Abcam) antikorları və ya quş ilə inkubasiya edilmişdir IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, ABŞ), mənfi nəzarət olaraq, gecə 4 ° C-də incə fırlanma ilə. Maqnetik boncuklara bağlanan immunokomplekslər bir maqnit standı ilə toplanmış, geniş yuyulmuş və protein / DNA keçidləri geri çevrilmiş və DNA real-vaxtlı PCR təhlili üçün elədirilmişdir. (Ristola və digərləri, 2009)

chip array təhlili üçün EHEC DNA hazırlanması

mobil Lysates və hasil DNT-lərində təşkili
İstədiyiniz final konsentrasiyası PBS dayandırılıb bakterial qranullar ilə müalicə edildi ultrasəs Topu UP100H (Hielscher GmbH, Almaniya) mikrotip MS1 (diametri 1 mm) ilə təchiz olunmuşdur. Əməliyyat tezliyi 30 kHz idi və effektiv çıxış gücü 100 W idi. Əməliyyat zamanı nümunələr buzlu su banyosunda soyudular, qarışıq və santrifüj edilirdi. Nümunələr axın sitometri işləri üçün istifadə edilərkən, sonradan müalicə üçün nümunələr istilik müalicəsinə (95 ° C, 5 dəq) məruz qaldı. Xam neft hüceyrələri bir fenol qarışığı ilə işlənmişdir: xloroform: izoamil spirt (25: 24: 1). Bu qarışığın bərabər həcmi lizat nümunəsinə əlavə edildi, həll 15 s üçün güclü bir şəkildə vorteksləndi və 22 ° C ətrafında oda temperaturu (RT) 2 min üçün 15,000 xq-də santrifüj edildi. Genomik DNT'yi ehtiva edən ən yaxşı sulu faza diqqətlə ayrılmış və yeni steril Eppendorf borusuna yığılmışdır.
Sonradan nümunələr DNT-ni parçalamaq üçün sonikləşdirildi. Sonication addımı yuxarıda təsvir edilən eyni şərtlərdə həyata keçirildi. Genomik DNT üzərində parçalanma təsirlərini qiymətləndirmək üçün nümunələr agaroz jeli elektroforezindən istifadə edərək təhlil edilmişdir.
(…Daha əvvəl 2,5 min üçün sonicated nümunələr istilik müalicə və santrifüqasiya sonra bir ekstraksiyon mərhələsi məruz qaldı. DNT azad iki dəfə bir fenol ilə çıxarıldı: xloroform: izoamil spirtli qarışıq və sonradan 0-15 dəqiqə ikinci sonikasiya məruz qaldı. Post-ekstraksiya ultrasəs parçalanmasına məruz qalan DNT-nin ölçüsünün paylanmasını müəyyən etmək üçün agaroz gel elektroforezi istifadə edilmişdir (yuxarı sağda Şəkil). Yüksək parçalanmış DNT, 2,5 min və ya daha uzun müddət sonicated nümunələri aradan qaldırılmış yüksək molekulyar çəki bands deyil, bir DNA smear mövcudluğu aydın oldu. Daha uzun sonikasiya parçalanma uzunluğunun təxminən 150-600 bp-ə qədər azaldığını və 15 dəqiqə üçün sonikasiya daha çox parçanın yuxarı hissəsi kimi göründüyü kimi daha da parçalandı. Beləliklə, orta DNA parçası ölçüsü ultrasonikləşmə vaxtı ilə tədricən azaldı və 5 dəqiqəlik müalicə çip sıra testləri üçün ən uyğun DNA parçaların ölçülərini əldə etməyə imkan verdi. Nəhayət, ilk 2 min ultrasəs müalicəsi, DNT ekstraksiyası (2x) və sonrakı 5 min sonikasiya olan DNA analit hazırlıq proseduru yaradılmışdır. (Basselet və digərləri, 2008)

Kromatin immunoprecipitation (çip)

HEK293 hüceyrələri yuxarıda təsvir edildiyi kimi kültür edilmişdir və oda temperaturu boyunca 45 dəqiqə 2 mM disuccinimidil-glutarat ilə sabitlənmişdir. Nəticədə, hüceyrələr PBS ilə iki dəfə yuyulurdu. Kromatin, 1% (h / h) formaldehidi istifadə edərək otaq temperaturu ilə 10 dəqiqə arasında kəsişdi və iki dəfə buzlu PBS ilə yuyulurdu. Çapraz bağlama reaksiyası, oda temperaturu 5 dəq üçün 0,125 M bir yekun konsentrasiyasında glisin ilə inkubasiya ilə dayandırıldı. Tripsin ilə inkubasiya etdikdən sonra, hüceyrələr hüceyrə mədəniyyət qabından alındı ​​və iki dəfə PBS ilə yuyuldu. Hücre peleti lizis tamponu (5 mM Borular, pH 8.0, 85 mM KCl və 0.5% (h / h) Nonidet P-40) ilə susuzlaşdırılmış, 10 dəqiqə buzda inkubasiya olunmuş və bir Dounce homojənizatoru ilə homogenləşdirilmişdir. Sonradan nüvələrin santrifüqasiyası (3500 xg, 5 min, 4 ° C) ilə pellet edilmişdir və nüvə tamponlarında (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA və 1% (həcmli) SDS) yenidən susuz qalmışdır. Nuclei sonication tərəfindən pozulub üç 20-pulsları ilə a UP50H sonicator 1000 bp - dövrü 0,5 qəbulu da (Hielscher Ultraschall Technologie) və 200 toplu ölçüsü genom DNT fraqmentləri verir, 30% amplitude. Chip üçün, DNT 50g immunoprecipitation bufer (4 dəfə azaldılmış edildi 16,7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1,1% (v / v) Triton X-100, və 0,01% (w / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Xromatin immunoprecipitation ilə histone modifikasiya təhlili (çip)

Qısaca, 6 x 10⁶ hüceyrələri PBS ilə iki dəfə yuyulur və 0,5% formaldehid iştirakı ilə otaq temperaturunda 15 min mədəniyyət nömrəli cross-bağlı. Cross-keçid reaksiya 0.125 M GHSİM əlavə dayandırıldı. Bütün sonrakı addımlar 48 ° C aparılmışdır. Bütün buferlər pre-soyudulmuş idi və protease inhibitorları (Tam Mini, Roche) olan. Cells PBS ilə iki dəfə yuyulur və sonra həkk olunub. Toplanan qranullar 1 ml lizisi bufer həll edildi (1% SDS, 5 mM EDTA 50 mM Tris pH 8) və 100% amplituda 10 dövründən bir istifadə üçün soyuq etanol hamam sonicated edilib UP50H sonicator (Hielscher, Teltow, Almaniya). Kromatin parçalanma 1% agarose gel görüntülenmeyecektir idi. Əldə fraqmentləri 200-500pb sıra idi. Həll Xromatin 48 ° C 10 min 14,000g da sonicated nümunələri centrifuging əldə edilib. həll fraksiyası qatılma bufer 1/10 azaldılmış (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8 150 mM NaCl) sonra aliquoted və istifadə qədər 80 ° C saxlanılır. (Rodriguez et al., 2008)