DNT-nin ultrasəslə parçalanması

DNT və RNT-nin parçalanması zamanı uzun DNT molekulları daha kiçik hissələrə bölünür; bu, yeni nəsil sekvensləmə (NGS) kitabxanasının yaradılması üçün nümunələrin hazırlanmasında mühüm mərhələdir. DNT-nin ultrasəslə parçalanmasında DNT və ya RNT-ni 100 bp ilə 5 kb arasında ölçülərə malik fraqmentlərə bölmək üçün akustik kavitasiya qüvvələrindən istifadə olunur. Bu üsul fraqment ölçüsünə dəqiq nəzarət etməyə imkan verir və optimal sekvensləmə nəticələri üçün DNT-nin arzu olunan uzunluğuna uyğunlaşdırılmasını asanlaşdırır.

Ultrasəs tətbiqi ilə DNT-nin parçalanması

Hielscher Ultrasonics DNT, RNT və xromatinin parçalanması üçün ultrasəsə əsaslanan müxtəlif həllər təklif edir. Mikroucluqdan istifadə etməklə birbaşa ultrasəs emalı üçün zond tipli ultrasəs cihazını (məsələn, UP100H) seçin və ya müxtəlif nümunələrdə DNT-nin eyni vaxtda dolayı yolla hazırlanması üçün VialTweeeter və ya ultrasəs cuphorn cihazından istifadə edin. Hielscher ehtiyaclarınızı nəzərə alaraq ideal cihazı təklif edir: istər 1, istərsə də 10-a qədər nümunəniz, mikrolitrdən litrədək həcmləriniz olsun – Hielscher ultrasəs cihazları DNT, RNT və xromatin fraqmentlərini düzgün uzunluqda hazırlamaq tələblərinizi ödəyəcək. Təkrarlana bilmə, asan istismar və dəqiq nəzarət yeni nəsil sekvensləmə üçün etibarlı kitabxana əldə etməyə imkan verir.
DNT-nin fermentativ fraqmentasiyasından fərqli olaraq, ultrasəslə parçalanma heç bir kimyəvi maddə əlavə edilmədən sırf mexaniki kəsilmə qüvvələri tətbiq edir. Proses parametrlərinin dəqiq tənzimlənməsi ilə ultrasəslə parçalanma yüksək molekulyar kütləli DNT fraqmentləri (plazmid və genom DNT-si) yaradır.
Təmizlənmiş nuklein turşuları fraqmentasiya mərhələsindən əvvəl və ya sonra amplifikasiya edilə bilər.
Ultrasəs emalının parametrlərinə (güc, impuls dövrü / impuls seriyaları, vaxt və temperatur) proqram təminatının parametrləri vasitəsilə təhlükəsiz şəkildə nəzarət etmək olar.

DNT-nin ultrasəslə parçalanması üçün protokollar

Xromatin immunopresipitasiya analizi üçün

Qısaca, hüceyrələr diametri 60mm olan qablara əkildi (hər qabda 400.000) və RhoA siRNA ilə transfeksiya edildi (təsvir olunduğu kimi); 72 h sonra zülalları DNT ilə çarpaz bağlamaq üçün formaldehidlə (son konsentrasiya, 1%) 37°C-də 10 min inkubasiya edildi. Çarpaz bağlanma reaksiyası həcmin onda biri qədər 1,25 mol/L qlisin əlavə etməklə dayandırıldı və son konsentrasiya 125 mmol/L oldu. Hüceyrələr buz kimi soyuq PBS ilə iki dəfə yuyuldu, tərkibində 1 mmol/L fenilmetilsulfonil flüorid, 1 Ag/mL aprotinin və 1 Ag/mL pepstatin A olan radioimmunopresipitasiya analizi buferində [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% dezoksixolat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] yenidən suspenziya halına gətirildi və buz üzərində 30 min saxlanıldı. Sonra hüceyrə lizatları buz üzərində Hielscher UP200S ultrasəs cihazı ilə (3 x 40 s, amplituda 40%, dövr 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) çarpaz bağlanmış xromatinlər 200 ilə 1.000 bp arasında DNT fraqmentləri verəcək şəkildə parçalanana qədər ultrasəslə emal edildi. Ümumi lizatın onda biri müxtəlif nümunələrdəki DNT miqdarını ölçmək üçün istifadə edildi və “ümumi ilkin DNT” kimi qəbul olundu. Qeyri-spesifik fonu azaltmaq üçün supernatantlar qızılbalıq sperması DNT-si/zülal aqaroza-50% suspenziyası ilə inkubasiya edildi. Daha sonra immunopresipitasiya 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) ilə və ya anticisim olmadan (mənfi nəzarət) 4°C-də gecə boyunca aparıldı. Bu supernatantlara 5 mol/L NaCl əlavə edildi və zülal-DNT çarpaz bağlarını açmaq üçün 65°C-də gecə boyunca qızdırıldı. İmmunokomplekslər daha sonra DNase və RNase olmayan proteinaza K ilə emal edildi, DNT isə fenol/xloroform ekstraksiyası və etanolla çökdürmə vasitəsilə təmizləndi. PCR insan iNOS geninin promotor bölgəsindəki ardıcıllığa uyğun spesifik praymerlərlə aparıldı (p1 praymeri: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 praymeri: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP ekspressiyasının tədqiqi

Ekspressiya tədqiqatları üçün EGFP (gücləndirilmiş yaşıl flüoresan zülal) geni xromosomal ssu sahəsinə inteqrasiya olunmuş rekombinant L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 ştammı (Jena Bioscience, Almaniya) əvvəllər təsvir olunduğu kimi müxtəlif mühitlərdə yetişdirildi; mühitlərə əlavə olaraq 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Almaniya) əlavə edildi. Yetişdirmə zamanı 1 ml nümunələr götürüldü, sentrifuqalandı (2000 × g, 20°C, 10 min) və 0,9% NaCl məhlulu ilə yuyuldu. Çöküntü buferdə (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) yenidən suspenziya halına gətirildi və ultrasəs prosessoru UP400S ilə ultrasəs emalı vasitəsilə dağıdıldı (tətbiq olunan enerji ∼ 400 Ws). Hüceyrə qalıqları sentrifuqalama ilə (6000 × g, 4°C, 5 min) uzaqlaşdırıldı və Laemmli (1970) üsuluna uyğun olaraq reduksiyaedici şəraitdə 12,5% poliakrilamid gellərindən istifadə etməklə natrium dodesil sulfat – poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) ilə təhlil edildi. EGFP ekspressiyası çalxalanan kulturada araşdırıldı. (Fritsche et al. 2007)

Xromatin immunopresipitasiyası

Xromatin immunopresipitasiya analizi ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, ABŞ) dəstindən istifadə etməklə istehsalçının təlimatlarına əsasən, bəzi dəyişikliklərlə aparıldı. Qısaca, differensiasiya olunmuş insan podositləri otaq temperaturunda 10 min ərzində 1% formaldehidlə çarpaz bağlandı. Hüceyrələr buz kimi soyuq PBS ilə yuyuldu və fiksasiya reaksiyası otaq temperaturunda 5 min müddətinə 0,125 M qlisin əlavə etməklə dayandırıldı. Hüceyrələr yenidən buz kimi soyuq PBS ilə yuyuldu və qabdan qaşınaraq ayrıldı. Hüceyrələr sentrifuqalama ilə çökdürüldü və lizis buferində yenidən suspenziya halına gətirildi. Sentrifuqalamadan sonra çökdürülmüş nüvələr parçalanma buferində yenidən suspenziya halına gətirildi, buz üzərində 30 min inkubasiya edildi və xromatin ultrasəs emalı ilə, məsələn, UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Almaniya) vasitəsilə buz üzərində 25% gücdə hər biri 20 sec olan 5 impulsla təxminən 200–600 bp ölçülü fraqmentlərə parçalandı. Parçalanmış xromatin daha sonra sentrifuqalandı və supernatant toplandı. İmmunopresipitasiya üçün 60 μl xromatin 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ABŞ), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Böyük Britaniya) və ya NF-κB p50 (Abcam) anticisimləri ilə, yaxud mənfi nəzarət olaraq dovşan IgG-si (Zymed Laboratories) ilə 4°C-də yavaş fırladılmaqla gecə boyunca inkubasiya edildi. Maqnit kürəciklərə bağlanmış immunokomplekslər maqnit ştativdən istifadə etməklə toplandı, yaxşıca yuyuldu, zülal/DNT çarpaz bağları açıldı və real vaxt PCR təhlili üçün DNT elüsiya edildi. (Ristola et al. 2009)

Çip matrisi təhlili üçün EHEC DNT-sinin hazırlanması

Hüceyrə lizatlarının və ekstraksiya edilmiş DNT-lərin hazırlanması
Arzu olunan son konsentrasiyaya qədər PBS-də suspenziya halına gətirilmiş bakterial çöküntülər UP100H ultrasəs dağıdıcısı (Hielscher GmbH, Almaniya) ilə emal edildi; cihaz MS1 mikroucluğu (diametri 1mm) ilə təchiz olunmuşdu. İş tezliyi 30 kHz, effektiv çıxış gücü isə 100 W idi. Əməliyyat zamanı nümunələr buzlu su vannasında soyuduldu, qarışdırıldı və sentrifuqalandı. Nümunələr axın sitometriyası tədqiqatları üçün istifadə edildi, sonrakı emal üçün isə istilik emalına (95°C, 5 min) məruz qoyuldu. Xam hüceyrə lizatları fenol:xloroform:izoamil spirti (25:24:1) qarışığı ilə emal edildi. Lizat nümunəsinə bu qarışıqdan bərabər həcmdə əlavə edildi, məhlul vorteksdə 15 s güclü qarışdırıldı və təxminən 22°C otaq temperaturunda (RT) 15.000 x g-də 2 min sentrifuqalandı. Genom DNT-sini ehtiva edən üst sulu faza diqqətlə ayrıldı və yeni steril Eppendorf sınaq borusuna toplandı.
Daha sonra DNT-ni fraqmentləşdirmək üçün nümunələr ultrasəslə emal edildi. Ultrasəs emalı mərhələsi yuxarıda təsvir olunan eyni şəraitdə həyata keçirildi. Fraqmentasiyanın genom DNT-sinə təsirlərini qiymətləndirmək üçün nümunələr aqaroza gel elektroforezi ilə təhlil edildi.
(…) Əvvəllər 2,5 min ultrasəslə emal edilmiş nümunələr istilik emalından və sentrifuqalamadan sonra ekstraksiya mərhələsinə məruz qoyuldu. Ayrılmış DNT fenol:xloroform:izoamil spirti qarışığı ilə iki dəfə ekstraksiya edildi və daha sonra 0 – 15 min müddətində ikinci ultrasəs emalına məruz qoyuldu. Ekstraksiyadan sonrakı ultrasəs fraqmentasiyasına məruz qoyulmuş DNT-nin ölçü paylanmasını müəyyən etmək üçün aqaroza gel elektroforezindən istifadə edildi (yuxarı sağ tərəfdəki şəkil). DNT-nin yüksək dərəcədə fraqmentləşməsi, 2,5 min və ya daha uzun müddət ultrasəslə emal edilmiş nümunələrdən yox olan yüksək molekulyar kütləli zolaqların əvəzinə yayılmış DNT izinin mövcudluğundan aydın görünürdü. Daha uzun ultrasəs emalı fraqment uzunluqlarını tədricən təxminən 150 – 600 bp-yə endirdi, 15 min ultrasəs emalı isə bu fraqmentləri daha da parçaladı; bunu əsasən yayılmış izin yuxarı hissəsindən görmək olar. Beləliklə, DNT fraqmentlərinin orta ölçüsü ultrasəs emalının müddəti ilə tədricən azaldı və 5 min emal çip matrisi analizləri üçün ən uyğun DNT fraqment ölçülərini əldə etməyə imkan verdi. Nəhayət, əvvəlcə 2 min ultrasəs emalından, DNT ekstraksiyasından (2×) və sonrakı 5 min ultrasəs emalından ibarət DNT analitinin hazırlanması proseduru müəyyən edildi. (Basselet et al. 2008)

Xromatin immunopresipitasiyası (ChIP)

HEK293 hüceyrələri yuxarıda təsvir olunduğu kimi yetişdirildi və otaq temperaturunda 45 min ərzində 2 mM disuksinimidil-qlutaratla fiksasiya edildi. Daha sonra hüceyrələr PBS ilə iki dəfə yuyuldu. Xromatin 1% (v/v) formaldehiddən istifadə etməklə otaq temperaturunda 10 min ərzində çarpaz bağlandı və buz kimi soyuq PBS ilə iki dəfə yuyuldu. Çarpaz bağlanma reaksiyası son konsentrasiyası 0,125 M olan qlisinlə otaq temperaturunda 5 min inkubasiya etməklə dayandırıldı. Tripsinlə inkubasiyadan sonra hüceyrələr hüceyrə kulturası qabından qaşınaraq ayrıldı və PBS ilə iki dəfə yuyuldu. Hüceyrə çöküntüsü lizis buferində (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl və 0,5% (v/v) Nonidet P-40) yenidən suspenziya halına gətirildi, buz üzərində 10 min inkubasiya edildi və Dounce homogenizatoru ilə homogenləşdirildi. Daha sonra nüvələr sentrifuqalama ilə (3500 x g, 5 min, 4 °C) çökdürüldü və nüvə buferində (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA və 1% (w/v) SDS) yenidən suspenziya halına gətirildi. Nüvələr hər biri 20-s olan üç impulsla UP50H ultrasəs cihazı (Hielscher Ultraschall Technologie) vasitəsilə dövr 0,5 və amplituda 30% parametrlərində ultrasəslə dağıdıldı və əsasən 200 – 1000 bp ölçülü genom DNT-si fraqmentləri əldə edildi. ChIP üçün 50g DNT immunopresipitasiya buferində (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 və 0,01% (w/v) SDS) 4 dəfə durulaşdırıldı. (Weiske et al. 2006)

Xromatin immunopresipitasiyası (ChIP) ilə histon modifikasiyasının təhlili

Qısaca, 6 x 10⁶ hüceyrə PBS ilə iki dəfə yuyuldu və 0,5% formaldehidin iştirakı ilə otaq temperaturunda 15 min ərzində kultura lövhəsində çarpaz bağlandı. Çarpaz bağlanma reaksiyası 0,125 M qlisin əlavə etməklə dayandırıldı. Bütün sonrakı mərhələlər 48°C-də aparıldı. Bütün buferlər əvvəlcədən soyudulmuşdu və tərkibində proteaza inhibitorları (Complete Mini, Roche) var idi. Hüceyrələr PBS ilə iki dəfə yuyuldu və sonra qaşınaraq ayrıldı. Toplanmış çöküntülər 1 ml lizis buferində (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) həll edildi və soyuq etanol vannasında 100% amplitudada 10 dövr ərzində UP50H ultrasəs cihazı (Hielscher, Teltow, Almaniya) ilə ultrasəslə emal edildi. Xromatin fraqmentasiyası 1% aqaroza gelində vizuallaşdırıldı. Əldə edilən fraqmentlər 200–500pb diapazonunda idi. Həll olan xromatin ultrasəslə emal edilmiş nümunələrin 48°C-də 14.000g-də 10 min sentrifuqalanması ilə əldə edildi. Həll olan fraksiya durulaşdırma buferində (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) 1/10 nisbətində durulaşdırıldı, sonra alikvotlara bölündü və istifadəyədək 80°C-də saxlanıldı. (Rodriguez et al. 2008)