Drosophila Melanogaster nümunələrinin ultrasəslə lizisi

Drosophila melanogaster laboratoriyalarda model orqanizm kimi geniş istifadə olunur. Buna görə də Drosophila melanogaster nümunələrinin lizisi, hüceyrələrin parçalanması, zülalların ekstraksiyası və DNT-nin kəsici qüvvələrlə parçalanması kimi analizöncəsi hazırlıq mərhələləri tez-tez həyata keçirilməlidir. Ultrasəs parçalayıcıları etibarlı və səmərəlidir və yalnız ultrasəs prosesinin parametrlərini tənzimləməklə lizis, zülalların ekstraksiyası və ya DNT-nin fraqmentasiyası kimi müxtəlif işləri asanlıqla yerinə yetirmək üçün istifadə oluna bilər. Beləliklə, ultrasəs homogenizatorları geniş tətbiq sahəsinə malik çevik alətlərdir.

Ultrasəslə lizis və zülalların ekstraksiyası

Lizis, hüceyrələrin həll edilməsi, toxumaların homogenləşdirilməsi və zülalların ekstraksiyası bioloji laboratoriyalarda ultrasəs parçalayıcıları ilə yerinə yetirilən tipik işlərdir. Ultrasəs parçalayıcıları və hüceyrə parçalayıcıları heyvan toxumalarının, həşəratların (məsələn, Drosophila melanogaster, C. elegans) və ya bitki nümunələrinin homogenləşdirilməsi üçün çox uyğundur. Ultrasəslə işləmənin sonrakı tətbiqlərinə hüceyrə suspenziyalarının və çöküntülərinin lizisi, eləcə də hüceyrədaxili zülalların ekstraksiyası daxildir.
Ultrasəslə lizis və zülalların ekstraksiyası müəyyən edilmiş protokollar əsasında həyata keçirilə bilən, yüksək dərəcədə etibarlı və təkrarlana bilən proseslərdir. Ultrasəs prosesinin intensivliyi amplituda, dövr / impuls rejimi, temperatur və nümunə həcmi kimi ultrasəslə işləmə parametrləri vasitəsilə dəqiq tənzimlənə bildiyindən, bir dəfə təsdiqlənmiş protokollar eyni nəticə ilə dəfələrlə təkrarlana bilər.

DNT və RNT-nin ultrasəslə fraqmentasiyası

Hüceyrələrin lizisindən və zülalların ekstraksiyasından sonra nümunələrin hazırlanmasında adətən tələb olunan mərhələlərdən biri DNT, RNT və xromatinin kəsici qüvvələrlə parçalanması və fraqmentasiyasıdır, məsələn, xromatinin immunopresipitasiyasından (ChIP) əvvəl. DNT-ni bir yerdə saxlayan kovalent rabitələrin fiziki qüvvələrlə qırılması ilə DNT və RNT-nin fraqmentasiyası etibarlı şəkildə həyata keçirilə bilər. Ultrasəslə işləmə kimi fiziki kəsici təsirdən istifadə edildikdə əvvəlcə DNT zəncirləri qırılır, sonra isə DNT daha kiçik hissələrə parçalanır.
DNT-nin ultrasəslə fraqmentasiyası DNT-ni hədəflənən uzunluğa, məsələn, 500bp (əsas cütü) qədər parçalamaq üçün etibarlı və səmərəlidir. DNT-nin ultrasəslə fraqmentasiyasının əsas üstünlüklərinə ultrasəs prosesinin parametrlərinə və intensivliyinə dəqiq nəzarət daxildir. Ultrasəs prosesinin parametrləri ultrasəslə işləmənin intensivliyini, dövrlərini və müddətini dəqiq tənzimləməklə dəyişdirilə bilər. Bu, istənilən ölçüdə DNT əldə etməyə imkan verir və hədəflənən DNT uzunluğu etibarlı şəkildə həm əldə edilə, həm də yenidən əldə edilə bilər. DNT-nin ultrasəsin yaratdığı kəsici qüvvələrlə parçalanması yüksək molekulyar çəkili DNT fraqmentləri yaratmaq üçün də idealdır.

Drosophila melanogaster-in ultrasəslə lizisi üçün protokollar

Aşağıda Drosophila nümunələrinin ultrasəs köməyi ilə lizisi, zülalların ekstraksiyası və DNT və ya xromatinin fraqmentasiyası üçün müxtəlif protokollar tapa bilərsiniz.

Çarpaz bağlama ilə immunopresipitasiya (CLIP) analizi üçün ultrasəslə lizis

CLIP analizi bəzi dəyişikliklərlə əvvəllər bildirildiyi kimi həyata keçirilmişdir. Vəhşi tipli, 0–1 günlük dişi fərdlərdən götürülmüş təxminən 20 mg yumurtalıq UV ilə çarpaz bağlanmış (3 × 2000 μJ/cm2), 300 U RNAseOUT əlavə edilmiş 1 mL RCB buferində (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saxaroza, 1 mM DTT, 1× EDTA-sız Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) buz üzərində homogenləşdirilmiş və 30 min buz üzərində saxlanmışdır. Homogenat buz üzərində, 80% gücdə, aralarında 60 s fasilə olmaqla beş dəfə 20 s müddətli impulslarla Hielscher ultrasəs prosessoru UP100H (100 W, 30 kHz) ilə ultrasəslə işlənmiş və sentrifuqalanmışdır (4°C temperaturda 5 min ərzində 16.000 × g). Həll olan ekstrakt 20 μl Protein-G dynabeads ilə 4°C temperaturda 20 min ərzində ilkin təmizləmədən keçirilmişdir. İmmunoblotinq və daxil edilən RNT-nin miqdarının təyini (1%) üçün nümunələr ayrıldıqdan sonra HP1, 450 μl ilkin təmizlənmiş ekstraktdan anti-HP1 9A9 anticismi ilə, 50 μl Protein-G dynabeads ilə 4 h inkubasiya yolu ilə immunopresipitasiya edilmişdir. İmmunopresipitatlar RCB ilə 4 dəfə yuyulmuşdur. İmmunopresipitasiya edilmiş RNT-ləri elüsiya etmək üçün çökdürülmüş kürəciklər 100 μL UltraPure DEPC ilə işlənmiş suda 5 min qaynadılmışdır. RNT hazırlanması üçün əldə edilmiş supernatanta 900 μL Qiazol Reagent əlavə edilmişdir. Təmizlənmiş RNT istehsalçının protokoluna uyğun olaraq oliqo dT, təsadüfi heksamerlər və SuperScript əks transkriptaza III istifadə edilməklə cDNT sintezi üçün matrisa kimi istifadə edilmişdir.
(Cassale et al. 2019)

Xromatinin immunopresipitasiyası analizi üçün ultrasəslə lizis

Xromatinin immunopresipitasiyası kiçik dəyişikliklərlə Menet tərəfindən təsvir edilmiş üsula uyğun həyata keçirilmişdir. Vəhşi tipli, 0–1 günlük dişi fərdlərdən götürülmüş təxminən 20 mg yumurtalıq 1 mL NEB buferində (pH 8,0-da 10 mM HEPES-Na, 10 mM NaCl, pH 8-də 0,1 mM EGTA-Na, pH 8-də 0,5 mM EDTA-Na, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidin, 0,15 mM spermin, 1× EDTA-sız Complete Protease Inhibitors) homogenizator / daldırma dispersatoru ilə 1 min ərzində (3000 rpm sürətində) homogenləşdirilmişdir. Homogenat əvvəlcədən soyudulmuş şüşə Dounce homogenizatoruna köçürülmüş və sıx oturan porşenlə 15 tam gediş yerinə yetirilmişdir. Daha sonra sərbəst nüvələr 4°C temperaturda 10 min ərzində 6000xg-də sentrifuqalanmışdır. Nüvələri ehtiva edən çöküntülər 1 mL NEB-də yenidən suspenziyaya çevrilmiş və saxaroza qradiyenti üzərində (NEB-də 0,65 mL 1,6 M saxaroza, NEB-də 0,35 mL 0,8 M saxaroza) 20 min ərzində 20.000 × g-də sentrifuqalanmışdır. Çöküntü 1 mL NEB-də və son konsentrasiyası 1% olan formaldehiddə yenidən suspenziyaya çevrilmişdir. Nüvələr otaq temperaturunda 10 min ərzində çarpaz bağlanmış və 1/10 həcm 1,375 M qlisin əlavə edilməklə reaksiya dayandırılmışdır. Nüvələr 5 min ərzində 6000 × g-də sentrifuqalanaraq toplanmışdır. Nüvələr 1 mL NEB-də iki dəfə yuyulmuş və 1 mL lizis buferində (pH 7,6-da 15 mM HEPES-Na, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, pH 8-də 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na dezoksixolat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarkozin və 1× EDTA-sız Complete Protease Inhibitors) yenidən suspenziyaya çevrilmişdir. Nüvələr Hielscher ultrasəs prosessoru UP100H (100 W, 30 kHz) ilə altı dəfə, hər dəfə 20 s ultrasəs təsiri və 1 min buz üzərində saxlanma ilə işlənmişdir. Ultrasəslə işlənmiş nüvələr 4°C temperaturda 4 min ərzində 13.000 × g-də sentrifuqalanmışdır. Ultrasəslə işlənmiş xromatinin əksər hissəsinin uzunluğu 500–1000 əsas cütü (bp) olmuşdur. Hər immunopresipitasiya üçün 15 μg xromatin 10 μg HP1 9A9 monoklonal anticisminin iştirakı ilə inkubasiya edilmişdir (fırlanan çarxda 4°C temperaturda 3 h). Sonra 50 μl dynabeads protein G əlavə edilmiş və inkubasiya 4°C temperaturda gecə boyunca davam etdirilmişdir. Supernatantlar atılmış, nümunələr lizis buferində iki dəfə (hər yuma 4 °C temperaturda 15 min) və TE buferində iki dəfə (1 mM EDTA, pH 8-də 10 mM TrisHCl) yuyulmuşdur. Xromatin kürəciklərdən iki mərhələdə elüsiya edilmişdir; əvvəlcə 100 μl elüsiya buferi 1-də (10 mM EDTA, 1% SDS, pH 8-də 50 mM TrisHCl) 65°C temperaturda 15 min, ardınca sentrifuqalama və supernatantın toplanması həyata keçirilmişdir. Kürəcik materialı 100 μl TE + 0,67% SDS-də təkrar ekstraksiya edilmişdir. Birləşdirilmiş elüat (200 μl) çarpaz rabitələri aradan qaldırmaq üçün 65°C temperaturda gecə boyunca inkubasiya edilmiş və 65°C temperaturda 15 min ərzində 50 μg/ml RNaseA ilə, həmçinin 65°C temperaturda 3 h ərzində 500 μg/ml Proteinase K ilə işlənmişdir. Nümunələr fenol–xloroform ilə ekstraksiya edilmiş və etanolla çökdürülmüşdür. DNT 25 μl suda yenidən suspenziyaya çevrilmişdir. İmmunopresipitasiya edilmiş DNT ilə molekulyar analizləri maksimum dərəcədə artırmaq üçün namizəd genlər optimallaşdırılmış dupleks-PCR protokolu vasitəsilə, bir reaksiyada oxşar ərimə temperaturlarına malik iki müxtəlif praymer dəstindən istifadə etməklə cüt-cüt amplifikasiya edilmişdir.
(Casale et al. 2019)
 

Bioloji nümunələr üçün yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs hüceyrə parçalayıcıları

Hüceyrələrin parçalanması, lizis, zülalların ekstraksiyası, DNT, RNT və xromatinin fraqmentasiyası, eləcə də digər analizöncəsi nümunə hazırlığı mərhələləri üçün yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs cihazlarına gəldikdə Hielscher Ultrasonics sizin uzunmüddətli təcrübəyə malik tərəfdaşınızdır. Ultrasəs laboratoriya homogenizatorlarının və nümunə hazırlığı qurğularının geniş çeşidini təklif edən Hielscher bioloji tətbiqiniz və tələbləriniz üçün ideal ultrasəs cihazına malikdir.
Mikrouclu klassik zond tipli ultrasəs cihazı, məsələn, UP200St (200W; soldakı şəklə baxın) və ya ultrasəslə nümunə hazırlığı qurğularından VialTweeter yaxud UP200ST_TD_CupHorn VialHolder ilə birlikdə tədqiqat və analitik laboratoriyalarda ən çox üstünlük verilən modellərdir. Klassik ultrasəs zondu az sayda nümunənin lizisə, ekstraksiyaya və ya fraqmentasiyaya məruz qoyulması lazım olduqda idealdır. VialTweeter və UP200St_TD_CupHorn nümunə hazırlığı qurğuları müvafiq olaraq 10 və ya 5 flakona qədər nümunənin eyni vaxtda ultrasəslə işlənməsinə imkan verir.
Çox sayda nümunə (məsələn, 96 yuvalı lövhələr, mikrotitr lövhələri və s.) emal edilməlidirsə, UIP400MTP ultrasəslə işləmə üçün ideal qurğudur. UIP400MTP su ilə doldurulan və mikro-yuvalı lövhələri yerləşdirmək üçün kifayət qədər sahəsi olan daha böyük bir cuphorn kimi işləyir. 400 vatt gücündə ultrasəs prosessoru ilə təchiz edilmiş UIP400MTP hüceyrələri parçalamaq, nümunələri lizisə məruz qoymaq, çöküntüləri həll etmək, zülalları ekstraksiya etmək və ya DNT-ni kəsici qüvvələrlə parçalamaq üçün çoxyuvalı lövhələrin çox bərabər və intensiv ultrasəslə işlənməsini təmin edir.

Ağıllı proqram təminatı vasitəsilə dəqiq nəzarət

200 vatt və daha yüksək gücə malik bütün Hielscher ultrasəslə işləmə həlləri rəqəmsal rəngli sensor ekran və ağıllı proqram təminatı ilə təchiz edilmişdir. Ağıllı məlumat qeydiyyatı vasitəsilə ultrasəs cihazı işə salınan kimi ultrasəs prosesinin bütün parametrləri avtomatik olaraq daxili SD kartda CSV faylı şəklində saxlanılır. Bu, tədqiqat və məlumatların qeydə alınmasını xeyli rahatlaşdırır. Ultrasəslə işləmə sınaqlarından və ya nümunə hazırlığından sonra hər ultrasəslə işləmə prosesinin parametrlərini asanlıqla nəzərdən keçirə və müqayisə edə bilərsiniz.
İntuitiv menyu vasitəsilə ultrasəslə işləmədən əvvəl çoxsaylı parametrlər təyin edilə bilər: məsələn, nümunənin temperaturuna nəzarət etmək və onun termik parçalanmasının qarşısını almaq üçün nümunə temperaturunun yuxarı həddi təyin edilə bilər. Ultrasəs qurğusu ilə birlikdə verilən qoşula bilən temperatur sensoru ultrasəs prosessoruna ultrasəslə işləmənin faktiki temperaturu barədə məlumat verir. Temperaturun yuxarı həddinə çatdıqda ultrasəs cihazı təyin edilmiş ∆T-nin aşağı həddinə çatana qədər dayanır və sonra avtomatik olaraq ultrasəslə işləməyə yenidən başlayır.
Müəyyən enerji daxilolması ilə ultrasəslə işləmə tələb olunursa, ultrasəslə işləmə prosesinin yekun ultrasəs enerjisini əvvəlcədən təyin edə bilərsiniz. Əlbəttə, ultrasəs impulsları və dövr rejimi də ayrıca təyin edilə bilər.
Ən uğurlu ultrasəslə işləmə parametrlərinizdən yenidən istifadə etmək üçün müxtəlif ultrasəslə işləmə rejimlərini (məsələn, ultrasəslə işləmə müddəti, intensivlik, dövr rejimi və s.) əvvəlcədən təyin edilmiş rejimlər kimi saxlaya bilərsiniz ki, onları asanlıqla və sürətlə yenidən işə salasınız.
İstifadəni daha da rahatlaşdırmaq üçün bütün rəqəmsal ultrasəs qurğuları istənilən geniş istifadə olunan brauzerdə (məsələn, InternetExplorer, Safari, Chrome və s.) brauzer vasitəsilə uzaqdan idarə oluna bilər. LAN bağlantısı sadə qoş və işlət quraşdırmasına malikdir və əlavə proqram təminatı quraşdırılmasını tələb etmir.
Hielscher olaraq bilirik ki, bioloji nümunələrin uğurlu ultrasəslə işlənməsi dəqiqlik və təkrarlana bilmə tələb edir. Buna görə də ultrasəs cihazlarımızı səmərəli, etibarlı, təkrarlana bilən və rahat nümunə hazırlığına imkan verən bütün funksiyalara malik ağıllı cihazlar kimi layihələndirmişik.

Aşağıdakı cədvəl çoxsaylı nümunələrin rahat və etibarlı hazırlanması üçün ultrasəs mikrouclarından və klassik ultrasəs homogenizatorlarından MultiSample ultrasəs cihazlarına qədər ultrasəs sistemlərimizin təxmini emal imkanları barədə məlumat verir: