Drosophila Melanogaster Nümunələrinin Ultrasəs Lizisi

Drosophila melanogaster laboratoriyalarda model orqanizm kimi geniş istifadə olunur. Buna görə də, Drosophila melanogaster nümunələrinin lizisi, hüceyrənin pozulması, zülal çıxarılması və DNT-nin kəsilməsi kimi analitik hazırlıq mərhələləri tez-tez həyata keçirilməlidir. Ultrasonik dismembratatorlar etibarlı və səmərəlidir və yalnız ultrasəs proses parametrlərini tənzimləməklə liziz, zülal çıxarılması və ya DNT-nin parçalanması kimi müxtəlif vəzifələri yerinə yetirmək üçün istifadə edilə bilər. Ultrasonik homojenizatorlar geniş tətbiq sahəsinə malik çevik alətlərdir.

Ultrasonik Lizis və Zülal Ekstraksiya

Lizis, hüceyrənin həll edilməsi, toxumaların homojenləşdirilməsi və zülalların çıxarılması bioloji laboratoriyalarda ultrasəs dismembratatorlar üçün tipik vəzifələrdir. Ultrasonik dismembratatorlar və hüceyrə pozucuları heyvan toxumalarını, həşəratları (məsələn, Drosophila melanogaster, C. elegans) və ya bitki nümunələrini homogenləşdirmək üçün çox uyğundur. Ultrasonikasiyanın sonrakı tətbiqləri hüceyrə süspansiyonlarının və qranulların lizisi, həmçinin hüceyrədaxili zülalların çıxarılmasıdır.
Ultrasəs lizis və zülal çıxarılması yüksək etibarlı və təkrarlana bilən proseslərdir, müəyyən edilmiş protokollar əsasında həyata keçirilə bilər. Ultrasəs prosesinin intensivliyi amplituda, dövr / nəbz rejimi, temperatur və nümunə həcmi kimi sonikasiya parametrləri ilə dəqiq tənzimlənə bildiyindən, sübut edilmiş protokollar eyni nəticə ilə təkrar-təkrar təkrarlana bilər.

Ultrasonik DNT və RNT fraqmentasiyası

Hüceyrə lizisi və zülal ekstraksiyasından sonra nümunənin hazırlanmasında ümumi tələb olunan addım DNT, RNT və xromatinin kəsilməsi və parçalanmasıdır, məsələn, xromatinin immunopresipitiasiyası (ChIP). DNT və RNT parçalanması, DNT-ni bir yerdə saxlayan kovalent bağları fiziki qüvvələr vasitəsilə pozmaqla etibarlı şəkildə əldə edilə bilər. Sonikasiya kimi fiziki kəsimdən istifadə edərək əvvəlcə DNT zəncirləri qırılır, sonra DNT daha kiçik parçalara bölünür.
Ultrasəs DNT fraqmentasiyası DNT-ni hədəflənmiş uzunluğa, məsələn, 500bp-ə (əsas cütləri) kəsməkdə etibarlı və effektivdir. Ultrasəs DNT parçalanmasının əsas üstünlükləri ultrasəs proses parametrlərinin və intensivliyinin dəqiq idarə edilməsini əhatə edir. Ultrasəs prosesinin parametrləri sonikasiya intensivliyini, dövrləri və vaxtı dəqiq şəkildə tənzimləməklə tənzimlənə bilər. Bu, istədiyiniz DNT ölçülərini yaratmağa imkan verir və hədəflənmiş DNT uzunluğu etibarlı şəkildə istehsal oluna və çoxalda bilər. Ultrasonik DNT kəsimi də yüksək molekulyar ağırlıqlı DNT fraqmentləri yaratmaq üçün idealdır.

Drosophila melanogaster-in ultrasəs lizisi üçün protokollar

Aşağıda Drosophila nümunələrinin ultrasəs köməyi ilə lizisi, zülal çıxarılması və DNT və ya xromatinin parçalanması üçün müxtəlif protokolları tapa bilərsiniz.

Çarpaz Bağlayıcı İmmunoprecipitation (CLIP) Təhlili üçün Ultrasəs Lizis

CLIP analizi əvvəllər bildirildiyi kimi bəzi dəyişikliklərlə aparılmışdır. 0-1 günlük vəhşi tipli dişilərin təxminən 20 mq yumurtalıqları UV çarpaz bağlanmış (3 × 2000 μJ/sm2), 1 ml RCB tamponunda (50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaClm2, 200 mM Na5M2,) buz üzərində homogenləşdirilmişdir. MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saxaroza, 1 mM DTT, 1 × EDTA-sız Tam Proteaz İnhibitorları, 1 mM PMSF) 300 U RNAseOUT ilə əlavə edilmiş və 30 dəqiqə buz üzərində yerləşdirilmişdir. Homojenat buz üzərində, 80% gücdə, Hielscher Ultrasonik Prosessorundan istifadə etməklə 20 saniyədə beş dəfə, 60 saniyəlik fasilə ilə sonikləşdirildi. UP100H (100 Vt, 30 kHz) və sentrifuqalanmış (4°C-də 5 dəqiqə ərzində 16000 × g). Həll olunan ekstrakt 4°C-də 20 dəqiqə ərzində 20 μl Protein-G dinabeadları ilə əvvəlcədən təmizlənmişdir. İmmunoblotinq üçün nümunələr çıxarıldıqdan və RNT girişinin miqdarının müəyyən edilməsindən (1%) sonra HP1 50 μl Protein-G dinabeadları ilə 4 saat ərzində inkubasiya yolu ilə 450 μl əvvəlcədən təmizlənmiş ekstraktdan anti-HP1 9A9 antikoru ilə immunoprecipitasiya edilmişdir. İmmunopresipitatlar RCB ilə 4 dəfə yuyuldu. İmmunoçökülmüş RNT-ləri təmizləmək üçün qranullaşmış muncuqlar 100 μL UltraPure DEPC ilə işlənmiş Suda 5 dəqiqə qaynadıldı. 900 μL Qiazol Reagenti RNT hazırlanması üçün bərpa edilmiş supernatant əlavə edildi. Təmizlənmiş RNT istehsalçının protokoluna uyğun olaraq oliqo dT, təsadüfi heksamerlər və SuperScript əks transkriptaza III istifadə edərək cDNA sintezi üçün şablon kimi istifadə edilmişdir.
(Cassale et al. 2019)

Xromatin İmmunoprecipitation Assay üçün Ultrasonik Lizis

Xromatin immunoprecipitation kiçik dəyişikliklərlə Menet tərəfindən təsvir edilən üsula uyğun olaraq həyata keçirildi. 0-dan 1 günlük yabanı tipli dişilərdən təxminən 20 mq yumurtalıqlar 1 mL NEB tamponunda (pH 8.0-da 10 mM HEPES-Na, 10 mM NaCl, pH 8, 0.5-də 0.1 mM EGTA-Na) homogenləşdirildi. pH 8-də EDTA-Na, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM Spermidin, 0.15 mM Spermin, 1 × EDTA-sız Tam Proteaz İnhibitorları) homojenizator / daldırma disperseri ilə 1 dəq (3000 rpm-də). Homojenat əvvəlcədən soyudulmuş bir şüşə qaba köçürüldü və sıx bir pestle ilə 15 tam vuruş tətbiq edildi. Daha sonra sərbəst nüvələr 4°C-də 10 dəqiqə 6000xg-də sentrifuqa edilmişdir. Nüvə tərkibli qranullar 1 ml NEB-də yenidən dayandırıldı və saxaroza qradiyenti üzrə 20 dəqiqə ərzində 20000 × g-də sentrifuqa edildi (NEB-də 0,65 mL 1,6 M saxaroza, NEB-də 0,35 mL 0,8 M saxaroza). Qranullar 1 mL NEB və formaldehiddə 1% son konsentrasiyaya qədər yenidən dayandırıldı. Nüvələr otaq temperaturunda 10 dəqiqə ərzində çarpaz bağlandı və 1/10 həcmdə 1,375 M qlisin əlavə edilərək söndürüldü. Nüvələr 5 dəqiqə ərzində 6000 × g-də sentrifuqa ilə toplandı. Nüvələr 1 ml NEB-də iki dəfə yuyuldu və 1 mL Lizis Buferində (pH 7.6-da 15 mM HEPES-Na, 140 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, pH 8-də 1 mM EDTA, 1% Triton X-050) yenidən dayandırıldı. mM DTT, 0,1% Na deoksixolat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarkosin və 1× EDTA-sız Tam Proteaz inhibitorları). Nüvələr Hielscher ultrasəs prosessorundan istifadə edərək sonikləşdirildi UP100H (100 Vt, 30 kHz) altı dəfə 20 saniyə və buz üzərində 1 dəqiqə. Sonicated nüvələr 4 ° C-də 4 dəqiqə 13000 × g-də sentrifuqa edilmişdir. Sonicated xromatinin əksəriyyəti uzunluğu 500 ilə 1000 əsas cüt (bp) idi. Hər bir immunopresipitasiya üçün 15 μg xromatin 10 μg HP1 9A9 monoklonal antikorunun (fırlanan təkərdə 4°C-də 3 saat) iştirakı ilə inkubasiya edilmişdir. Sonra, 50 μl Dynabeads protein G əlavə edildi və inkubasiya bir gecədə 4°C-də davam etdirildi. Supernatantlar atıldı və nümunələr iki dəfə Lizis Tamponunda (hər yuma 4 °C-də 15 dəqiqə) və iki dəfə TE Tamponunda (pH 8-də 1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl) yuyuldu. Xromatin iki addımda muncuqlardan çıxarıldı; əvvəlcə 100 μl Eluition Buffer 1-də (10 mM EDTA, 1% SDS, pH 8-də 50 mM TrisHCl) 65°C-də 15 dəqiqə, sonra sentrifuqasiya və supernatantın bərpası. Muncuq materialı 100 μl TE + 0,67% SDS-də yenidən çıxarıldı. Qarışıq eluat (200 μl) çarpaz əlaqələri bərpa etmək üçün bir gecədə 65 ° C-də inkubasiya edildi və 65 ° C-də 15 dəqiqə ərzində 50 μg/ml RNaseA və 65 ° C-də 3 saat ərzində 500 μg/ml Proteinase K ilə müalicə edildi. Nümunələr fenol-xloroform ekstraktı və etanol çökdürüldü. DNT 25 μl suda yenidən dayandırıldı. İmmunopresipitasiya edilmiş DNT ilə molekulyar analizləri maksimuma çatdırmaq üçün namizəd genlər bir reaksiyada oxşar ərimə temperaturlarına malik iki fərqli primer dəstindən istifadə etməklə optimallaşdırılmış dupleks-PCR protokolu vasitəsilə cüt-cüt gücləndirilmişdir.
(Casale et al. 2019)
 

Bioloji nümunələr üçün yüksək performanslı ultrasəs hüceyrə pozucuları

Hüceyrələrin pozulması, lizisi, zülal çıxarılması, DNT, RNT və xromatinin parçalanması, eləcə də digər pre-analitik nümunə hazırlama mərhələləri üçün yüksək performanslı ultrasəs cihazlarına gəldikdə, Hielscher Ultrasonics sizin çoxillik təcrübəli tərəfdaşınızdır. Ultrasəs laboratoriya homogenizatorları və nümunə hazırlama vahidlərinin hərtərəfli portfelini təklif edən Hielscher sizin bioloji tətbiqiniz və tələbləriniz üçün ideal ultrasəs cihazına malikdir.
kimi mikro ucu olan klassik zond tipli ultrasəs cihazı UP200 St (200W; soldakı şəklə baxın) və ya ultrasəs nümunəsi hazırlama qurğularından biri VialTweeter və ya UP200St_TD_CupHorn VialHolder ilə tədqiqat və analitik laboratoriyalarda sevimli modellərdir. Klassik ultrasəs zondu idealdır, daha az nümunə hazırlayarkən parçalanmalı, çıxarılmalı və ya parçalanmalıdır. Nümunə hazırlama vahidləri VialTweeter və UP200St_TD_CupHorn müvafiq olaraq 10 və ya 5 flakonun eyni vaxtda sonikasiyasına imkan verir.
Əgər yüksək nümunə nömrələri (məsələn, 96 quyu boşqabları, mikrotitr lövhələri və s.) emal edilməlidirsə, UIP400MTP ideal sonication quraşdırma edir. UIP400MTP, su ilə doldurulmuş və mikro quyu boşqablarını saxlamaq üçün kifayət qədər yerə malik olan daha böyük kubok kimi işləyir. 400 vatt güclü ultrasəs prosessoru ilə təchiz edilmiş UIP400MTP hüceyrələri pozmaq, nümunələri parçalamaq, qranulları həll etmək, zülalları çıxarmaq və ya DNT-ni kəsmək üçün çoxlu quyu lövhələrinin çox vahid və intensiv sonikasiyasını təmin edir.

Ağıllı proqram təminatı vasitəsilə dəqiq nəzarət

200 vattdan yuxarı olan bütün Hielscher sonication həlləri rəqəmsal rəngli sensor ekran və ağıllı proqram təminatı ilə təchiz edilmişdir. Ağıllı məlumatların protokollaşdırılması vasitəsilə bütün ultrasəs proses parametrləri ultrasəs cihazı işə salınan kimi avtomatik olaraq daxili SD kartda CSV faylı kimi saxlanılır. Bu, tədqiqat və protokollaşdırmanı çox daha rahat edir. Sonikasiya sınaqlarından və ya nümunə hazırlığından sonra siz sadəcə olaraq hər sonication işinin sonikasiya parametrlərini nəzərdən keçirə və onları müqayisə edə bilərsiniz.
İntuitiv menyu vasitəsilə, sonikasiyadan əvvəl çoxsaylı parametrlər əvvəlcədən təyin edilə bilər: Məsələn, nümunədəki temperatura nəzarət etmək və onun istilik deqradasiyasının qarşısını almaq üçün nümunə temperaturunun yuxarı həddi təyin edilə bilər. Ultrasəs qurğusu ilə birlikdə gələn qoşula bilən temperatur sensoru ultrasəs prosessoruna faktiki sonikasiya temperaturu haqqında rəy verir. Üst temperatur həddinə çatdıqda, ultrasəs cihazı müəyyən edilmiş ∆T-nin aşağı həddinə çatana qədər fasilə verir və sonra avtomatik olaraq yenidən səslənməyə başlayır.
Müəyyən bir enerji girişi ilə sonikasiya tələb olunarsa, sonikasiya işinin son ultrasəs enerjisini əvvəlcədən təyin edə bilərsiniz. Əlbəttə ki, ultrasəs pulsasiyası və dövr rejimi də fərdi olaraq təyin edilə bilər.
Ən uğurlu sonication parametrlərinizi yenidən istifadə etmək üçün siz müxtəlif sonication rejimlərini (məsələn, sonikasiya vaxtı, intensivliyi, dövr rejimi və s.) əvvəlcədən təyin edilmiş rejimlər kimi saxlaya bilərsiniz ki, onlar asan və sürətlə yenidən işə salınsın.
Daha çox əməliyyat rahatlığı üçün bütün rəqəmsal ultrasəs qurğuları istənilən ümumi brauzerdə (məsələn, InternetExplorer, Safari, Chrome və s.) brauzerin uzaqdan idarə edilməsi vasitəsilə idarə oluna bilər. LAN bağlantısı sadə plug-n-play quraşdırmasıdır və əlavə proqram təminatının quraşdırılmasına ehtiyac yoxdur.
Biz Hielscher-də bilirik ki, bioloji nümunələrin uğurlu sonikasiyası dəqiqlik və təkrarlanma tələb edir. Buna görə də, biz ultrasəs aparatlarımızı səmərəli, etibarlı, təkrarlana bilən və rahat nümunə hazırlamağa imkan verən bütün xüsusiyyətlərə malik ağıllı cihazlar kimi dizayn etdik.

Aşağıdakı cədvəl çoxsaylı nümunələrin rahat, etibarlı hazırlanması üçün ultrasəs sistemlərimizin ultrasəs mikro-məsləhətçilərindən və klassik ultrasəs homogenizatorlarından MultiSample ultrasəs cihazına qədər təxmini emal qabiliyyətinin göstəricisini verir: