C. Elegans nümunələrinin ultrasəslə hazırlanması
Nematod qurdu olan C. elegans biologiyada geniş istifadə olunan model orqanizmdir. Analizdən əvvəl nümunələrin hazırlanması lizis, zülal və lipid ekstraksiyası, həmçinin RNT fraqmentasiyası tələb edir; bunlar ultrasəslə işləmə vasitəsilə etibarlı şəkildə yerinə yetirilə bilər. Ultrasəs hüceyrə parçalayıcıları C. elegans nümunələrinin sürətli hazırlanması üçün etibarlı, təkmil və istifadəsi asan cihazlardır.
C. elegans nümunələrinin ultrasəslə hazırlanması
Caenorhabditis elegans genomika, inkişaf biologiyası və xəstəliklərin öyrənilməsi üçün tədqiqat laboratoriyalarında geniş istifadə olunan yumru qurdlardır. C. elegans genomundakı bir çox genin insanlarda funksional qarşılığı vardır. Buna görə də bu nematod qurdu insan xəstəlikləri üçün son dərəcə faydalı modeldir. C. elegans növünün geniş istifadəsinə imkan verən digər üstünlüklər bakteriya (məsələn, E. coli) olan lövhələrdə asan və ucuz yetişdirilməsi, şəffaflığı, onunla işləməyin rahatlığı, həmçinin qurdların dondurularaq daha uzun müddət saxlanılması imkanıdır.
Zülal və lipid analizi laboratoriyalarda müntəzəm aparılan prosedurlardır və ultrasəslə nümunə hazırlanması bütün inkişaf mərhələlərində (yəni embrionlar, L1-L4 sürfələri, yetkin fərdlər) C. elegans nematodlarının lizisi üçün qəbul edilmiş üsuldur. C. elegans hədəf zülalların yüksək səviyyədə ekspressiyası üçün zülal ekspressiya sistemi kimi də istifadə olunduğundan, yüksək zülal çıxımı verən etibarlı, təkrarlana bilən lizis və zülal ekstraksiyası üsulu tələb olunur. Ultrasəslə hüceyrə parçalanması və ekstraksiya sistemləri zond tipli homogenizatorlar və çoxnümunəli ultrasəs cihazları şəklində mövcuddur. Nümunələrin rahat hazırlanmasını və hər cür nümunə ölçüsü və sayını nəzərə alan Hielscher Ultrasonics laboratoriya prosedurunuz üçün ideal ultrasəs hüceyrə parçalayıcısına malikdir.

- Qurd homogenatlarının hazırlanması
- Zülal ekstraksiyası
- Lipid ekstraksiyası
- Zülalın miqdarının təyini
- İmmunopresipitasiya
- Vestern blotinq
- RNT ekstraksiyası
- Fermentativ analizlər
VialTweeter çoxnümunəli sonikatoru 10 sınaq borusunun eyni vaxtda hazırlanması üçündür.
C. Elegans parçalanması və lizisi üçün ultrasəs protokolları
C. elegans növünün ultrasəslə homogenləşdirilməsi və lizisi, eləcə də sonrakı zülal və lipid ekstraksiyası müxtəlif homogenləşdirmə və lizis buferləri və s. istifadə edilməklə fərqli prosedurlarla həyata keçirilə bilər. Bütün lizis protokollarının ortaq cəhəti zülalların deqradasiyasının qarşısını almaq üçün nümunələrin daim buz üzərində saxlanılmasının zəruriliyidir. Aşağıda yüksək keyfiyyətli zülal və ya lipid tərkibli C. elegans nümunələrinin hazırlanması üçün bəzi etibarlı və sürətli ultrasəs lizisi və ekstraksiya protokollarını təqdim edirik.
C. elegans ultrasəs lizisinin üstünlükləri
- etibarlı
- təkrarlana bilən
- temperaturu dəqiq idarə olunan
- prosesə etibarlı nəzarət
- yumşaq təsirli üsul
- tətbiqi asan
- təhlükəsiz
C. elegans nümunələrindən ultrasəslə zülal ekstraksiyası
C. elegans qurdlarının ultrasəs lizisi və zülal ekstraksiyası müxtəlif protokollardan istifadə etməklə həyata keçirilə bilər. Aşağıda təkrarlana bilən zülal ekstraksiyası nəticələri üçün bir neçə etibarlı və sürətli lizis protokolunu təqdim edirik.
C. elegans qurdlarından ultrasəslə sitozol ekstraktının sürətli hazırlanması
Aşağıdakı protokolla C. elegans lizatlarını 30 dəqiqədən az müddətdə hazırlaya bilərsiniz.
C. elegans qurdlarının toplanması
İstədiyiniz C. elegans qurdlarını fosfat buferli fizioloji məhlul (PBS) olan 1,5ml boruya yığın və ya onları lövhədən 1,5ml PBS ilə yuyaraq götürün. Çöküntü əldə etmək üçün 2000rpm sürətlə 1min sentrifuqalayın. Nümunələri hər zaman buz üzərində saxlayın.
Sonra qurdları iki dəfə PBS ilə yuyun.
Daha sonra qurdları iki dəfə ddH2O ilə yuyun.
Qurdları ən azı 500ul homogenləşdirmə buferində (HB) yenidən suspenziya halına gətirin. Qurd nümunələri artıq ultrasəs lizisinə hazırdır.
Daha yüksək keyfiyyətli zülal ekstraktı əldə etmək üçün qurdları hər birində 5min olmaqla PBS və steril, ultratəmiz su (ddH2O) ilə yumaqla və ya saxaroza flotasiyası aparmaqla bakterial çirklənməni azaltmaq istəyə bilərsiniz. Qurd nümunələrini daim buz üzərində saxlayın.
C. elegans ultrasəs lizisi protokolu
- Ultrasəs homogenizatorunun istifadəyə hazır olması üçün ultrasəs cihazını əvvəlcədən hazırladığınızdan əmin olun (zond quraşdırılmış, ultrasəslə işləmə proqramı əvvəlcədən təyin edilmiş olmalıdır).
- UP200St və ya UP200Ht ilə C. elegans lizisi üçün ultrasəslə işləmə mikro ucluqdan (məsələn, 2mm S26d2 zondu; soldakı şəklə baxın) istifadə etməklə 40% amplitudada 1sec ərzində, aralarda 30sec fasilələrlə aparılmalıdır. Hər biri 1 saniyə davam edən və aralarında 30sec fasilə olan 5 ultrasəslə işləmə dövrü C. elegans lizisi üçün idealdır. Lizisi ilk dəfə aparırsınızsa, hər impulsdan sonra nümunənin kiçik alikvotlarında mikroskopla lizisin gedişini yoxlaya bilərsiniz.
- Qurdlar parçalandıqda lizis uğurla tamamlanmış olur. Həddindən artıq ultrasəslə işləmə nüvələrin parçalanmasına səbəb olur və nümunə özlü hala gəldikdə və ya köpükləndikdə nəzərə çarpır. Nümunənin deqradasiyasının qarşısını almaq üçün lazım gələrsə daha çox impuls tətbiq edin. Yüksək keyfiyyətli zülal ekstraktları əldə etmək üçün hər ultrasəs impuls dövrünün müddətini artırmayın.
- Ultrasəslə lizis edilmiş qurdları 4ºC temperaturda 14.000rpm sürətlə 10min sentrifuqalayaraq hüceyrə lizatını durulaşdırın.
- Sonra supernatantı yeni boruya köçürün və immunopresipitasiya və ya digər analizlər üçün hazırlayın.
Ultrasəs cihazınız ştativdə quraşdırılıbsa, nümunə borularınız olan buz vannasını ultrasəs zondunun altına yerləşdirin və ultrasəs zondunu 1,5ml boruya daxil edin.
Homogenləşdirmə buferi haqqında qeyd: Yuxarıdakı ultrasəs lizisi protokolu üçün homogenləşdirmə buferini aşağıdakı kimi hazırlayın:
- 15 mM Hepes pH 7,6 – 0,5 M məhluldan 15 ml
- 10 mM KCl – 2 M məhluldan 2,5 ml
- 1,5 mM MgCl2 – 1 M məhluldan 0,75 ml
- 0,1 mM EDTA – 0,5 M məhluldan 100 ul
- 0,5 mM EGTA – 0,1 M məhluldan 2,5 ml
- 44 mM saxaroza – 50 % məhluldan 14,7 ml
- İstifadədən dərhal əvvəl əlavə edin: 1mM DTT – 1M məhluldan 1000x
- üstəlik proteaza inhibitoru
UIP400MTP lövhə ultrasəs cihazından istifadə etməklə 96 quyulu lövhələrdə C. elegans növünün yüksək nümunə emal məhsuldarlığı ilə lizisi
C. elegans lizisi (yetkin nematodlar)
UIP400MTP 80% amplituda, 20 dövr (hər ultrasəslə işləmə dövrü: 30 sec aktiv, 30 sec qeyri-aktiv)
Lizis buferi:
- Variant 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
- Variant 2) birgə immunopresipitasiya (co-IP) üçün: 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (Complete proteinaza inhibitorları kokteyli)
Yüksək nümunə emal məhsuldarlığı ilə DNT fraqmentasiyası
C. elegans (yetkin nematodlar) DNT-si 200–300bp: UIP400MTP lövhə ultrasəs cihazı – 80% amplituda, 30 impuls təyin edin – hər biri 30sec aktiv, 30sec qeyri-aktiv
Yüksək nümunə emal məhsuldarlığı ilə nümunə hazırlanması üçün UIP400MTP lövhə ultrasəs cihazı çoxquyulu, mikrotitr və 96 quyulu lövhələrdə nümunələri bərabər şəkildə ultrasəslə işləyir
Kəmiyyət affinlik təmizlənməsi analizləri üçün C. elegans ultrasəs lizisi
C. elegans embrionları (hər təkrar üçün ∼2 milyon) yumurta daşıyan gənc hermafroditlərin ağardıcı ilə işlənməsi yolu ilə üç bioloji təkrarda təzə toplanmış və buz üzərində ultrasəslə işlənmişdir (dövr: 0,5 s, amplituda: 40–45%, hər seansda 5 impuls, 5 seans, seanslararası interval: 30 s; UP200S ultrasəs prosessoru və S26d2 mikro ucluğu (Hielscher Ultrasonics GmbH) ilə) lizis buferində (ümumi həcm: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% qliserol, proteaza inhibitorları qarışığı, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Ultrasəslə işləmədən sonra Nonidet P-40 Substitute 1%-ə qədər əlavə edilmiş və lizatlar 4°C temperaturda 30 min başdan-ayağa fırladılmaqla inkubasiya edilmiş, sonra 4°C temperaturda 20.000 × g ilə 20 min sentrifuqalanmışdır. Daha sonra durulaşdırılmış lizat üst lipid təbəqəsi pozulmadan aspirasiya edilmiş və iki bərabər hissəyə bölünərək anti-GFP aqaroza muncuqlarına və ya bloklanmış nəzarət muncuqlarına (40–50 μl) əlavə edilmişdir. 4°C temperaturda 60–90 min başdan-ayağa fırladıldıqdan sonra muncuqlar bir dəfə 0,1% Nonidet P-40 Substitute olan lizis buferi ilə, ardınca iki dəfə ya I buferlə (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2), ya II buferlə (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), ya da hər ikisi ilə yuyulmuşdur. GFP:MBK-2 pull-down analizləri üçün müxtəlif yuma şəraitlərindən istifadə olunmaqla iki ayrı təcrübə aparılmışdır. Zülallar otaq temperaturunda 50 μl 6 m karbamid/2 M tiokarbamid məhlulunda orbital çalxalama ilə elüsiya edilmişdir. MBK-1::GFP pull-down təcrübələri üçün zülallar 90°C temperaturda 50μl 8 m quanidinium xlorid məhlulunda çalxalanmaqla iki dəfə elüsiya edilmiş, ardınca etanolla çökdürülmüşdür. Daha sonra elüsiya edilmiş zülal nümunələri məhlulda həzm edilmişdir.
(cf. Chen et al., 2016)
Qurdların ultrasəslə homogenləşdirilməsi və lizisi
C.elegans lizisi və zülal ekstraksiyası proseduru üçün hər nümunəyə müvafiq mərhələdə olan 30.000 nematod toplanmış və buz kimi soyuq S-basal ilə yuyulmuş, 1500 rpm sürətlə 2 min. sentrifuqalama yolu ilə qatılaşdırılmış, qalıq bakteriyaları uzaqlaşdırmaq üçün altı dəfə buz kimi soyuq S-basal ilə yuyulmuş və istifadəyə hazır olana qədər buz üzərində saxlanılmışdır. Zülal ekstraksiyası üçün yumurta daşıyan yetkin qurdların son S-basal yumasından sonra sıx çöküntü əmələ gətirməsinə imkan verilmişdir. Sonra qurd çöküntüləri 1 ml buz kimi soyuq ekstraksiya buferində [20 mM kalium fosfat, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, proteaza inhibitorları (Sigma P2714)] yenidən suspenziya halına gətirilmiş və dərhal işlənmişdir.
Yumurta daşıyan ∼30.000 yetkin qurd (∼100 mg yaş kütləyə uyğun gələn) 1 ml buz kimi soyuq ekstraksiya buferində, zond tipli ultrasəs cihazından (məsələn, MS2 mikro ucluqlu UP50H) istifadə etməklə, 40% amplitudada, 3 sec aktiv və 30 sec qeyri-aktiv olan 10 dövr ərzində buz üzərində ultrasəslə işlənmişdir. (cf. Baskharan et al. 2012)
C. elegans növündən ultrasəslə lipid ekstraksiyası
Metabolomikanın bir qolu olan lipidomikada bioloji sistemlərin lipid tərkibi xarakterizə və analiz edilir. C. elegans metabolik lipidlərin qarşılıqlı təsirini və onların sağlamlığa və ömür uzunluğuna təsirlərini araşdırmaq üçün lipidomikada geniş istifadə olunur.
Ultrasəs lizisi və ekstraksiyası C. elegans embrionlarından, sürfələrindən və yetkin qurdlarından sfinqolipidlər kimi lipidləri azad etmək üçün istifadə olunur. Ultrasəslə işləmə qurd homogenatlarının hazırlanması və sonradan nümunədən lipidlərin ekstraksiyası üçün istifadə olunur.
C. elegans növündən ultrasəslə lipid ekstraksiyası protokolu
C. elegans çöküntüsünün donunu buz üzərində açın və 0,5 ml ultrawater ilə yenidən suspenziya halına gətirin.
C. elegans nümunələrini daim buz üzərində saxlayaraq 1,5mL sınaq borularında ultrasəslə işləyin.
Ultrasəslə işləmə üçün aşağıdakı qurğulardan istifadə edilə bilər: zond tipli ultrasəs cihazı olan UP200Ht, ultrasəslə nümunə hazırlama qurğusu olan VialTweeter (10 nümunənin eyni vaxtda ultrasəslə işlənməsi) və ya UIP400MTP (96 quyulu lövhələr kimi çoxquyulu lövhələrin ultrasəslə işlənməsi üçün).
UP200Ht ilə ultrasəs lizisi üçün S26d2 mikro ucluğundan istifadə edin. Rəqəmsal menyuda ultrasəs dövr rejimini əvvəlcədən təyin edin. Amplitudanı 10%-ə, ultrasəslə işləmə dövr rejimini isə hər ultrasəs impuls seriyası arasında 30 sec. fasilə olmaqla, 2 sec impulslarla 20 dövrə təyin edin.
Supernatantları vintli qapağı olan şüşə borulara köçürün.
Hər şüşə boruya 1 ml ultrawater, ardınca hər şüşə boruya 6 ml xloroform/metanol (nisbət = 2:1) qarışığı əlavə etməklə Folch ekstraksiyası aparın.
Hər şüşə borunu vorteksdə 4 dəfə, hər dəfə 30 sec qarışdırın.
Fazaların ayrılmasını daha da yaxşılaşdırmaq üçün boruları 1.258 x g ilə 15 min sentrifuqalayın (Eppendorf, 5810 R).
Aşağı hidrofob fraksiyanı şüşə Paster pipeti ilə təmiz şüşə boruya köçürün.
Aşağı hidrofob fraksiyanı azot buxarlandırıcısında azot axını altında qurudun.
Qurudulmuş çöküntünü istifadəyə qədər -80 °C dondurucuda saxlayın.
Qurd lizatlarının ultrasəslə hazırlanması
Qurd lizatı: Bütün bakteriyaları uzaqlaşdırmaq üçün L4 mərhələsindəki qurdlar toplanmış və üç dəfə M9 buferi (42,26 mM Na2HPO4, 22,04 mM KH2PO4, 85,56 mM NaCl və 0,87 mM MgSO4) ilə yuyulmuşdur. M9 buferi mümkün qədər uzaqlaşdırıldıqdan sonra qurdlar lizis buferində yenidən suspenziya halına gətirilmişdir: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-qliserol fosfat, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM natrium flüorid, 1 mM natrium ortovanadat, 5 mM natrium pirofosfat, 0,2 mM fenilmetansulfonilflüorid və proteaza inhibitoru. Qurdlar üç dəfə maye azotda dondurulmuş və 37°C temperaturda donları açılmış, sonra 10 nümunə borusunun eyni vaxtda hazırlanması üçün ultrasəs VialTweeter qurğusu ilə quru buz üzərində ultrasəslə işlənmişdir. Ultrasəslə işləmə 50% amplitudada, ultrasəs impuls seriyaları arasında 30 sec fasilə olmaqla, hər biri 2 sec. davam edən 10 dövrdə aparılmışdır. Daha sonra nümunələr 4°C temperaturda 12.000 rpm sürətlə 15 min sentrifuqalanmışdır. Supernatant toplanmış və -70°C temperaturda saxlanılmışdır. Bir alikvot Bradford analizi ilə zülalın miqdarının təyini üçün istifadə edilmişdir.
Ümumi qlutationun, GSH və GSSG-nin təyini: Qlutationun miqdarının təyini üçün lizatların hazırlanması və təyinetmə eyni gündə aparılmışdır. Qlükoza ilə qidalandırılmış və nəzarət L4 sürfələri toplanmış və M9 buferi ilə üç dəfə yuyulmuşdur. M9 buferi mümkün qədər uzaqlaşdırıldıqdan sonra qurdlar buz kimi soyuq metafosfor turşusunda (5% w/v) yenidən suspenziya halına gətirilmiş, sonra ultrasəs VialTweeter ilə 50% amplitudada, hər dövr arasında 30 sec. fasilə olmaqla, hər biri 2 sec. davam edən on ultrasəslə işləmə dövründə buzda ultrasəslə işlənmişdir. Daha sonra 4 ̊C temperaturda 12.000 rpm sürətlə 15 min sentrifuqalanmışdır.
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)
İmmunopresipitasiya və Vestern blotinqdən əvvəl C. elegans nümunələrinin hazırlanması
Qısaca, embrion ekstraktları üçün C. elegans L1 sürfələri genişmiqyaslı maye S-mühiti kulturlarında yetkinliyə qədər yetişdirilmişdir. Embrionlar standart ağardıcı üsulu ilə toplanmış və lizis buferində (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% qliserol, 0,05% NP-40, 1 proteaza inhibitorları kokteyli və 1 fosfataza inhibitorları kokteyli I və II) suspenziya halına gətirilmiş, maye azotda sürətlə dondurulmuş və mikro ucluqlu ultrasəs cihazı ilə ultrasəslə hüceyrə parçalanması yolu ilə lizis edilmişdir; məsələn, UP200Ht ilə S26d2 istifadə edilərək 30% amplitudada 10 s ərzində 10 impuls tətbiq olunmuşdur. Daha çox sayda nümunə hazırlanmalıdırsa, ultrasəs VialTweeter və ya quyulu lövhələr üçün çoxnümunəli ultrasəs cihazı UIP400MTP tövsiyə olunur. Ultrasəslə işləmədən sonra ekstraktlar 30.000g ilə 20 min ərzində 4°C temperaturda sentrifuqalanaraq ilkin durulaşdırmadan keçirilmişdir. İlkin durulaşdırmadan keçirilmiş ekstrakt (300µg ümumi zülal) affinlik üsulu ilə təmizlənmiş və protein A-aqaroza ilə çarpaz bağlanmış 40µg anti-CDC-25.1 anticismi (bu tədqiqat) ilə inkubasiya edilmiş və ya nəzarət olaraq protein A-aqaroza ilə çarpaz bağlanmış oxşar miqdarda dovşan immunoqlobulini (Ig)G istifadə edilmişdir; bu, ümumi həcmi 200µl olan və tərkibində 1% NP-40 olan lizis buferində aparılmışdır. əlavə edilməsi zülalların matriksə qeyri-spesifik bağlanmasını azaltmışdır. Nümunələr 1 h ərzində 4°C temperaturda fırladılmış, muncuqlar lizis buferi ilə üç dəfə yuyulmuş və 30µl qlisin/HCl və 200 mM NaCl, pH 2,2 ilə elüsiya edilmişdir. İmmunopresipitasiyadan sonra elüatlar 30µl SDS nümunə buferində durulaşdırılmış, 95°C temperaturda 4 min qızdırılmış və adətən ilkin nümunə üçün ümumi miqdarın 3% hissəsi, elüatlar üçün isə 30% hissəsi SDS-PAGE-yə tətbiq edilmiş, ardınca anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3 (1:500) və ya anti-β-actin (1:2000) anticisimləri ilə Vestern blotinq aparılmışdır. Ekstraktlar immunopresipitasiyaya məruz qoyulmadıqda, həmin ekstraktlardan əldə olunmuş eyni miqdarda ümumi zülal SDS nümunə buferində yenidən suspenziya halına gətirilmiş, 95°C temperaturda qızdırılmış, sonra birbaşa SDS-PAGE-yə tətbiq edilmiş və Vestern blotinq ilə analiz edilmişdir. (cf. Segref et al. 2020)
UP200St ultrasəs hüceyrə parçalayıcısı lizis və zülal ekstraksiyası üçün S26d2 mikro ucluğu ilə
Dəqiq temperatur nəzarəti altında ultrasəs lizisi
Bioloji nümunələrlə işləyərkən dəqiq və etibarlı temperatur nəzarəti həlledici əhəmiyyət daşıyır. Yüksək temperaturlar nümunələrdə istilikdən qaynaqlanan zülal deqradasiyasını başladır.
Bütün mexaniki nümunə hazırlama üsulları kimi ultrasəslə işləmə də istilik yaradır. Bununla belə, VialTweeter istifadə edildikdə nümunələrin temperaturu yaxşı idarə oluna bilər. Nümunələrinizi analiz üçün VialTweeter və VialPress ilə hazırlayarkən onların temperaturunu izləmək və idarə etmək üçün müxtəlif variantları təqdim edirik.
- Nümunə temperaturunun izlənməsi: VialTweeter qurğusunu işlədən UP200St ultrasəs prosessoru ağıllı proqram təminatı və qoşula bilən temperatur sensoru ilə təchiz edilmişdir. Temperatur sensorunu UP200St cihazına qoşun və temperatur sensorunun ucunu nümunə borularından birinə daxil edin. Rəqəmsal rəngli toxunma ekranı vasitəsilə UP200St menyusunda nümunənizin ultrasəslə işlənməsi üçün müəyyən temperatur intervalı təyin edə bilərsiniz. Maksimum temperatura çatdıqda ultrasəs cihazı avtomatik dayanacaq və nümunə temperaturu təyin edilmiş temperatur ∆ intervalının aşağı qiymətinə enənə qədər fasilə verəcək. Sonra ultrasəslə işləmə avtomatik olaraq yenidən başlayır. Bu ağıllı funksiya istilikdən qaynaqlanan deqradasiyanın qarşısını alır.
- VialTweeter bloku əvvəlcədən soyudula bilər. Titan bloku əvvəlcədən soyutmaq üçün VialTweeter blokunu (yalnız çeviricisiz sonotrodu!) soyuducuya və ya dondurucuya qoymaq nümunədə temperatur artımını gecikdirməyə kömək edir. Mümkünsə, nümunənin özü də əvvəlcədən soyudula bilər.
- Ultrasəslə işləmə zamanı soyutmaq üçün quru buzdan istifadə edin. Quru buzla doldurulmuş dayaz qabdan istifadə edin və istiliyin sürətlə yayılıb uzaqlaşması üçün VialTweeter qurğusunu quru buzun üzərinə yerləşdirin.
Lizis tətbiqiniz üçün optimal ultrasəs hüceyrə parçalayıcısını tapın
Hielscher Ultrasonics laboratoriyalar, masaüstü və sənaye miqyaslı sistemlər üçün yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs hüceyrə parçalayıcıları və homogenizatorlarının istehsalında uzunmüddətli təcrübəyə malikdir. Bakterial hüceyrə kulturunuzun ölçüsü, tədqiqat və ya istehsal məqsədiniz və saatda və ya gündə emal ediləcək hüceyrələrin həcmi tətbiqiniz üçün uyğun ultrasəs hüceyrə parçalayıcısının tapılmasında əsas amillərdir.
Hielscher Ultrasonics çoxsaylı nümunələrin (10 flakona qədər), eləcə də böyük sayda nümunələrin (yəni mikrotitr lövhələri / 96 quyulu lövhələr) eyni vaxtda ultrasəslə işlənməsi üçün müxtəlif həllər, 50–400 vatt arasında müxtəlif güc səviyyələrinə malik klassik zond tipli laboratoriya ultrasəs cihazından iri istehsalda kommersiya məqsədli hüceyrə parçalanması və zülal ekstraksiyası üçün hər qurğu üzrə 16,000vattadək gücə malik tam sənaye ultrasəs prosessorlarına qədər cihazlar təklif edir. Bütün Hielscher ultrasəs cihazları tam yük altında 24/7/365 işləmək üçün hazırlanmışdır. Möhkəmlik və etibarlılıq ultrasəs cihazlarımızın əsas xüsusiyyətləridir.
Bütün rəqəmsal ultrasəs homogenizatorları ağıllı proqram təminatı, rəngli toxunma ekranı və məlumatların avtomatik qeydə alınması ilə təchiz edilmişdir; bunlar ultrasəs cihazını laboratoriya və istehsal müəssisələrində rahat iş alətinə çevirir.
Bioloji nümunələrinizdə hansı növ hüceyrələri, hansı həcmdə, nə qədər tez-tez və hansı məqsədlə emal etməli olduğunuzu bizə bildirin. Proses tələbləriniz üçün ən uyğun ultrasəs hüceyrə parçalayıcısını tövsiyə edəcəyik.
Aşağıdakı cədvəl yığcam əl homogenizatorları və çoxnümunəli ultrasəs cihazlarından kommersiya tətbiqləri üçün sənaye ultrasəs prosessorlarına qədər ultrasəs sistemlərimizin təxmini emal gücü barədə məlumat verir:
| Partiya həcmi | Həcm axını sürəti | Tövsiyə olunan cihazlar |
|---|---|---|
| 96 quyulu / mikrotitr lövhələri | n.a. | UIP400MTP |
| Hər biri 0,5–1,5mL olan 10 flakon | n.a. | UP200St ilə VialTweeter |
| 0,01–250mL | 5–100mL/min | UP50H |
| 0,01–500mL | 10–200mL/min | UP100H |
| 10–2000mL | 20–400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1–20L | 0,2–4L/min | UIP2000hdT |
| 10–100L | 2–10L/min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10–100L/min | UIP16000 |
| n.a. | daha yüksək | qurğu klasteri: UIP16000 |
Bizimlə əlaqə saxlayın! / Bizə sual verin!
Ədəbiyyat / İstinadlar
- Chen J.-X; Cipriani P.G.; Mecenas D.; Polanowska J.; Piano F.; Gunsalus K.C.; Selbach M. (2016): In Vivo Interaction Proteomics in Caenorhabditis elegans Embryos Provides New Insights into P Granule Dynamics. Molecular & Cellular Proteomics 15.5; 2016. 1642-1657.
- Jonathan Alcántar-Fernández, Rosa E. Navarro, Ana María Salazar-Martínez, Martha Elva Pérez-Andrade, Juan Miranda-Ríos (2018): Caenorhabditis elegans respond to high-glucose diets through a network of stress-responsive transcription factors. PLoS One 13(7); 2018.
- Segref, A.; Cabello, J.; Clucas, C.; Schnabel, R.; Johnstone I.L. (2010): Fate Specification and Tissue-specific Cell Cycle Control of the Caenorhabditis elegans Intestine. Molecular Biology of the Cell Vol. 21, 2010. 725–738.
- Henderson S.T., Bonafe M., Johnson T.E. (2006): daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2006; 61:444–60.
Bilməyə dəyər faktlar
Caenorhabditis elegans
C. elegans təxminən 1 mm uzunluğunda, bakteriyalarla (məsələn, E. coli) qidalanan və nisbətən qısa həyat dövrünə malik sərbəst yaşayan şəffaf nematoddur (yumru qurd). 20 °C temperaturda C. elegans laboratoriya ştammının (N2) orta ömür uzunluğu təxminən 2–3 həftə, nəsil müddəti isə 3–4 gündür. C. elegans çox sayda yetişdirildikdə, bu isə dəqiq nəzarət olunan laboratoriya şəraitində asanlıqla həyata keçirilə bilər, yeni dərmanların təsir prinsipini, həmçinin onların insan xəstəliklərindəki mürəkkəb molekulyar proseslər daxilində təsirlərini və qarşılıqlı əlaqələrini öyrənmək üçün asanlıqla skrininqdən keçirilə bilər. Qısa genom, qısa həyat dövrü və laboratoriya şəraitində onunla işləməyin asanlığı C. elegans növünü genomika, proteomika, inkişaf biologiyası, xəstəliklərin tədqiqi, dərman hazırlanması və s. kimi tədqiqatlar üçün ideal model orqanizm edir.
Caenorhabditis elegans qurdları ya erkək, ya da hermafrodit ola bilər. Hermafroditlər həm erkək, həm də dişi reproduktiv orqanlara malikdir. Bununla belə, dişi qurdlar mövcud deyil. Hermafroditlər ya öz-özünə mayalana, ya da erkək qurdlarla cütləşə bilər. C. elegans hər gün 1.000-dən çox yumurta əmələ gətirə bilər.
C. elegans sinir sisteminə malik ən sadə orqanizmlərdən biri olduğuna görə bu nematod qurdu 1963-cü ildən tədqiqatlar üçün model orqanizm kimi istifadə olunur. Neyronlar fəaliyyət potensialları yaratmır və heç bir gərginliklə idarə olunan natrium kanalı ekspressiya etmir. Hermafroditdə bu sistem 302 neyrondan ibarətdir; onların əlaqə sxemi konnektom adlanan xəritədə hərtərəfli təsvir edilmişdir.
C. elegans genomundakı bir çox genin insanlarda funksional qarşılığı vardır; bu, onu insan xəstəlikləri üçün son dərəcə faydalı model edir və o, məsələn, inkişaf biologiyasını, qocalmanı və uzunömürlülüyə təsir edən amilləri öyrənmək üçün istifadə olunur. Bundan əlavə, C. elegans mutantları nevroloji pozuntular (məsələn, Alzheimer xəstəliyi), anadangəlmə ürək xəstəliyi və böyrək xəstəliyi daxil olmaqla bir çox insan xəstəliyi üçün modellər təqdim edir.
Bu amillər C. elegans növünü bir çox tədqiqat sahəsi üçün olduqca dəyərli model etmişdir. Nəticədə C. elegans bütün genomunun ardıcıllığı müəyyən edilmiş ilk çoxhüceyrəli orqanizm olmuşdur. Genomda təxminən 20.470 zülal kodlayan gen vardır. C. elegans genlərinin təxminən 35%-nin insan homoloqları vardır. Diqqətəlayiqdir ki, insan genlərinin C. elegans orqanizminə daxil edildikdə öz C. elegans homoloqlarını əvəz etdiyi dəfələrlə göstərilmişdir. Əksinə, bir çox C. elegans geni məməli genlərinə bənzər şəkildə fəaliyyət göstərə bilər.
C. elegans növünün ömür uzunluğu təxminən 3 həftədir və altı həyat mərhələsindən ibarətdir: embriogenez (yumurta mərhələsi), dörd sürfə mərhələsi (L1–L4) və yetkin mərhələ. Nematodlar yumurtalardan 560 hüceyrədən ibarət L1 sürfələri kimi çıxır. Hər sürfə mərhələsində böyümə hüceyrə bölünməsi və hüceyrə hipertrofiyası ilə baş verir. Hər sürfə mərhələsində kutikula dəyişir. Sərt ətraf mühit şəraiti inkişaf edən qurda şəraitin yetkin fərdin məhsuldarlığını dəstəkləməsinin az ehtimallı olduğunu bildirərsə, C. elegans inkişafını dəyişdirə və sürfələrin dauer mərhələsinə keçdiyi alternativ L3 sürfə mərhələsi yarada bilər. Bu vəziyyətdə heyvanlar fövqəladə dərəcədə stresə davamlı və uzunömürlü olur, üç–doqquz ay sağ qala bilər. Dauer sürfələri həm ağız, həm də anal boşluqlarını bağlamaqla, bağırsaqlarını kiçiltməklə və digər nəticələrlə yanaşı dauer mərhələsinə xas kutikulanın ekspressiyasına gətirən daf-16/FOXO-dan asılı genetik proqramı aktivləşdirməklə əlverişsiz şəraitdən özlərini təcrid edir. (cf. Henderson et al., 2006)
C. elegans dauer sürfələri
Dauer sürfələri alternativ inkişaf mərhələsinə keçmiş nematod sürfələrini bildirən termindir. “Dauer sürfələri” termini xüsusilə Caenorhabditis elegans daxil olmaqla rabditidlər fəsiləsinin qurdları üçün istifadə olunur. “Dauer” sözü alman mənşəlidir və “zaman intervalı” mənasında “müddət” deməkdir. Dauer sürfələri bir növ staz vəziyyətinə keçir və sərt şəraitdə sağ qala bilər. Sürfənin dauer mərhələsinə keçib-keçməməsi və nə vaxt keçməsi ətraf mühit şəraitindən asılıdır. Dauer sürfələri sərt mühitlərdə sağ qalmaq və uzun müddət yaşamaq üçün fövqəladə qabiliyyət göstərdiyinə görə biologiyada geniş öyrənilir. Məsələn, C. elegans dauer sürfələri dörd aya qədər sağ qala bilər; bu, normal reproduktiv inkişaf zamanı onların təxminən üç həftəlik orta ömür uzunluğundan xeyli çoxdur.
C. elegans həyat dövrünə ümumi baxış
Əlverişli mühitlərdə C. elegans inkişafı:
Caenorhabditis elegans (C. elegans) əlverişli və əlverişsiz ətraf mühit şəraitində fərqli inkişaf gedişi göstərir.
C. elegans növünün əlverişli şəraitə reaksiyası:
Əlverişli şəraitdə mikroskopik yumru qurd Caenorhabditis elegans (C. elegans) aydın müəyyən edilmiş inkişaf yolu izləyir. Ətraf mühit şəraiti optimal olduqda, adətən 15°C–20°C temperaturlarda, nematod həyat dövrünü adətən kifayət qədər sürətlə keçir.
- Reproduktiv inkişaf: C. elegans həyat dövrünə embrion kimi başlayır. Daha sonra L1–L4 kimi qısaldılan dörd fərqli sürfə mərhələsindən keçir.
- Yetkin mərhələ: Dörd sürfə mərhələsini tamamladıqdan sonra C. elegans cəmi 3–5 günə yetkin mərhələyə çatır. Bu mərhələdə onlar çoxalma qabiliyyətinə malik olur və ətraf mühit amillərindən asılı olaraq daha 2–3 həftə yaşamağa davam edir.
C. elegans növünün əlverişsiz şəraitə reaksiyası:
Bununla belə, C. elegans davamlı orqanizmdir və dauer əmələgəlməsi adlanan proses vasitəsilə əlverişsiz şəraitə uyğunlaşa bilər.
- Dauer əmələgəlməsi: Ətraf mühit şəraiti həddindən artıq sıxlıq, məhdud qida təminatı və ya yüksək temperatur kimi səbəblərlə əlverişsiz olduqda, C. elegans “dauer” adlanan və L3d kimi qısaldılan qeyri-adi üçüncü sürfə mərhələsinə keçə bilər.
- Dauer mərhələsində sağqalma: Dauer sürfələri sərt şəraitdə sağ qalmağa xüsusi uyğunlaşmışdır. Enerjiyə qənaət edərək və çətin mühitlərə tab gətirərək bu mərhələdə bir neçə ay yaşaya bilər.
Əlverişli mühitlərdə bərpa:
C. elegans növünün diqqətəlayiq cəhəti şərait yaxşılaşdıqda normal həyat dövrünə qayıtmaq qabiliyyətidir.
- Əlverişli şəraitə qayıdış: C. elegans dauer sürfələri bol qida, daha aşağı populyasiya sıxlığı və uyğun temperatur kimi əlverişli şəraitlə yenidən qarşılaşdıqda, mühitdəki dəyişikliyi hiss edir.
- Bərpa və çoxalma: Bu yaxşılaşmış şəraitə cavab olaraq dauer sürfələri “bərpa” adlanan prosesdən keçir. Bərpa zamanı onlar sürfə mərhələlərinə qayıdır və nəticədə normal ömür uzunluğuna malik, çoxala bilən yetkin fərdlərə çevrilir.
Ətraf mühit şəraitinə cavab olaraq inkişaf mərhələləri arasında keçid etmək qabiliyyəti C. elegans biologiyasının xüsusi cəhətidir. Bu, onların geniş şərait diapazonunda səmərəli şəkildə sağ qalmasına və çoxalmasına imkan verir, onları elmi tədqiqatlar, xüsusilə inkişaf, genetika və qocalmanın öyrənilməsi üçün dəyərli model orqanizm edir.

