BL21 hüceyrələrinin ultrasəslə lizisi

BL21 hüceyrələri zülalları yüksək səmərəliliklə ekspressiya etmək qabiliyyətinə görə tədqiqat laboratoriyalarında, biotexnologiyada və sənaye istehsalında geniş istifadə olunan E. coli ştamıdır. Hüceyrələrin ultrasəslə parçalanması, lizisi və zülalların ekstraksiyası hədəf zülalları BL21 hüceyrələrinin daxilindən ayırmaq və toplamaq üçün geniş yayılmış üsuldur. Ultrasəs hüceyrəni tamamilə parçalayır və daxilində qalmış bütün zülalları sərbəst buraxaraq zülalın 100%-ni əlçatan edir.

Zülal ekspressiyası üçün BL21 hüceyrələri

BL21 hüceyrəsi T7 RNT polimeraza-IPTG induksiya sistemi vasitəsilə transformasiya və yüksək səviyyəli zülal ekspressiyası üçün uyğun olan, kimyəvi üsulla kompetentləşdirilmiş E. coli bakteriya ştamıdır. BL21 hüceyrələri T7 promotorunun nəzarəti altında olan istənilən genin yüksək səmərəliliklə zülal ekspressiyasına imkan verir. E. coli BL21(DE3) ştamı T7 RNT polimeraza əsaslı zülal istehsalı ştamıdır, T7 promotoru əsaslı ekspressiya vektorları ilə birlikdə istifadə olunur və rekombinant zülalların istehsalı üçün laboratoriyalarda və sənayedə geniş tətbiq edilir. BL21(DE3)-də rekombinant zülalı kodlaşdıran genin ekspressiyası xromosomda kodlaşdırılan T7 RNT polimeraza (T7 RNAP) tərəfindən transkripsiya olunur; bu ferment adi E. coli RNAP-dan səkkiz dəfə daha sürətlə transkripsiya edir. Bu, BL21(DE3) ştamını yüksək səmərəli edir və onu zülal ekspressiyası üçün ən çox üstünlük verilən hüceyrə sistemlərindən birinə çevirir.

BL21 hüceyrələrinin ultrasəslə lizisi və onlardan zülal ekstraksiyası üçün protokol

BL21 hüceyrələrinin lizisi əsasən lizis buferi kimi natrium lauroil sarkozinatla (sarkosil kimi də tanınır) birlikdə ultrasəsdən istifadə etməklə həyata keçirilir. Hüceyrələrin ultrasəslə parçalanmasının və zülal ekstraksiyasının üstünlükləri etibarlılıq, təkrarlana bilmə, eləcə də ultrasəs cihazlarının sadə, təhlükəsiz və sürətli işləməsidir. Aşağıdakı protokol BL21 hüceyrələrinin ultrasəslə lizisi üçün addım-addım təlimat verir:

• Şaperon zülallarını kənarlaşdırmaq üçün BL21 bakteriya çöküntüləri 50 ml buz kimi soyuq natrium Tris-EDTA (STE) buferində yenidən suspenziyalaşdırıldı (buferin tərkibi: 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl və əlavə edilmiş 100 mM PMSF).
• Sonra 500 ul lizozim (10 mg/ ml) əlavə edilir və hüceyrələr buz üzərində 15 min inkubasiya olunur.
• Daha sonra 500 ul DTT və 7 ml sarkosil (STE buferində hazırlanmış 10% (w/v)) əlavə edilir.
• Bütün təmizləmə buferlərini buz kimi soyuq saxlamaq və nümunələri daim buz üzərində saxlamaq vacibdir. Mümkünsə, bütün təmizləmə mərhələləri soyuq otaqda aparılmalıdır.



• Ultrasəslə lizis və zülal ekstraksiyası üçün nümunələr VialTweeter MultiSample Ultrasonicator cihazında 100% amplitudada 4 x 30 sec ərzində, hər ultrasəs emalı arasında 2 min fasilə ilə emal edilir. Alternativ olaraq, mikroucluqlu zond tipli ultrasəs homogenizatorundan, məsələn, UP200Ht cihazından S26d2 ilə (3 x 30 sec, ultrasəs dövrləri arasında 2 min. fasilə, 80% amplituda) istifadə edilə bilər.
• Sonrakı təmizləmə mərhələləri üçün nümunələr buz üzərində saxlanılmalı və ya alternativ olaraq növbəti emala qədər -80°C-də saxlanılmalıdır.

Dəqiq temperatur nəzarəti altında ultrasəslə lizis

Bioloji nümunələrlə işləyərkən dəqiq və etibarlı temperatur nəzarəti həlledici əhəmiyyət daşıyır. Yüksək temperatur nümunələrdə istiliyin təsiri ilə zülalların deqradasiyasını başladır.
Bütün mexaniki nümunə hazırlama üsulları kimi, ultrasəslə emal da istilik yaradır. Bununla belə, VialTweeter istifadə edilərkən nümunələrin temperaturuna yaxşı nəzarət etmək mümkündür. Nümunələrinizi VialTweeter və VialPress ilə analiz üçün hazırlayarkən onların temperaturunu izləmək və tənzimləmək üçün sizə müxtəlif variantlar təqdim edirik.

1. Nümunənin temperaturunun izlənməsi: VialTweeter cihazını işlədən UP200St ultrasəs prosessoru ağıllı proqram təminatı və qoşula bilən temperatur sensoru ilə təchiz edilmişdir. Temperatur sensorunu UP200St cihazına qoşun və temperatur sensorunun ucunu nümunə sınaq borularından birinə daxil edin. Rəngli rəqəmsal sensor ekran vasitəsilə UP200St cihazının menyusunda nümunənizin ultrasəslə emalı üçün müəyyən temperatur aralığı təyin edə bilərsiniz. Maksimum temperatura çatdıqda ultrasəs cihazı avtomatik dayanacaq və nümunənin temperaturu təyin edilmiş temperatur ∆-nın aşağı qiymətinə enənədək fasilə verəcək. Sonra ultrasəslə emal yenidən avtomatik başlayır. Bu ağıllı funksiya istiliyin səbəb olduğu deqradasiyanın qarşısını alır.
2. VialTweeter bloku əvvəlcədən soyudula bilər. Titan bloku əvvəlcədən soyutmaq üçün VialTweeter blokunu (yalnız çevirici olmadan sonotrodu!) soyuducuya və ya dondurucuya qoymaq nümunədə temperatur artımını gecikdirməyə kömək edir. Mümkünsə, nümunənin özü də əvvəlcədən soyudula bilər.
3. Ultrasəslə emal zamanı soyutmaq üçün quru buzdan istifadə edin. Quru buzla doldurulmuş dayaz qabdan istifadə edin və istiliyin sürətlə yayılıb uzaqlaşması üçün VialTweeter cihazını buzun üzərinə yerləşdirin.

Dünyanın hər yerində müştərilər bioloji, biokimyəvi, tibbi və klinik laboratoriyalarda gündəlik nümunə hazırlama işləri üçün VialTweeter və VialPress istifadə edirlər. UP200St prosessorunun ağıllı proqram təminatı və temperatur nəzarəti vasitəsilə temperatur etibarlı şəkildə tənzimlənir və nümunələrin istiliyin təsiri ilə deqradasiyasının qarşısı alınır. VialTweeter və VialPress ilə ultrasəslə nümunə hazırlanması yüksək dərəcədə etibarlı və təkrarlana bilən nəticələr verir!
 

Lizis tətbiqiniz üçün optimal ultrasəs parçalayıcısını tapın

Hielscher Ultrasonics laboratoriyalar, masaüstü və sənaye miqyaslı sistemlər üçün yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs hüceyrə parçalayıcıları və homogenizatorlarının istehsalında uzunmüddətli təcrübəyə malikdir. Bakteriya hüceyrə kulturanızın ölçüsü, tədqiqat və ya istehsal məqsədiniz və saatda və ya gündə emal ediləcək hüceyrələrin həcmi tətbiqiniz üçün düzgün ultrasəs hüceyrə parçalayıcısını seçməkdə əsas amillərdir.
Hielscher Ultrasonics çoxsaylı nümunələrin (VialTweeter ilə 10 flakona qədər) və kütləvi nümunələrin (yəni UIP400MTP ilə mikrotitr lövhələrinin / ELISA lövhələrinin) eyni vaxtda ultrasəslə emalı üçün müxtəlif həllər, həmçinin 50 ilə 400 vatt arasında müxtəlif güc səviyyələrinə malik klassik zond tipli laboratoriya ultrasəs cihazlarından tutmuş, iri istehsalda kommersiya məqsədli hüceyrə parçalanması və zülal ekstraksiyası üçün hər qurğuda 16,000vatta qədər gücə malik tam sənaye ultrasəs prosessorlarına qədər cihazlar təklif edir. Bütün Hielscher ultrasəs cihazları tam yük altında 24/7/365 işləmək üçün hazırlanmışdır. Möhkəmlik və etibarlılıq ultrasəs cihazlarımızın əsas xüsusiyyətləridir.
Bütün rəqəmsal ultrasəs homogenizatorları ağıllı proqram təminatı, rəngli sensor ekran və məlumatların avtomatik qeydə alınması sistemi ilə təchiz edilmişdir; bunlar ultrasəs cihazını laboratoriya və istehsal müəssisələrində rahat iş alətinə çevirir.
Bioloji nümunələrinizdə hansı növ hüceyrələri, hansı həcmdə, hansı tezliklə və hansı məqsədlə emal etməli olduğunuzu bizə bildirin. Proses tələblərinizə ən uyğun ultrasəs hüceyrə parçalayıcısını sizə tövsiyə edəcəyik.

Aşağıdakı cədvəl kompakt əl homogenizatorlarından və çoxnümunəli ultrasəs cihazlarından tutmuş kommersiya tətbiqləri üçün sənaye ultrasəs prosessorlarına qədər ultrasəs sistemlərimizin təxmini emal gücü barədə təsəvvür yaradır:

Ədəbiyyat / İstinadlar

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.