Ultrasonikasiya ilə BL21 Hüceyrələrinin Hüceyrə Lizisi
BL21 hüceyrələri zülalları yüksək effektiv şəkildə ifadə etmək qabiliyyətinə görə tədqiqat laboratoriyalarında, biotexnologiyada və sənaye istehsalında geniş istifadə olunan E. coli ştammıdır. Ultrasonik hüceyrənin pozulması, lizisi və zülal çıxarılması BL21 hüceyrələrinin hüceyrə daxili hissəsindən hədəflənmiş zülalları təcrid etmək və toplamaq üçün ümumi üsuldur. Ultrasonikasiya hüceyrəni tamamilə pozur və bütün sıxılmış zülalları azad edir, zülalın 100%-ni əlçatan edir.
Protein ifadəsi üçün BL21 Hüceyrələri
BL21 hüceyrəsi T7 RNT polimeraza-IPTG induksiya sistemindən istifadə edərək transformasiya və yüksək səviyyəli zülal ifadəsi üçün uyğun olan kimyəvi cəhətdən bacarıqlı E. coli bakteriya ştamıdır. BL21 hüceyrələri T7 promotorunun nəzarəti altında olan istənilən genin yüksək effektiv protein ifadəsinə imkan verir. E. coli ştammı BL21(DE3) T7 promotor əsaslı ifadə vektorları ilə birləşmiş T7 RNT polimeraza əsaslı zülal istehsal ştamıdır və rekombinant zülalların istehsalı üçün laboratoriyalarda və sənayedə geniş şəkildə tətbiq edilir. BL21(DE3)-də rekombinant zülalı kodlayan genin ifadəsi adi E.coli RNAP-dan səkkiz dəfə daha sürətli transkripsiya edən xromosomla kodlanmış T7 RNT polimeraza (T7 RNAP) tərəfindən transkripsiya edilir. Bu, BL21(DE3) ştamını yüksək effektiv edir və onu ən çox seçilən protein ifadə hüceyrə sistemlərindən birinə çevirir.
BL21 Hüceyrələrindən Ultrasonik Lizis və Zülal Ekstraksiyasına dair Protokol
BL21 hüceyrələrinin hüceyrə lizisi əsasən liziz tamponu kimi natrium lauroil sarkosinat (həmçinin sarkosil kimi tanınır) ilə birlikdə ultrasəsdən istifadə etməklə həyata keçirilir. Ultrasəs hüceyrəsinin pozulmasının və zülal çıxarılmasının üstünlükləri ultrasəs aparatlarının etibarlılığı, təkrar istehsalı, eləcə də sadə, təhlükəsiz və sürətli işləməsindədir. Aşağıdakı protokol ultrasəs BL21 hüceyrə lizisi üçün addım-addım istiqamət verir:
- Şaperon zülallarını çıxarmaq üçün BL21 bakteriya qranulları 50 ml buz soyuducu Natrium Tris-EDTA (STE) tamponunda (10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl100m ilə əlavə edilmiş) yenidən dayandırıldı. PMSF).
- 500 ul lizozim (10 mq/ml) əlavə edilir və hüceyrələr buz üzərində 15 dəqiqə inkubasiya edilir.
- Daha sonra 500 ul DTT və 7 ml sarkosil (STE tamponunda təşkil olunmuş 10% (ağırlıq/həc)) əlavə edilir.
- Bütün təmizləyici buferləri buz kimi soyuq saxlamaq və nümunələri hər zaman buzda saxlamaq vacibdir. Mümkünsə, bütün təmizləmə addımları soyuq otaqda aparılmalıdır.
- Ultrasəs lizis və zülal çıxarılması üçün nümunələr sonikasiya olunur VialTweeter MultiSample Ultrasonikator hər sonication arasında 2 dəqiqə interval ilə 100% amplituda 4 x 30 saniyə üçün. Alternativ olaraq, mikro ucu olan zond tipli ultrasəs homojenizatoru, məsələn, UP200Ht S26d2 ilə (3 x 30 san, ultrasəs dövrləri arasında 2 dəqiqə fasilə, 80% amplituda) istifadə edilə bilər.
- Əlavə təmizləmə mərhələləri üçün nümunələr buz üzərində saxlanmalı və ya alternativ olaraq sonrakı emal olunana qədər -80°C-də saxlanmalıdır.

Ultrasonik hüceyrə pozucusu UP200St liziz və zülal çıxarılması üçün mikro-ucu S26d2 ilə
Dəqiq Temperatur Nəzarəti altında Ultrasonik Lizis
Bioloji nümunələrlə işləyərkən dəqiq və etibarlı temperatur nəzarəti çox vacibdir. Yüksək temperatur nümunələrdə termal səbəb olan zülal deqradasiyasına səbəb olur.
Bütün mexaniki nümunə hazırlama üsulları kimi, sonication istilik yaradır. Bununla belə, VialTweeter istifadə edərkən nümunələrin temperaturu yaxşı idarə oluna bilər. Biz sizə nümunələrinizi VialTweeter və VialPress ilə analiz üçün hazırlayarkən onların temperaturuna nəzarət etmək və nəzarət etmək üçün müxtəlif variantları təqdim edirik.
- Nümunə temperaturunun monitorinqi: VialTweeter-i idarə edən ultrasəs prosessoru UP200St, ağıllı proqram təminatı və qoşula bilən temperatur sensoru ilə təchiz edilmişdir. Temperatur sensorunu UP200St-ə qoşun və temperatur sensorunun ucunu nümunə borularından birinə daxil edin. Rəqəmsal rəngli toxunma displey vasitəsilə siz UP200St menyusunda nümunə sonikasiya üçün xüsusi temperatur diapazonunu təyin edə bilərsiniz. Maksimum temperatura çatdıqda ultrasəs cihazı avtomatik olaraq dayanacaq və nümunənin temperaturu təyin edilmiş temperaturun ∆ aşağı dəyərinə enənə qədər fasilə verəcəkdir. Sonra sonikasiya avtomatik olaraq yenidən başlayır. Bu ağıllı xüsusiyyət istidən qaynaqlanan deqradasiyanın qarşısını alır.
- VialTweeter bloku əvvəlcədən soyudula bilər. Titan blokunu əvvəlcədən soyutmaq üçün VialTweeter blokunu (yalnız çeviricisiz sonotrode!) soyuducuya və ya dondurucuya qoyun, nümunədə temperaturun yüksəlməsini təxirə salmağa kömək edir. Mümkünsə, nümunənin özü də əvvəlcədən soyudula bilər.
- Sonikasiya zamanı sərinləmək üçün quru buzdan istifadə edin. Quru buzla doldurulmuş dayaz nimçədən istifadə edin və VialTweeter-i buzun üzərinə qoyun ki, istilik sürətlə dağılsın.
Bütün dünyada müştərilər bioloji, biokimyəvi, tibbi və kliniki laboratoriyalarda gündəlik nümunə hazırlama işləri üçün VialTweeter və VialPress-dən istifadə edirlər. UP200St prosessorunun ağıllı proqram təminatı və temperatur nəzarəti, temperatur etibarlı şəkildə idarə olunur və istiliyin səbəb olduğu nümunənin deqradasiyasının qarşısı alınır. VialTweeter və VialPress ilə ultrasəs nümunəsinin hazırlanması yüksək etibarlı və təkrarlana bilən nəticələr verir!
Lizis Tətbiqiniz üçün Optimal Ultrasonik Disruptor tapın
Hielscher Ultrasonics, laboratoriyalar, tezgah üstü və sənaye miqyaslı sistemlər üçün yüksək performanslı ultrasəs hüceyrə pozucuları və homogenizatorların uzun müddətdir təcrübəli istehsalçısıdır. Bakterial hüceyrə mədəniyyətinin ölçüsü, tədqiqat və ya istehsal məqsədiniz və saatda və ya gündə emal ediləcək hüceyrənin həcmi tətbiqiniz üçün düzgün ultrasəs hüceyrə pozucusunu tapmaq üçün vacib amillərdir.
Hielscher Ultrasonics çoxlu nümunələrin (VialTweeter ilə 10 flakona qədər) və kütləvi nümunələrin (yəni, UIP400MTP ilə mikrotitr plitələr / ELISA plitələri) eyni vaxtda sonikasiyası üçün müxtəlif həllər təklif edir, həmçinin klassik zond tipli laboratoriya ultrasəs cihazının müxtəlif 50 ilə 400 vatt arasında güc səviyyələri, böyük istehsalda kommersiya hüceyrəsinin pozulması və zülal çıxarılması üçün vahid başına 16,000 vata qədər tam sənaye ultrasəs prosessorlarına. Bütün Hielscher ultrasəs cihazları tam yük altında 24/7/365 əməliyyatı üçün qurulmuşdur. Sağlamlıq və etibarlılıq ultrasəs cihazlarımızın əsas xüsusiyyətləridir.
Bütün rəqəmsal ultrasəs homojenizatorları ağıllı proqram təminatı, rəngli sensor displey və məlumatların avtomatik protokollaşdırılması ilə təchiz olunub ki, bu da ultrasəs cihazı laboratoriya və istehsalat obyektlərində rahat iş alətinə çevirir.
Bioloji nümunələrinizi hansı hüceyrələrə, hansı həcmdə, hansı tezlikdə və hansı hədəflə emal etməli olduğunuzu bizə bildirin. Proses tələbləriniz üçün sizə ən uyğun ultrasəs hüceyrə pozucusunu tövsiyə edəcəyik.
Aşağıdakı cədvəl sizə ultrasəs sistemlərimizin kompakt əl homogenizatorlarından və MultiSample Ultrasonikatorlardan kommersiya tətbiqləri üçün sənaye ultrasəs prosessorlarına qədər təxmini emal qabiliyyətinin göstəricisini verir:
Partiya Həcmi | Axın | Tövsiyə olunan Cihazlar |
---|---|---|
96 quyu / mikrotitr plitələr | na | UIP400MTP |
0,5-1,5 mL olan 10 flakon | na | UP200St-də VialTweeter |
0.01 - 250 ml | 5 ilə 100 ml/dəq | UP50H |
0.01 - 500 ml | 10-200 ml/dəq | UP100H |
10 ilə 2000 ml | 20 - 400 ml/dəq | UP200Ht, UP400St |
0.1 - 20L | 0.2 ilə 4L/dəq | UIP2000hdT |
10-100 l | 2 ilə 10 L / dəq | UIP4000hdT |
na | 10-100 l/dəq | UIP16000 |
na | daha böyük | klaster UIP16000 |
Bizimlə əlaqə saxlayın! / Bizdən soruşun!

UIP400MTP nömrəli sonikator 96 quyu plitələrində yüksək məhsuldarlıqlı hüceyrənin pozulması üçün

ultrasəs aparatı UP200Ht kiçik nümunələrin sonikasiyası üçün 2 mm mikrotip S26d2 ilə
Bufer məhlullarının səmərəli və etibarlı hazırlanması üçün ultrasəs toxuma homogenizatorundan necə istifadə edə biləcəyiniz haqqında ətraflı oxuyun!
Bilməyə Dəyər Faktlar
Escherichia Coli bakteriyaları
Escherichia coli bakteriya növüdür, spor əmələ gətirməyən, qram-mənfidir və düz çubuq forması ilə xarakterizə olunur. E.coli bakteriyaları ətraf mühitdə, qidalarda, insan və heyvanların bağırsaqlarında mövcuddur. E. coli adətən peritrikoz flagella istifadə edərək hərəkətlidir, lakin hərəkətsiz növlər də var. E.coli fakultativ anaerob kimyoorqanotrof orqanizmlər adlanır, yəni onlar həm tənəffüs, həm də fermentativ maddələr mübadiləsinə qadirdirlər. Əksər E.coli növləri xoş xasiyyətlidir və orqanizmdə faydalı funksiyaları yerinə yetirir, məsələn, zərərli bakteriya növlərinin böyüməsini boğmaq, vitaminləri sintez etmək və s.
B tipli Escherichia coli bakteriya hüceyrəsi bakteriofaqların həssaslığı və ya məhdudlaşdırma-modifikasiya sistemləri kimi mexanizmləri araşdırmaq üçün tədqiqatlarda geniş istifadə olunan E.coli ştammlarının xüsusi kateqoriyasıdır. Bundan əlavə, E.coli bakteriyaları biotexnologiya və həyat elmi laboratoriyalarında zülal ifadəsi üçün etibarlı işçi qüvvə kimi qiymətləndirilir. Məsələn, E.coli sənaye miqyasında zülallar və oliqosakaridlər kimi birləşmələri sintez etmək üçün istifadə olunur. Proteaz çatışmazlığı, yüksək səviyyədə qlükoza səviyyəsində aşağı asetat istehsalı və gücləndirilmiş keçiricilik kimi spesifik xüsusiyyətlərə görə, E. coli B hüceyrələri genetik olaraq dəyişdirilmiş zülalların istehsalı üçün ən çox istifadə edilən ana hüceyrələrdir.
Rekombinant zülal
Rekombinant zülallar (rProt) müxtəlif sahələrdə, o cümlədən kimya istehsalı, əczaçılıq, kosmetika, insan və heyvan təbabəti, kənd təsərrüfatı, qida, eləcə də tullantıların emalı sənayesində mühüm əhəmiyyət kəsb edir.
Rekombinant zülalın istehsalı bir ifadə sisteminin istifadəsini tələb edir. Rekombinant DNT istehsalı üçün hüceyrə sistemlərini ifadə edən kimi, həm prokaryotik, həm də eukaryotik hüceyrələrdən istifadə edilə bilər. Bakteriya hüceyrəsi aşağı qiymət, asan miqyaslılıq və sadə mühit şəraiti kimi faktorlara görə zülal ifadəsi üçün ən çox istifadə edilsə də, məməli, maya, yosun, həşərat və hüceyrəsiz sistemlər qurulmuş alternativlərdir. Zülalın növü, funksional fəaliyyəti, həmçinin ifadə olunan zülalın tələb olunan məhsulu protein ifadəsi üçün istifadə olunan hüceyrə sisteminin seçilməsinə təsir göstərir.
Rekombinant proteini ifadə etmək üçün xüsusi hüceyrə rekombinant DNT şablonunu ehtiva edən DNT vektoru ilə transfeksiya edilməlidir. Şablonla transfeksiya edilmiş hüceyrələr daha sonra becərilir. Hüceyrə mexanizminin nəticəsi olaraq, hüceyrələr maraq doğuran zülalı transkripsiya edir və tərcümə edir və bununla da hədəf zülal istehsal edir.
İfadə edilmiş zülallar hüceyrə matrisində tutulduğundan, zülalları sərbəst buraxmaq üçün hüceyrə parçalanmalı (parçalanmalı və parçalanmalı). Sonrakı təmizlənmə mərhələsində zülal ayrılır və təmizlənir.
Müalicədə istifadə edilən ilk rekombinant zülal 1982-ci ildə rekombinant insan insulini olmuşdur. Bu gün dünyada tibbi müalicə üçün 170-dən çox növ rekombinant zülal istehsal olunur. Tibbdə geniş istifadə edilən rekombinant zülallar, məsələn, rekombinant hormonlar, interferonlar, interleykinlər, böyümə faktorları, şiş nekrozu faktorları, qan laxtalanma faktorları, trombolitik dərmanlar və diabet, cırtdanlıq, miokard infarktı, konjestif ürək çatışmazlığı kimi əsas xəstəliklərin müalicəsi üçün fermentlər, serebral apopleksiya, dağınıq skleroz, neytropeniya, trombositopeniya, anemiya, hepatit, romatoid artrit, astma, Crohn xəstəliyi və xərçəng müalicəsi. (bax. Phuc V. Pham, Omics Technologies və Bio-Engineering, 2018)
Ədəbiyyat / İstinadlar
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.

VialTweeter sonikatoru 10 nümunənin eyni vaxtda sonikasiyası üçün, məsələn, BL21 hüceyrələrini pozmaq üçün