E. Coli ultrasəs lizisi

  • E. coli bakteriyaları mikrobiologiya və biotexnologiya ən çox istifadə bakteriyalar var.
  • Ultrasonik mobil pozucular E. coli lizisi üçün etibarlı və reproducible nəticələr verir.
  • Güclü hələ dəqiq nəzarət çuxurluq və kəsmək qüvvələri tam pozulması və yüksək hasilatı verir (məsələn zülallar, DNT) ilə nəticələnəcək.

Niyə E. coli-nin Ultrasəs Hüceyrəsinin pozulmasına üstünlük verilən üsuldur?

Ultrasəs homojenizatorları və ya zond tipli ultrasəs cihazları E. coli lizisi üçün bir sıra üstünlüklər təklif edir, çünki intensiv ultrasəs hüceyrə divarlarını və membranlarını effektiv şəkildə pozur. Zond tipli ultrasəs cihazları aşağıdakı səbəblərə görə E. coli lizisi üçün geniş istifadə olunur:

  • Hüceyrə divarlarının effektiv şəkildə pozulması: E. coli peptidoqlikandan ibarət yarı sərt hüceyrə divarına malikdir və ənənəvi lizis üsullarından istifadə etməklə onu qırmaq çətin ola bilər. Zond tipli ultrasəs cihazı hüceyrələri əhatə edən mayedə kavitasiya qabarcıqları yaradan intensiv ultrasəs dalğaları yaradır. Bu baloncuklar çökdükdə yüksək sürətli maye reaktivləri və şok dalğaları əmələ gətirirlər ki, bu da hüceyrə divarlarının mexaniki pozulması ilə nəticələnir və biomolekullar kimi hüceyrə tərkibini effektiv şəkildə buraxır.
  • Təkmilləşdirilmiş nüfuz: Prob / sonotrode tərəfindən yaradılan ultrasəs dalğaları nümunənin dərinliyinə nüfuz edə bilər, daha çox sayda E. coli hüceyrələrinə çatır və onları bərabər şəkildə müalicə edir. Bu, lizisin nümunə boyu daha vahid olmasını təmin edir, nəticədə hüceyrənin pozulmasının səmərəliliyi yüksək olur.
  • Azaldılmış emal müddəti: Zond tipli ultrasəs cihazı tərəfindən verilən enerji yüksək konsentrasiyalı və lokallaşdırılmışdır, bu da hüceyrənin sürətli və səmərəli parçalanmasına səbəb olur. Muncuq döymə və ya enzimatik lizis kimi digər üsullarla müqayisədə, sonikasiya bir neçə dəqiqə və ya hətta saniyə ərzində E. coli lizisinə nail ola bilər. Dondurma-ərimə kimi bir çox alternativ texnika bir neçə raund müalicə tələb etsə də, ultrasəs lizis hüceyrələri bir proses addımında açır.
  • Temperatur nəzarət: Ən müasir ultrasəs cihazları temperatur sensorları və maksimum proses temperaturunu təyin etməyə imkan verən smart proqram təminatı ilə təchiz edilmişdir. Ultrasonikator temperatur həddinə çatdıqda avtomatik olaraq fasilə verir və müəyyən edilmiş temperatur nöqtəsinə çatdıqda sonikasiya prosesinə başlayır. Nümunələrin buz banyosunda soyudulması nümunənin temperaturunu aşağı saxlamaq və istidən qaynaqlanan nümunənin deqradasiyasının qarşısını almaq üçün sadə üsuldur.
  • Ölçeklenebilirlik: Zond tipli ultrasəs cihazları əl cihazlarından tutmuş iri miqyaslı sənaye modellərinə qədər müxtəlif ölçülərdə mövcuddur. Bu, onları laboratoriyada kiçik həcmdə emal etmək və ya daha böyük bioproses tətbiqləri, məsələn, peyvənd istehsalı və ya molekulların biosintezi üçün genişləndirmək üçün əlverişli edir.
  • Çox yönlülük: Ultrasonicators DNT kəsmə, zülal çıxarılması, toxuma homogenləşdirilməsi, nanohissəciklərin dispersiyası və emulsifikasiya kimi hüceyrə lizisi xaricində müxtəlif tətbiqlər üçün istifadə edilə bilər. Buna görə də, bir zond tipli ultrasəs cihazına investisiya etmək tədqiqat və ya sənaye parametrlərində çox yönlülük təmin edir.
  • UP200St kimi zond tipli ultrasəs cihazları etibarlı toxuma homojenizatorları və hüceyrə qırıcılarıdır, buna görə də genetikada nümunə hazırlamaq üçün geniş istifadə olunur, məsələn, E.coli lizisi üçün

    E.coli hüceyrələrindən zülal çıxarılması effektiv şəkildə həyata keçirilir ultrasəs zondu UP200St

    Prob tipli ultrasəs cihazı E. coli lizisi üçün bir çox üstünlüklər təklif edir. Ultrasəs proses parametrləri üzərində etibarlı və dəqiq nəzarət istənilən nəticələrə nail olmaq üçün güc, müddət və nümunə ilə işləmə kimi əməliyyat parametrlərini optimallaşdırmağa imkan verir.
     

    İnformasiya tələbi




    Bizimlə əlaqə saxlayın Gizlilik Siyasəti.


     

    Bu dərslik lizis, hüceyrənin pozulması, zülal izolyasiyası, laboratoriyalarda DNT və RNT fraqmentasiyası, analiz və tədqiqat kimi nümunə hazırlama tapşırıqlarınız üçün hansı tip sonikatorun ən yaxşı olduğunu izah edir. Tətbiqiniz, nümunə həcmi, nümunə sayı və ötürmə qabiliyyəti üçün ideal sonikator tipini seçin. Hielscher Ultrasonics sizin üçün ideal ultrasəs homojenizatoruna malikdir!

    Elm və təhlildə hüceyrənin pozulması və zülal çıxarılması üçün mükəmməl sonikatoru necə tapmaq olar

    Video Miniatür

    Ultrasonik DNT fraqmentasiyası tez-tez Yeni Nəsil Sıralamasında (NGS) nümunə hazırlama addımı kimi istifadə olunur.

    E. coli EDL933-ün genomik DNT-nin elektroforetik analizləri 0 – 15 dəqiqə ultrasəslənməyə məruz qalır. L DNT nərdivanını göstərir.
    (tədqiqat və şəkil: ©Basselet et al. 2008)

    Ultrasəs kavitasiyasından istifadə edərək hüceyrənin pozulması

    Ultrasonik prob tipli homogenizatorlar təqribən ilə işləyir. Saniyədə 20.000 dövrə (20kHz-də) və mayelərdə və ya süspansiyonlarda kavitasiyaya səbəb olur. Hüceyrələri parçalayan vakuuma bənzər təzyiqlərin və yüksək temperaturun akustik kavitasiya mikroskopik sahələri. Temperatur bir neçə min dərəcə Selsiyə çatsa da, kavitasiya həcmi o qədər kiçikdir ki, prosesi əhəmiyyətli dərəcədə qızdırmır. Ultrasəs nəticəsində yaranan akustik kavitasiya və kəsmə qüvvələri E.coli kimi bakteriya hüceyrələrinin hüceyrə membranını perforasiya edir və ya qırır. Hielscher ultrasonicators ultrasəs intensivliyi, amplituda, enerji girişi və temperatur kimi proses parametrləri üzərində dəqiq nəzarət etməyə imkan verir. Beləliklə, ultrasəs lizis prosesi hüceyrə növünə, hüceyrə mədəniyyətinə və prosesin məqsədinə optimal şəkildə düzəldilə bilər.
     

    Ultrasonik lizisi üstünlükləri

    • lizisi dəqiq nəzarət (intensivliyi, amplitude, temperatur)
    • etibarlı, təkrarlana bilən nəticələr
    • xüsusi nümunələri optimal uyğunlaşması
    • temperatur nəzarət
    • çox kiçik çox böyük nümunələri (litr μL)
    • Tamamilə mexaniki müalicə
    • istifadəçi dostu, təhlükəsiz əməliyyat
    • istehsal laboratoriya xətti miqyaslı-up
    Eyni proses şəraitdə 10 ampula eyni zamanda nümunələrinin hazırlanması üçün imkan verir ki, VialTweeter ultrasəs cihaz. (Böyütmək üçün)

    VialTweeter ultrasəs lizisi üçün

    İnformasiya tələbi




    Bizimlə əlaqə saxlayın Gizlilik Siyasəti.


    Ultrasəs Homogenizatoru Digər Lizis Texnikalarına qarşı

    Kimyəvi və enzimatik liziz problemli ola bilər – protein strukturları dəyişdirmək və təmizlənməsi problemləri və ferment lizisi təqdim edə bilər kimyəvi lizisi uzun inkubasiya dəfə tələb edir və reproducible deyil bəri – ultrasəs pozulması inkişaf etmiş bir, fast mobil pozulması metodudur.
    Ultrasəs lizis yalnız mexaniki qüvvələrə əsaslanır. Kimyəvi maddələr əlavə edilmir, sonikasiya kəsmə qüvvələri ilə hüceyrə divarını pozur. Kimyəvi lizis zülalın strukturunu dəyişdirə və təmizlənmə problemləri yarada bilər. Fermentlərin pozulması uzun inkubasiya müddəti tələb edir və təkrar istehsal olunmur. E.coli bakteriya hüceyrələrinin ultrasəs hüceyrələrinin pozulması sürətli, sadə, etibarlı və təkrarlana bilir. Buna görə də Hielscher ultrasəs cihazları bütün dünyada bioloji və biokimyəvi laboratoriyalarda nümunə hazırlamaq, analitikdən əvvəl, in-vitro diaqonistika və manifold analizləri üçün istifadə olunur.

    Ultrasonik Lizis üçün Ümumi Tövsiyələr

    Sonication mobil suspensions çox kiçik, orta və böyük miqdarda təsviri üçün ən məşhur texnika – 100L / saat qədər pico-litr (ultrasəs axını mobil istifadə edərək,). Cells maye kəsmək və kavitasiyasının tərəfindən lysed olunur. DNA də sonication zamanı qırxılmış, belə ki, mobil dayandırılması DNase əlavə etmək lazım deyil.
     

    Ultrasonik E.coli lizisi zamanı temperaturun idarə edilməsi
    Hüceyrənin pozulması və bitki birləşmələrinin çıxarılması üçün ultrasəs hüceyrə pozucusu UP100H (100W).nümunə pre-soyutma və buz üzərində sonication zamanı nümunə tutaraq, nümunə istilik deqradasiyası asanlıqla önlənə bilər nümunə.
    İdeal olaraq, liziz zamanı nümunələr buz kimi saxlanılmalıdır, lakin əksər nümunələr üçün temperaturun mədəniyyətin və ya toxuma mənbəyinin temperaturundan yuxarı qalxmaması kifayətdir. Buna görə də, suspenziyanı buz üzərində saxlamaq və 5-10 saniyəlik bir neçə qısa ultrasəs impulsları və 10-30 saniyəlik fasilələrlə sonikasiya etmək tövsiyə olunur. Fasilələr zamanı aşağı temperaturu bərpa etmək üçün istilik yayıla bilər. Daha böyük hüceyrə nümunələri üçün soyutma gödəkçələri olan müxtəlif axın hüceyrə reaktorları mövcuddur.
    Uğurlu ultrasəs lizis üçün ətraflı məsləhətləri və tövsiyələri burada oxuyun!

    E. Coli Lizatlarının Ultrasonik Hazırlanması üçün Protokollar

    Tədqiqatçılar E.coli hüceyrələrinin pozulması üçün Hielscher ultrasəs homogenizatorlarından istifadə edirlər. Aşağıda müxtəlif E. coli ilə əlaqəli tətbiqlər üçün Hielscher ultrasəs homogenizatorlarından istifadə edərək E.coli lizisi üçün müxtəlif sınaqdan keçirilmiş və sübut edilmiş protokolları tapa bilərsiniz.
     

    Bu video klipdə laboratoriyalarda nümunə hazırlamaq üçün geniş istifadə olunan ultrasəs cihazı olan Hielscher ultrasəs homogenizatoru UP100H göstərilir.

    Ultrasonik Homojenizator UP100H

    Video Miniatür

    Hüceyrələrin böyüməsi, çarpaz bağlanması və ultrasəsdən istifadə edərək E. coli hüceyrə ekstraktlarının hazırlanması

    SeqA və RNT polimeraza çip-Chip E. coli MG1655 ya MG1655 ΔseqA üçün OD 37 ° C artıb600 50 ml LB (+ 0.2% glyukoza) içərisində 0.15 mL-dən 27 ml'lik bir formaldehid (37%) ml orta maddəyə əlavə edildi (son konsantrasiya 1%). Çapraz bağlama 20 mq qədər otaq temperaturunda yavaş sarsıntıda (100 rpm), 10 ml 2.5 M glisinlə (son konsantrasyon 0.5 M) söndürmə ilə həyata keçirildi. İstilik şoku təcrübələri üçün, E. coli MG1655, 65 ml LB ortamında 30 ° C'de bir OD600 təxminən 0,3. Sonradan 30 ml mədəniyyət 43°C-də əvvəlcədən isidilmiş kolbaya köçürüldü, qalanı isə 30°C-də saxlanıldı. Çarpaz bağlama və söndürmə yuxarıda təsvir edildiyi kimi oldu, istisna olmaqla, hüceyrələr otaq temperaturunda daha yavaş silkələnmədən əvvəl 5 dəqiqə 30 və ya 43 ° C-də saxlanıldı. Hüceyrələr sentrifuqa ilə toplanmış və iki dəfə soyuq TBS (pH7.5) ilə yuyulmuşdur. 1 ml lizis buferində (10 mM Tris (pH 8.0), 20% saxaroza, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mq/ml lizozim) yenidən suspenziyadan və 30 dəqiqə ərzində 37°C-də inkubasiyadan sonra, ardınca 4 ml İP əlavə edilir. bufer, hüceyrələr 100% güc parametrində Hielscher ultrasəs prosessoru UP400St istifadə edərək, 12 dəfə 30 saniyə və 30 saniyə fasilələrlə buz üzərində ultrasəs edildi. 9000 q-da 10 dəqiqə sentrifuqa edildikdən sonra, supernatantın 800 μl aliquotes -20 ° C-də saxlanıldı. (Waldminghaus 2010)
     

    Ultrasonik prob ilə fermentlərin həddindən artıq istehsalı və təmizlənməsi

    Ultrasonicator UP100H tez-tez hüceyrə kulturası plitələrindən nümunə hazırlamaq üçün istifadə edilən laboratoriya homojenizatorudur.Dekahistidin (His10) ilə işarələnmiş zülalların həddindən artıq istehsalı üçün E. coli BL21(DE3) pET19b konstruksiyaları ilə çevrilmişdir. Bir gecəlik prekultura sentrifuqa yolu ilə yığıldı və 1% ifadə mədəniyyətini aşılamaq üçün istifadə edildi. pET19mgtB daşıyan hüceyrələr 600 nm (OD600) 0,7 optik sıxlığa qədər 22°C-də böyüdüldü. Mədəniyyət 17°C-yə köçürüldü və 100 μM IPTG ilə induksiya edildi. 16 saatdan sonra mədəniyyət 4°C-də 7500 × g-də sentrifuqa ilə yığıldı. Hüceyrələr pH 7.4-də 0.3 M NaCl ilə 50 mM fosfat tamponlu şoran (PBS) ilə yenidən dayandırıldı və Hielscher ultrasəs cihazı UP200St-də 0.5 və amp 75% bir dövrədə S2 mikro-ucu sonotrodu ilə ultrasəslə pozuldu.
    decahistidine-tagged GtfC overproduction bir OD 37 ° C induksiya edildi600 100 mkm IPTG ilə 0,6. Cells sonra 4 saat Soğutmalı yığılmış və MgtB üçün yuxarıda qeyd edildiyi kimi lysed edilmişdir.
    Xam hüceyrə ekstraktları hüceyrə zibilini çökdürmək üçün 15,000 × g və 4 ° C-də sentrifuqa edilmişdir. Aydınlaşdırılmış ekstraktlar ÄKTAprime Plus sistemindən istifadə edərək 1 ml HisTrap FF Crude sütunlarına yüklənmişdir. Fermentlər His etiketli zülalların gradient elüsyonu üçün istehsalçının protokoluna uyğun olaraq təmizləndi. Elut edilmiş zülal məhlulları 4°C-də 0,3 M NaCl ilə 50 mM PBS, pH 7.4, 1000 həcmə qarşı iki dəfə dializ edilmişdir. Təmizləmə 12% SDS-PAGE ilə təhlil edilmişdir. Zülalın konsentrasiyası Roti-Quant istifadə edərək Bradford üsulu ilə müəyyən edilmişdir. (Rabausch et al. 2013)
     

    E. coli bakteriyasından zülalın ultrasəs çıxarılması
    Maraq A yemi zülal (bu halda, Arabidopsis thaliana of MTV1) bir GST tag əridilmiş və BL21 Escherichia coli (E. coli) hüceyrələri dilə gətirdi.

    1. GST-MTV1 və GST-dən bir qranul götürün (50 ml bakterial mədəniyyətə uyğundur) və hər birini 2,5 ml buz soyuducu ekstraksiya tamponunda yenidən dayandırın.
    2. Bakterial hüceyrələri parçalanana qədər pozmaq üçün ultrasəs cihazı UP100H istifadə edin (təxminən 2-5ml kiçik həcmlər üçün MS3 mikrotip-sonotrodu ilə təchiz olunub), bu, azalmış qeyri-şəffaflıq və artan özlülük ilə ifadə edilir. Bu buz üzərində aparılmalıdır və fasilələrlə sonikasiya etmək tövsiyə olunur (məsələn, 10 saniyə sonikasiya, sonra buzda 10 saniyə fasilə və s.). Çox yüksək intensivliklə sonikasiya etməməyə diqqət yetirilməlidir. Köpüklənmə və ya ağ çöküntünün meydana gəlməsi aşkar edilərsə, intensivliyi azaltmaq lazımdır.
    3. Lizis olunmuş bakteriya məhlulunu 1,5 mL mikrosentrifuqa borularına köçürün və 4°C, 16,000 xq-da 20 dəqiqə sentrifuqa edin.

     

    Ultrasonik zondlar hüceyrəni pozmaq və E.coli-dən molekul və DNT çıxarmaq üçün akustik kavitasiya qüvvələrindən istifadə edir.

    UP400St kimi zond tipli ultrasəs cihazları E.coli-nin səmərəli lizisi üçün akustik kavitasiyanın iş prinsipindən istifadə edin.

    Sonikasiyadan istifadə edərək rekombinant zülalın ifadə təhlili və təmizlənməsi

    E. coli qranulları Hielscher ultrasəs cihazı UP100H ilə ultrasəs edildi. Bu məqsədlə hüceyrə qranulları soyudulmuş lizis tamponunda (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) yenidən dayandırıldı və 10 dəqiqə ərzində buz üzərində soyudu. Sonra hüceyrə süspansiyonu 10 saniyəlik 10 qısa partlayışla, sonra soyutma üçün 30 saniyəlik fasilə ilə sonikləşdirildi. Nəhayət, hüceyrə zibilləri 14000 rpm-də 15 dəqiqə 4 ° C-də ultrasentrifuqa ilə çıxarıldı. rPR ifadəsinin təsdiqi üçün supernatant 12% poliakrilamid gel üzərində işlədilmiş və SDS-PAGE və Western blotting ilə təhlil edilmişdir. rPR-nin təmizlənməsi istehsalçı təlimatına uyğun olaraq Ni2+-NTA qatranı (Invitrogen, ABŞ) istifadə edilməklə aparılmışdır. Bu mərhələdə yerli təmizləmə üsulundan istifadə edilmişdir. Təmizlənmiş zülalın saflığı 12% poliakrilamid gel üzərində elektroforez və sonradan Coomassie mavi rəngə boyanma üsulu ilə qiymətləndirilib. Təmizlənmiş protein konsentrasiyası Micro BCA protein analiz dəsti (PIERCE, ABŞ) ilə ölçüldü. (Azarnezhad et al. 2016)
     

    Bu videoda laboratoriya nümunələrinin dağıdılması, homojenləşdirilməsi, çıxarılması və ya deqazasiyası üçün 200 vattlıq ultrasəs qabığı göstərilir.

    Ultrasəs kuboku (200 vatt)

    Video Miniatür

    E. coli lizisi üçün ultrasəs homojenizatorları

    Hielscher Ultrasonics, E. coli bakteriyasının və digər hüceyrə növlərinin, toxumalarının və hüceyrə mədəniyyətlərinin etibarlı və səmərəli lizisi üçün yüksək performanslı ultrasəs homogenizatorları dizayn edir, istehsal edir və təmin edir.
    Ultrasəs zondlarının, eləcə də dolayı sonikasiya sistemlərinin geniş portfeli sizə hüceyrənin pozulması və çıxarılması tətbiqi üçün ideal ultrasəs toxuma homogenizatorunu təklif etməyə imkan verir.

    Dizayn, İstehsalat və Konsaltinq – Keyfiyyətli Almaniya istehsalı

    Hielscher ultrasəs cihazları brauzer nəzarəti vasitəsilə uzaqdan idarə oluna bilər. Sonication parametrləri izlənilə və proses tələblərinə dəqiq uyğunlaşdırıla bilər.Hielscher ultrasəs cihazları ən yüksək keyfiyyət və dizayn standartları ilə tanınır. Ağıllı proqram təminatı, intuitiv menyu, proqramlaşdırıla bilən parametrlər və avtomatik məlumat protokolu Hielscher ultrasəs cihazının yalnız bir neçə xüsusiyyətləridir. Sağlamlıq və asan əməliyyat bizim ultrasəs aparatlarımızın tədqiqat və biotexnoloji obyektlərə rahat inteqrasiyasına imkan verir. Hətta kobud şərtlər və tələbkar mühitlər Hielscher ultrasəs cihazları tərəfindən asanlıqla idarə olunur.

    Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikatlı bir şirkətdir və ən müasir texnologiya və istifadəçi dostu olan yüksək performanslı ultrasəs cihazlarına xüsusi diqqət yetirir. Əlbəttə ki, Hielscher ultrasəs cihazları CE-yə uyğundur və UL, CSA və RoHs tələblərinə cavab verir.

    Aşağıdakı cədvəldə bizim ultrasonicators təxmini emal gücü bir göstəriş verir:

    Partiyanın həcmi Axın tövsiyə Cihazlar
    çox quyulu / mikrotitr plitələr na UIP400MTP
    Flakonlar və ya stəkanlar üçün CupBuynuz na Ultrasonik cuphorn
    ultrasəs mikro axın reaktoru na GDmini2
    0,5-1,5 mL olan 10 flakona qədər na VialTweeter
    01.5ml .5 na VialTweeter
    1 500ml 10 200ml / dəq UP100H
    10 2000ml üçün 20 400ml / dəq Uf200 ः t, UP400St
    0.1 20L üçün 04L / min .2 UIP2000hdT
    10 100L üçün 10L 2 / dəq UIP4000
    na 10 100L / dəq UIP16000
    na daha böyük çoxluq UIP16000

    Bizimlə əlaqə saxlayın! Bizdən soruşun!

    Daha ətraflı məlumat üçün müraciət edin

    Zəhmət olmasa, ultrasəs toxuma homogenizatorları və hüceyrə sarsıdıcıları, lizis tətbiqləri və qiymətləri haqqında əlavə məlumat tələb etmək üçün aşağıdakı formadan istifadə edin. Prosesinizi sizinlə müzakirə etməkdən və tələblərinizə cavab verən ultrasəs homogenizatoru təklif etməkdən şad olarıq!









    Xahiş edirik unutmayın Gizlilik Siyasəti.


    Videoda UIP400MTP ultrasəs nümunəsi hazırlama sistemi göstərilir ki, bu da yüksək intensivlikli ultrasəsdən istifadə etməklə istənilən standart çoxquyulu lövhələrdən etibarlı nümunə hazırlamağa imkan verir. UIP400MTP-nin tipik tətbiqlərinə hüceyrə lizisi, DNT, RNT və xromatinin kəsilməsi, həmçinin zülal çıxarılması daxildir.

    Çox yaxşı boşqablı sonikasiya üçün UIP400MTP Ultrasonicator

    Video Miniatür

    Ultrasonik E. coli lizisi üçün əlavə protokollar

    Ultrasonik VialTweeter istifadə edərək E. coli-də allisin dəyişdirilmiş zülallar

    UP200ST ultrasəs prosessorunda VialTweeter5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic turşusu) (DTNB) Assay ilə Sulfhydryl Contents təyini
    MOPS minimal mühitini (1:100) aşılamaq üçün E. coli MG1655 gecə mədəniyyətindən istifadə edilmişdir. A600 0,4-ə çatana qədər mədəniyyət aerobik şəkildə yetişdirildi. Stress müalicəsi üçün mədəniyyət üç 15 ml kulturaya bölündü. Müalicə olunmamış mədəniyyət mənfi nəzarət rolunu oynayır. Qalan iki kulturanın hər birinə 0,79 mM allisin (128 μg ml-1) və ya 1 mM diamid əlavə edildi. Mədəniyyətlər 15 dəqiqə inkubasiya edildi. Hər mədəniyyətdən 5 ml sentrifuqalama yolu ilə yığılmışdır (8,525 × g, 4°C, 10 dəq). Hüceyrələr iki dəfə 1 ml PBS ilə yuyuldu (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, istifadədən əvvəl anaerob olaraq saxlanıldı) və sentrifuqa edildi (13.000 × 10 ° C,). Hüceyrələr ultrasəslə 4°C-də pozulmazdan əvvəl lizis tamponunda (6 mM guanidinium HCl, pH 7.4 ilə PBS) yenidən dayandırıldı (VialTweeter ultrasəs cihazı, Hielscher GmbH, Almaniya) (3 × 1 dəq). Hüceyrə zibilləri sentrifuqalama (13,000 × g, 4 °C, 15 dəq) ilə peletlənmişdir. Supernatant maqnit qarışdırıcı çubuğu olan 3,5 ml QS-makrokyuvetə (10 mm) köçürüldü və 1 ml lizis tamponu ilə qarışdırıldı. Nümunələrin sönməsi otaq temperaturunda PSC-718 temperaturu ilə idarə olunan hüceyrə tutucusu ilə təchiz edilmiş Jasco V-650 spektrofotometri ilə 412 nm-də nəzarət edildi. 100μl 3 mM ditiobis (2-nitrobenzoy turşusu) məhlulu əlavə edildi. Sönmə doyma səviyyəsinə çatana qədər izlənilirdi. Tiol konsentrasiyasının hesablanması ϵ sönmə əmsalı ilə aparılmışdır412 = 13,700 M-1 santimetr-1 Thio-2-nitrobenzoic turşusu (TNB) üçün. Cellular thiol konsentrasiyası 6,7 × 10 E. coli hüceyrələri həcmi əsasında hesablanır edilmişdir-15 litr və hüceyrə sıxlığı A600 = 0,5 (1 × 10-a bərabərdir)8 hüceyrələri ml-1 mədəniyyət). (Müller et al. 2016)
     

    Ultrasonik Hüceyrə Kırıcıdan istifadə edərək Vivo Qlutatyon Təyinatı

    E.coli MG1655, A600 0,5-ə çatana qədər 200ml ümumi həcmdə MOPS minimal mühitində yetişdirildi. Stress müalicəsi üçün kultura 50 ml-lik kulturalara bölündü. 0,79 mM allisin, 1 mM diamid və ya dimetil sulfoksid (nəzarət) ilə 15 dəqiqəlik inkubasiyadan sonra hüceyrələr 10 dəqiqə ərzində 4000 q-da 4°C-də yığılmışdır. 700µl KPE tamponunda qranulların yenidən suspenziyasından əvvəl hüceyrələr iki dəfə KPE tamponu ilə yuyuldu. Deproteinasiya üçün, ultrasəslə hüceyrələrin pozulmasından əvvəl (3 x 1 dəq; VialTweeter ultrasonicator). Supernatants (30 min, 13,000g, 4 ° C) sentrifuqa sonra toplandı. Sulfosalicylic turşusu konsentrasiyası KPE bufer 3 cilddə əlavə 1% -ə azalmışdır. ümumi glutatyon və GSSG of Ölçmələr yuxarıda təsvir kimi edildi. Cellular glutatyon konsentrasiyaları E. həcmi əsasında hesablanır edilmişdir 6.7 hüceyrələri coli×10-15 litr və hüceyrə sıxlığı A600 0,5 (1×108 hüceyrələri ml-1 mədəniyyət). GSH konsentrasiyaları ümumi glutatyon 2 [GSSG] çıxarılması ilə hesablanmışdır. (Müller et al. 2016)

    Ultrasonik Homogenizatordan istifadə edərək E. coli-də İnsan mAspAT-ın ifadəsi

    hüceyrədaxili məsələnin çıxarılması üçün Ultrasonik mobil Topu UP400St (400W) (məsələn zülallar, organelles, DNT, RNT və s.)optik sıxlığı qədər 37ºC-də becərilən tək Luria-Bertani (LB) orta tərkibli 100μg / mL ampisillinə 30 ml ifadə vektor sığınacaq E. coli BL21 müstəmləkəsi (DE3), sonra (OD600) 0.6 çatdı. hüceyrələri 10 min 4000 × q sentrifuqa ilə yığılmış və 100μg / mL ampisillin olan 3L təzə LB orta resuspended edildi.
    Daha sonra zülal ifadəsi 16ºC-də 20 saat ərzində 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tioqalaktopiranosid (IPTG) ilə induksiya edilmişdir. Hüceyrələr 15 dəqiqə ərzində 8000 × g-də sentrifuqa ilə yığılmış və tampon A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4) ilə yuyulmuşdur. 3 L mədəniyyətdən təxminən 45 q (yaş çəki) hüceyrələr əldə edilmişdir. Santrifüjdən sonra hüceyrə qranulları 40 mL (1 L mədəniyyət üçün) buz kimi soyuq ekstraksiya tamponu A-da yenidən dayandırıldı və Hielscher ultrasəs hüceyrə qırıcısı UP400St istifadə edərək buz kimi soyuq temperaturda ultrasəslə parçalandı. Hüceyrə lizisi həll olunan (supernatant) və çökdürülmüş (qranul) fraksiyaları ayırmaq üçün 15 dəqiqə ərzində 12,000 rpm-də sentrifuqa edilmişdir. (Jiang et al. 2015)
     



    Bilmək lazımdır

    E.coli

    Escherichia coli (E. coli) bir qram-mənfi, facultatively anaerob, rod formalı, çox isti qanlı orqanizmlərin (endotherms) aşağı bağırsaq aşkar növlü Escherichia of coliform bakteriya. E. çox sayda müxtəlif xüsusiyyətləri ilə suşlarının (və ya alt) coli var. Ən E. coli suşlarının məsələn insanlar üçün zərərsiz laboratoriyalarda tədqiqat proqramları üçün çox istifadə olunur B və K-12 suşlarının. Lakin, bəzi suşlarının zərərli və ciddi xəstəlik səbəb ola bilər.
    bakteriyalar manipulyasiya etmək asandır, çünki E. coli müasir bioloji mühəndislik və sənaye mikrobiologiya mühüm rol oynayır. E. coli, məsələn tez-tez istifadə edilə Common laboratoriya applications rekombinant dezoksiribonuklein turşusu (DNT) yaratmaq və ya bir model orqanizm kimi hərəkət etmək.
    E. coli heterologous zülal istehsalı üçün çox yönlü host və manifold protein ifadə sistemləri E. coli rekombinant zülalların istehsal mövcuddur. zülal yüksək səviyyədə ifadə icazə plasmids istifadə edərək, gen sənaye fermentasiya proseslərinin yüksək miqdarda belə zülal istehsal etməyə imkan verir bakteriya daxil edilə bilər.
    E.coli insulin istehsal etmək üçün hüceyrə fabrikləri kimi istifadə olunur. Əlavə tətbiqlərə peyvəndlər və immobilizasiya edilmiş fermentlər hazırlamaq və istehsal etmək, bioyanacaq istehsal etmək, həmçinin bioremediasiya üçün dəyişdirilmiş E. coli hüceyrələrindən istifadə daxildir.
    gərginlik K-12 E. bir mutant forma ferment Qələvi fosfataza (ALP) həddindən artıq ifadə edən coli edir. Bu mutasiya səbəbiylə ferment üçün daim kodları gen bir qüsur baş verir. bir gen hər hansı bir inhibe olmadan məhsul istehsal bu təsis fəaliyyəti kimi tanınır. Bu xüsusi mutant forma təcrid və təmizlənməsi ALP ferment üçün istifadə olunur.
    E. coli bakteriyaları hüceyrə fabrikləri kimi də geniş istifadə olunur. Mühəndis mikroblar (məsələn, bakteriya) və bitki hüceyrələrindən sözdə hüceyrə fabrikləri kimi istifadə edilə bilər. Bu geni dəyişdirilmiş hüceyrələr, məsələn, əczaçılıq, qida və kimya sənayesində istifadə olunan molekullar, kimyəvi maddələr, polimerlər, zülallar və digər maddələr istehsal edir. Belə biomühəndislik hüceyrələrinin içərisində istehsal olunan molekulları sərbəst buraxmaq üçün ultrasəs lizis hüceyrə divarlarını pozmaq və hədəf maddələri ətrafdakı mayeyə köçürmək üçün ümumi bir üsuldur. Biomühəndis hüceyrələrinin parçalanması haqqında daha çox oxuyun!

    Ultrasonik DNA Shearing

    Ultrasəs kəsmə qüvvələri molekulları, orqanelləri və zülalları hüceyrə daxilindən azad etmək, həmçinin DNT zəncirlərini parçalara ayırmaq üçün çox istifadə edilən üsuldur. Akustik kavitasiya hüceyrələrdən DNT çıxarmaq və təxminən 600 ədəd fraqment yaratmaq üçün hüceyrə divarlarını və membranlarını qırır. – analiz üçün ideal uzunluğu 800 bp.
    DNA parçalanma üçün ultrasəs homogenizers haqqında daha ətraflı məlumat üçün buraya basın!

    Ədəbiyyat / İstinadlar


    Yüksək performanslı ultrasəs! Hielscher məhsul çeşidi kompakt laboratoriya ultrasəs cihazından tutmuş tam sənaye ultrasəs sistemlərinə qədər tam spektri əhatə edir.

    Hielscher Ultrasonics, yüksək performanslı ultrasəs homogenizatorları istehsal edir Laboratoriya qədər sənaye ölçüsü.


    Prosesinizi müzakirə etməkdən məmnun olarıq.

    Əlaqə saxlayaq.