E. Coli-nin ultrasəslə lizisi

E. coli bakteriyaları mikrobiologiya və biotexnologiyada ən çox istifadə olunan bakteriyalardır.
Ultrasəs hüceyrə parçalayıcıları E. coli-nin lizisi üçün etibarlı və təkrarlana bilən nəticələr təmin edir.
İntensiv, lakin dəqiq idarə oluna bilən kavitasiya və kəsilmə qüvvələri tam parçalanma və yüksək ekstraksiya çıxımı (məsələn, zülallar, DNT) təmin edir.

E. coli hüceyrələrinin ultrasəslə parçalanması nə üçün üstünlük verilən üsuldur?

Ultrasəs homogenizatorları və ya zond tipli ultrasəs cihazları E. coli-nin lizisi üçün bir sıra üstünlüklər təklif edir, çünki intensiv ultrasəs hüceyrə divarlarını və membranlarını səmərəli şəkildə parçalayır. Zond tipli ultrasəs cihazları aşağıdakı səbəblərə görə E. coli-nin lizisi üçün geniş istifadə olunur:

Hüceyrə divarlarının səmərəli parçalanması: E. coli peptidoqlikandan ibarət yarımsərt hüceyrə divarına malikdir və bu divarı ənənəvi lizis üsulları ilə parçalamaq çətin ola bilər. Zond tipli ultrasəs cihazı hüceyrələri əhatə edən mayedə kavitasiya qabarcıqları yaradan intensiv ultrasəs dalğaları əmələ gətirir. Bu qabarcıqlar çökdükdə yüksək sürətli maye şırnaqları və zərbə dalğaları yaradır; bunlar hüceyrə divarlarının mexaniki parçalanmasına səbəb olur və biomolekullar kimi hüceyrə möhtəviyyatını səmərəli şəkildə sərbəst buraxır.

Daha dərin nüfuzetmə: Zondun / sonotrodun yaratdığı ultrasəs dalğaları nümunənin dərinliyinə nüfuz edə, daha çox E. coli hüceyrəsinə çata və onları bərabər şəkildə emal edə bilər. Bu, lizisin bütün nümunə boyunca daha bərabər getməsini təmin etməyə kömək edir və hüceyrələrin parçalanma səmərəliliyini artırır.

Emal müddətinin qısalması: Zond tipli ultrasəs cihazının ötürdüyü enerji yüksək dərəcədə cəmlənmiş və lokallaşmış olduğundan hüceyrələrin sürətli və səmərəli lizisinə səbəb olur. Kürəciklərlə parçalama və ya fermentativ lizis kimi digər üsullarla müqayisədə ultrasəslə emal E. coli-nin lizisini bir neçə dəqiqə, hətta saniyə ərzində həyata keçirə bilər. Dondurma–əritmə kimi bir çox alternativ üsul bir neçə emal dövrü tələb etdiyi halda, ultrasəslə lizis hüceyrələri bir proses mərhələsində açır.

Temperaturun idarə olunması: Ən müasir ultrasəs cihazları temperatur sensorları və ağıllı proqram təminatı ilə təchiz edilir; bu, prosesin maksimum temperaturunu təyin etməyə imkan verir. Temperatur həddinə çatdıqda ultrasəs cihazı avtomatik olaraq fasilə verir və təyin edilmiş temperatur nöqtəsinə çatdıqda ultrasəslə emal prosesini başladır. Nümunələrin buz vannasında soyudulması nümunə temperaturunu aşağı saxlamaq və istiliyin səbəb olduğu nümunə deqradasiyasının qarşısını almaq üçün sadə üsuldur.

Miqyaslandırma imkanı: Zond tipli ultrasəs cihazları əl cihazlarından iri miqyaslı sənaye modellərinə qədər müxtəlif ölçülərdə mövcuddur. Bu, onları laboratoriyada kiçik həcmlərin emalı və ya daha böyük bioproses tətbiqləri, məsələn, vaksin istehsalı və ya molekulların biosintezi üçün miqyasın artırılması baxımından uyğun edir.

Çoxfunksiyalılıq: Ultrasəs cihazları hüceyrə lizisindən əlavə DNT-nin kəsilmə qüvvələri ilə parçalanması, zülal ekstraksiyası, toxuma homogenləşdirilməsi, nanohissəciklərin dispersiyası və emulsiyalaşdırma kimi müxtəlif tətbiqlərdə istifadə oluna bilər. Buna görə də zond tipli ultrasəs cihazına sərmayə qoymaq tədqiqat və ya sənaye şəraitində çoxfunksiyalılıq təmin edir.

UP200St kimi zond tipli ultrasəs cihazları etibarlı toxuma homogenizatorları və hüceyrə parçalayıcılarıdır, buna görə də genetikada nümunə hazırlığı üçün, məsələn, E.coli-nin lizisi üçün geniş istifadə olunur

E.coli hüceyrələrindən zülal ekstraksiyası səmərəli şəkildə bu cihazla həyata keçirilir: UP200St ultrasəs zondu

Zond tipli ultrasəs cihazı E. coli-nin lizisi üçün bir çox üstünlük təklif edir. Ultrasəs prosesinin parametrlərinin etibarlı və dəqiq idarə olunması arzu olunan nəticələrə nail olmaq üçün güc, müddət və nümunə ilə işləmə kimi əməliyyat parametrlərini optimallaşdırmağa imkan verir.

Bu təlimat laboratoriya, analiz və tədqiqat işlərində lizis, hüceyrələrin parçalanması, zülalların ayrılması, DNT və RNT fraqmentasiyası kimi nümunə hazırlama tapşırıqları üçün hansı növ ultrasəs cihazının daha uyğun olduğunu izah edir. Tətbiqinizə, nümunə həcminə, nümunə sayına və emal məhsuldarlığına uyğun ideal ultrasəs cihazı növünü seçin. Hielscher Ultrasonics sizin üçün ideal ultrasəs homogenizatoruna malikdir!

DNT-nin ultrasəslə fraqmentasiyası yeni nəsil sekvensləmədə (NGS) nümunə hazırlığı mərhələsi kimi tez-tez istifadə olunur

0 – 15 min ultrasəslə emala məruz qalmış E. coli EDL933-ün genom DNT-sinin elektroforetik analizləri. L DNT ölçü markerini göstərir.
(tədqiqat və şəkil: ©Basselet et al. 2008)

Ultrasəs kavitasiyasından istifadə etməklə hüceyrələrin parçalanması

Zond tipli ultrasəs homogenizatorları saniyədə təxminən 20.000 dövrlə (20kHz tezlikdə) işləyir və mayelərdə və ya suspenziyalarda kavitasiya yaradır. Akustik kavitasiya hüceyrələri parçalayan, vakuuma bənzər təzyiqlərə və yüksək temperaturlara malik mikroskopik sahələr yaradır. Temperaturlar bir neçə min Selsi dərəcəsinə çata bilsə də, kavitasiya həcmləri o qədər kiçikdir ki, prosesi əhəmiyyətli dərəcədə qızdırmır. Ultrasəsin yaratdığı akustik kavitasiya və kəsilmə qüvvələri E.coli kimi bakteriya hüceyrələrinin membranını deşir və ya parçalayır. Hielscher ultrasəs cihazları ultrasəs intensivliyi, amplituda, enerji girişi və temperatur kimi proses parametrlərinin dəqiq idarə olunmasına imkan verir. Beləliklə, ultrasəslə lizis prosesi hüceyrə növünə, hüceyrə kulturasına və prosesin məqsədinə optimal şəkildə uyğunlaşdırıla bilər.

Ultrasəslə lizisin üstünlükləri

lizisin dəqiq idarə olunması (intensivlik, amplituda, temperatur)
etibarlı, təkrarlana bilən nəticələr
konkret nümunələrə optimal uyğunlaşdırma
temperaturun idarə olunması
çox kiçikdən çox böyüyə qədər nümunələr üçün (µL-dən litrlərə qədər)
yalnız mexaniki emal
istifadəçi üçün rahat, təhlükəsiz istismar
laboratoriyadan istehsala xətti miqyas artırılması

VialTweeter ultrasəs cihazı eyni proses şəraitində ən çox 10 flakonda nümunələrin eyni vaxtda hazırlanmasına imkan verir. (Böyütmək üçün klikləyin!)

VialTweeter ultrasəslə lizis üçün

Ultrasəs homogenizatorunun digər lizis üsulları ilə müqayisəsi

Kimyəvi və fermentativ lizis problemli ola bilər – çünki kimyəvi lizis zülal strukturlarını dəyişə və təmizləmə problemləri yarada bilər, fermentativ lizis isə uzun inkubasiya müddətləri tələb edir və təkrarlana bilən deyil – ultrasəslə parçalama hüceyrələrin parçalanması üçün təkmil və sürətli üsuldur.
Ultrasəslə lizis yalnız mexaniki qüvvələrə əsaslanır. Heç bir kimyəvi maddə əlavə edilmir; ultrasəslə emal hüceyrə divarını kəsilmə qüvvələri vasitəsilə parçalayır. Kimyəvi lizis zülal strukturunu dəyişə və təmizləmə problemləri yarada bilər. Fermentativ parçalama uzun inkubasiya müddətləri tələb edir və təkrarlana bilən deyil. E.coli bakteriya hüceyrələrinin ultrasəslə parçalanması sürətli, sadə, etibarlı və təkrarlana biləndir. Məhz buna görə Hielscher ultrasəs cihazları bütün dünyada bioloji və biokimyəvi laboratoriyalarda nümunə hazırlığı, preanalitik işlər, in-vitro diaqnostika və çoxsaylı analizlər üçün istifadə olunur.

Ultrasəslə lizis üçün ümumi tövsiyələr

Ultrasəslə emal çox kiçik, orta və böyük miqdarlarda hüceyrə suspenziyalarının lizisi üçün ən populyar üsuldur – pikolitrlərdən 100L/hr-dək (ultrasəs axın hüceyrəsindən istifadə etməklə). Hüceyrələr mayedəki kəsilmə qüvvələri və kavitasiya vasitəsilə lizisə uğrayır. Ultrasəslə emal zamanı DNT də kəsilmə qüvvələri ilə parçalandığından hüceyrə suspenziyasına DNaza əlavə etmək lazım deyil.

E.coli-nin ultrasəslə lizisi zamanı temperaturun idarə olunması
Nümunəni əvvəlcədən soyutmaq və ultrasəslə emal zamanı buz üzərində saxlamaqla nümunənin istilik deqradasiyasının qarşısını asanlıqla almaq olar.
İdeal halda nümunələr lizis zamanı buz kimi soyuq saxlanmalıdır, lakin əksər nümunələr üçün temperaturun kultura və ya toxuma mənbəyinin temperaturundan yuxarı qalxmaması kifayətdir. Buna görə suspenziyanı buz üzərində saxlamaq və 10–30 sec fasilələrlə bir neçə qısa 5–10 sec ultrasəs impulsu tətbiq etmək tövsiyə olunur. Fasilələr zamanı istilik yayıla və beləliklə, aşağı temperatur yenidən bərpa oluna bilər. Daha böyük hüceyrə nümunələri üçün soyutma gödəkçələri olan müxtəlif axın hüceyrəsi reaktorları mövcuddur.
Uğurlu ultrasəslə lizis üçün ətraflı məsləhət və tövsiyələri burada oxuyun!

E. Coli lizatlarının ultrasəslə hazırlanması üçün protokollar

Tədqiqatçılar E.coli hüceyrələrinin parçalanması üçün Hielscher ultrasəs homogenizatorlarından istifadə edirlər. Aşağıda E. coli ilə əlaqəli müxtəlif tətbiqlər üçün Hielscher ultrasəs homogenizatorları ilə E.coli-nin lizisinə dair sınaqdan keçirilmiş və təsdiqlənmiş müxtəlif protokolları tapa bilərsiniz.

Ultrasəsdən istifadə etməklə hüceyrələrin yetişdirilməsi, çarpaz bağlanması və E. coli hüceyrə ekstraktlarının hazırlanması

SeqA və RNT polimeraza ChIP-Chip üçün E. coli MG1655 və ya MG1655 ΔseqA 37°C-də yetişdirildi; OD₆₀₀ təxminən 0,15 olana qədər 50 ml LB-də (+ 0,2% qlükoza) yetişdirmədən sonra mühitin hər ml-i üçün 27 μl formaldehid (37%) əlavə edildi (son konsentrasiya 1%). Çarpaz bağlanma otaq temperaturunda 20 min ərzində yavaş çalxalama (100 rpm) ilə aparıldı, ardınca 10 ml 2,5 M qlisinlə dayandırıldı (son konsentrasiya 0,5 M). İstilik şoku təcrübələri üçün E. coli MG1655 65 ml LB mühitində 30°C-də yetişdirildi; OD₆₀₀ təxminən 0,3 olana qədər yetişdirmədən sonra kulturanın 30 ml-i əvvəlcədən 43°C-yə qədər qızdırılmış kolbaya köçürüldü, qalan hissə isə 30°C-də saxlanıldı. Çarpaz bağlanma və reaksiyanın dayandırılması yuxarıda təsvir olunduğu kimi aparıldı; fərq ondan ibarət idi ki, hüceyrələr otaq temperaturunda əlavə yavaş çalxalamadan əvvəl 5 min ərzində 30 və ya 43°C-də saxlanıldı. Hüceyrələr sentrifuqalama ilə toplandı və soyuq TBS (pH7.5) ilə iki dəfə yuyuldu. 1 ml lizis buferində (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saxaroza, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizozim) yenidən suspenziyalaşdırıldıqdan və 37°C-də 30 min inkubasiya edildikdən sonra 4 ml IP buferi əlavə edildi, sonra hüceyrələr Hielscher UP400St ultrasəs prosessoru ilə 100% güc parametrində buz üzərində 12 dəfə 30 sec ərzində, 30 sec fasilələrlə ultrasəslə emal edildi. 9000 g-də 10 min sentrifuqalamadan sonra supernatantın 800 μl alikvotları -20°C-də saxlanıldı. (Waldminghaus 2010)

Ultrasəs zondu ilə fermentlərin həddindən artıq istehsalı və təmizlənməsi

Dekahistidin (His10) nişanlı zülalların həddindən artıq istehsalı üçün E. coli BL21(DE3) pET19b konstruksiyaları ilə transformasiya edildi. Gecə ərzində yetişdirilmiş ilkin kultura sentrifuqalama ilə toplandı və onun 1%-i ekspressiya kulturasını inokulyasiya etmək üçün istifadə olundu. pET19mgtB daşıyan hüceyrələr 600 nm-də optik sıxlıq (OD600) 0,7 olana qədər 22°C-də yetişdirildi. Kultura 17°C-yə keçirildi və 100 μM IPTG ilə induksiya edildi. 16 h sonra kultura 4°C-də 7.500 × g-də sentrifuqalama ilə toplandı. Hüceyrələr pH 7,4-də 0,3 M NaCl olan 50 mM fosfat buferli duz məhlulunda (PBS) yenidən suspenziyalaşdırıldı və Hielscher UP200St ultrasəs cihazında S2 mikrouclu sonotrodla 0,5 dövr və 75% amplituda parametrində ultrasəslə parçalandı.
Dekahistidin nişanlı GtfC-nin həddindən artıq istehsalı 37°C-də induksiya edildi; OD₆₀₀ 0,6 olduqda 100 μM IPTG əlavə edildi. Hüceyrələr daha sonra 4 h inkubasiya edildi, toplandı və MgtB üçün yuxarıda göstərildiyi kimi lizisə uğradıldı.
Hüceyrə qalıqlarını çökdürmək üçün xam hüceyrə ekstraktları 15.000 × g-də və 4°C-də sentrifuqalandı. Durulaşdırılmış ekstraktlar ÄKTAprime Plus sistemi vasitəsilə 1-ml HisTrap FF Crude kolonlarına yükləndi. Fermentlər His nişanlı zülalların qradiyent elüsiyası üçün istehsalçının protokoluna uyğun təmizləndi. Elüsiya olunmuş zülal məhlulları 4°C-də 0,3 M NaCl olan, pH 7,4-dəki 50 mM PBS-in 1.000 qat həcminə qarşı iki dəfə dializ edildi. Təmizlənmə 12% SDS-PAGE ilə analiz edildi. Zülalın konsentrasiyası Roti-Quant-dan istifadə etməklə Bradford üsulu ilə müəyyən edildi. (Rabausch et al. 2013)

E. coli bakteriyalarından zülalın ultrasəslə ekstraksiyası
Maraq doğuran bir yem zülalı (bu halda Arabidopsis thaliana-nın MTV1 zülalı) GST nişanı ilə birləşdirilir və BL21 Escherichia coli (E. coli) hüceyrələrində ekspressiya olunur.

GST-MTV1 və GST-nin hərəsindən bir çöküntü götürün (50 ml bakteriya kulturasına uyğun gələn) və hər birini 2,5 mL buz kimi soyuq ekstraksiya buferində yenidən suspenziyalaşdırın.
Bakteriya hüceyrələrini lizisə uğrayana qədər parçalamaq üçün UP100H ultrasəs cihazından (təxminən 2–5mL kiçik həcmlər üçün MS3 mikrouclu sonotrodla təchiz edilmiş) istifadə edin; lizis bulanıqlığın azalması və özlülüyün artması ilə müşahidə olunur. Bu, buz üzərində aparılmalıdır və ultrasəslə emalı fasilələrlə həyata keçirmək tövsiyə olunur (məsələn, 10 sec ultrasəslə emal, ardınca buz üzərində 10 sec fasilə və s.). Ultrasəslə emalın həddindən artıq yüksək intensivlikdə aparılmamasına diqqət yetirilməlidir. Köpüklənmə və ya ağ çöküntünün əmələ gəlməsi aşkar edilərsə, intensivlik azaldılmalıdır.
Lizisə uğramış bakteriya məhlulunu 1,5 mL mikrosentrifuqa sınaq borularına köçürün və 4°C-də, 16.000 x g-də 20 min sentrifuqalayın.

Ultrasəs zondları hüceyrələri parçalamaq və E.coli-dən molekulları və DNT-ni ekstraksiya etmək üçün akustik kavitasiya qüvvələrindən istifadə edir.

UP400St kimi zond tipli ultrasəs cihazları E.coli-nin səmərəli lizisi üçün akustik kavitasiyanın iş prinsipindən istifadə edir.

Ultrasəslə emaldan istifadə etməklə rekombinant zülalın ekspressiya analizi və təmizlənməsi

E. coli çöküntüsü Hielscher UP100H ultrasəs cihazı ilə ultrasəslə emal edildi. Bu məqsədlə hüceyrə çöküntüsü soyudulmuş lizis buferində (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) yenidən suspenziyalaşdırıldı və buz üzərində 10 min soyuduldu. Sonra hüceyrə suspenziyası soyutma üçün 30 s fasilələrlə hər biri 10 s olan 10 qısa ultrasəs impulsu ilə emal edildi. Nəhayət, hüceyrə qalıqları 4°C-də 15 min ərzində 14.000 rpm-də ultrasentrifuqalama ilə uzaqlaşdırıldı. rPR ekspressiyasını təsdiqləmək üçün supernatant 12% poliakrilamid geldə elektroforezə məruz qoyuldu və SDS-PAGE və Western blot üsulları ilə analiz edildi. rPR istehsalçının təlimatına uyğun olaraq Ni2+-NTA qatranından (Invitrogen, ABŞ) istifadə etməklə təmizləndi. Bu mərhələdə nativ təmizləmə üsulundan istifadə olundu. Təmizlənmiş zülalın saflığı 12% poliakrilamid geldə elektroforez və sonrakı Coomassie mavisi ilə boyama vasitəsilə qiymətləndirildi. Təmizlənmiş zülalın konsentrasiyası Micro BCA zülal analizi dəsti (PIERCE, ABŞ) ilə ölçüldü. (Azarnezhad et al. 2016)

Bu video laboratoriya nümunələrinin dispersləşdirilməsi, homogenləşdirilməsi, ekstraksiyası və ya qazsızlaşdırılması üçün 200 vatt gücündə ultrasəs cuphorn cihazını göstərir.

E. coli-nin lizisi üçün ultrasəs homogenizatorları

Hielscher Ultrasonics E. coli bakteriyalarının və digər hüceyrə növlərinin, toxumaların və hüceyrə kulturlarının etibarlı və səmərəli lizisi üçün yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs homogenizatorları layihələndirir, istehsal edir və təchiz edir.
Ultrasəs zondlarının və dolayı ultrasəslə emal sistemlərinin geniş çeşidi hüceyrələrin parçalanması və ekstraksiya tətbiqiniz üçün sizə ideal ultrasəs toxuma homogenizatorunu təklif etməyə imkan verir.

Layihələndirmə, istehsal və məsləhət xidmətləri – Almaniya istehsalı keyfiyyət

Hielscher ultrasəs cihazları ən yüksək keyfiyyət və dizayn standartları ilə tanınır. Ağıllı proqram təminatı, intuitiv menyu, proqramlaşdırıla bilən parametrlər və məlumatların avtomatik qeydə alınması Hielscher ultrasəs cihazlarının xüsusiyyətlərindən yalnız bir neçəsidir. Möhkəmlik və asan istismar ultrasəs cihazlarımızın tədqiqat və biotexnologiya müəssisələrinə problemsiz inteqrasiyasına imkan verir. Hielscher ultrasəs cihazları hətta sərt şəraitin və yüksək tələblər qoyan mühitlərin öhdəsindən də asanlıqla gəlir.

Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatlı şirkətdir və ən müasir texnologiyaya və istifadə rahatlığına malik yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs cihazlarına xüsusi diqqət yetirir. Əlbəttə, Hielscher ultrasəs cihazları CE tələblərinə uyğundur və UL, CSA və RoHs tələblərinə cavab verir.

Aşağıdakı cədvəl ultrasəs cihazlarımızın təxmini emal qabiliyyəti haqqında təsəvvür yaradır:

Partiya həcmi	Axın sürəti	Tövsiyə olunan cihazlar
çoxyuvalı / mikrotitr lövhələri	n.a.	UIP400MTP
Flakonlar və ya laboratoriya stəkanı üçün CupHorn	n.a.	Ultrasəs CupHorn
ultrasəs mikroaxın reaktoru	n.a.	GDmini2
0,5-dən 1,5mL-ə qədər həcmli ən çox 10 flakon	n.a.	VialTweeter
0,5-dən 1,5mL-ə qədər	n.a.	VialTweeter
1-dən 500mL-ə qədər	10-dan 200mL/min-ə qədər	UP100H
10-dan 2000mL-ə qədər	20-dən 400mL/min-ə qədər	UP200Ht, UP400St
0,1-dən 20L-ə qədər	0,2-dən 4L/min-ə qədər	UIP2000hdT
10-dan 100L-ə qədər	2-dən 10L/min-ə qədər	UIP4000
n.a.	10-dan 100L/min-ə qədər	UIP16000
n.a.	daha yüksək	cihaz klasteri: UIP16000

Bizimlə əlaqə saxlayın! / Bizdən soruşun!

Videoda yüksək intensivlikli ultrasəs vasitəsilə istənilən standart çoxyuvalı lövhədə nümunələrin etibarlı hazırlanmasını təmin edən UIP400MTP ultrasəs nümunə hazırlama sistemi göstərilir. UIP400MTP cihazının tipik tətbiqlərinə hüceyrə lizisi, DNT, RNT və xromatinin parçalanması, eləcə də zülal ekstraksiyası daxildir.

E. coli-nin ultrasəslə lizisi üçün əlavə protokollar

Ultrasəs VialTweeter cihazından istifadə etməklə E. coli-də allisinlə modifikasiya olunmuş zülallar

5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoy turşusu) (DTNB) analizi ilə sulfhidril qruplarının miqdarının müəyyən edilməsi
MOPS minimal mühitini inokulyasiya etmək üçün gecə ərzində yetişdirilmiş E. coli MG1655 kulturasından istifadə olundu (1:100). Kultura A600 0,4 olana qədər aerob şəraitdə yetişdirildi. Kultura stress emalı üçün üç 15-ml kulturaya bölündü. Emal edilməmiş kultura mənfi nəzarət kimi istifadə olundu. Qalan iki kulturadan birinə 0,79 mM allisin (128 μg ml-1), digərinə isə 1 mM diamid əlavə edildi. Kulturlar 15 min inkubasiya edildi. Hər kulturanın 5 ml-i sentrifuqalama ilə toplandı (8.525 × g, 4°C, 10 min). Hüceyrələr 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, istifadədən əvvəl anaerob şəraitdə saxlanılmış) ilə iki dəfə yuyuldu və sentrifuqalandı (13.000 × g, 4°C, 10 min). Hüceyrələr 4°C-də ultrasəslə parçalanmadan əvvəl lizis buferində (6 mM quanidinium HCl olan PBS, pH 7,4) yenidən suspenziyalaşdırıldı (VialTweeter ultrasəs cihazı, Hielscher GmbH, Almaniya) (3 × 1 min). Hüceyrə qalıqları sentrifuqalama ilə çökdürüldü (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatant maqnit qarışdırma çubuğu olan 3,5-ml QS-macro küvetinə (10 mm) köçürüldü və 1 ml lizis buferi ilə qarışdırıldı. Nümunələrin absorbansı otaq temperaturunda PSC-718 temperaturla idarə olunan küvet tutacağı ilə təchiz edilmiş Jasco V-650 spektrofotometri ilə 412 nm-də izlənildi. 3 mM ditiobis(2-nitrobenzoy turşusu) məhlulundan 100μl əlavə edildi. Absorbans doyma səviyyəsinə çatana qədər izlənildi. Tiol konsentrasiyasının hesablanmasında istifadə olunan absorbsiya əmsalı ϵ₄₁₂ = 13.700 M^-1 cm^-1 tio-2-nitrobenzoy turşusuna (TNB) aiddir. Hüceyrədaxili tiol konsentrasiyaları E. coli hüceyrələrinin həcminin 6,7 × 10^-15 litr və hüceyrə sıxlığının A600 = 0,5 olması əsasında hesablandı (kulturanın hər ml-ində 1 × 10⁸ hüceyrəyə uyğun gəlir; vahid: hüceyrə ml^-1 kultura). (Müller et al. 2016)

Ultrasəs hüceyrə parçalayıcısından istifadə etməklə in vivo qlutationun müəyyən edilməsi

E.coli MG1655 ümumi həcmi 200ml olan MOPS minimal mühitində A600 0,5 olana qədər yetişdirildi. Kultura stress emalı üçün 50-ml kulturlara bölündü. 0,79 mM allisin, 1 mM diamid və ya dimetilsulfoksidlə (nəzarət) 15 min inkubasiyadan sonra hüceyrələr 4°C-də 4.000g-də 10 min ərzində toplandı. Çöküntülərin 700µl KPE buferində yenidən suspenziyalaşdırılmasından əvvəl hüceyrələr KPE buferi ilə iki dəfə yuyuldu. Zülalların uzaqlaşdırılması üçün hüceyrələrin ultrasəslə parçalanmasından əvvəl 300l 10% (w/v) sulfosalisil turşusu əlavə edildi (3 x 1 min; VialTweeter ultrasəs cihazı). Supernatantlar sentrifuqalamadan sonra toplandı (30 min, 13.000g, 4°C). 3 həcm KPE buferi əlavə etməklə sulfosalisil turşusunun konsentrasiyaları 1%-ə endirildi. Ümumi qlutationun və GSSG-nin ölçülməsi yuxarıda təsvir olunduğu kimi aparıldı. Hüceyrədaxili qlutation konsentrasiyaları E. coli hüceyrələrinin həcminin 6,7×10^-15 litr və hüceyrə sıxlığının A600 0,5 olması əsasında hesablandı (kulturanın hər ml-ində 1×10⁸ hüceyrəyə uyğun gəlir; vahid: hüceyrə ml^-1 kultura). GSH konsentrasiyaları belə hesablandı: 2[GSSG] ümumi qlutationdan çıxıldı. (Müller et al. 2016)

Ultrasəs homogenizatorundan istifadə etməklə insan mAspAT zülalının E. coli-də ekspressiyası

Ekspressiya vektorunu daşıyan E. coli BL21 (DE3)-ün tək koloniyası 100μg/mL ampisillin olan 30 mL Luria-Bertani (LB) mühitinə yerləşdirildi və sonra 37ºC-də yetişdirildi; optik sıxlıq (OD₆₀₀) 0,6-ya çatana qədər yetişdirmə davam etdi. Hüceyrələr 4.000 × g-də 10 min sentrifuqalama ilə toplandı və 100μg/mL ampisillin olan 3L təzə LB mühitində yenidən suspenziyalaşdırıldı.
Daha sonra zülal ekspressiyası 16ºC-də 20 h ərzində 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tioqalaktopiranozid (IPTG) ilə induksiya edildi. Hüceyrələr 8.000 × g-də 15 min sentrifuqalama ilə toplandı və A buferi (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4) ilə yuyuldu. 3 L kulturadan təxminən 45g (yaş kütlə) hüceyrə əldə edildi. Sentrifuqalamadan sonra hüceyrə çöküntüləri 40 mL (1 L kultura üçün) buz kimi soyuq A ekstraksiya buferində yenidən suspenziyalaşdırıldı və Hielscher UP400St ultrasəs hüceyrə parçalayıcısından istifadə etməklə buz kimi soyuq temperaturda ultrasəslə lizisə uğradıldı. Həll olmuş (supernatant) və çökmüş (çöküntü) fraksiyaları ayırmaq üçün hüceyrə lizatı 12.000 rpm-də 15 min sentrifuqalandı. (Jiang et al. 2015)

Əlaqəli mövzular

Bilməyə dəyər faktlar

E.coli

Escherichia coli (E. coli) Escherichia cinsinə aid qram-mənfi, fakultativ anaerob, çubuqşəkilli, koliform bakteriyadır və adətən istiqanlı orqanizmlərin (endotermlərin) bağırsağının aşağı hissəsində rast gəlinir. Müxtəlif xüsusiyyətlərə malik çoxlu sayda E. coli ştammı (və ya alt tipi) mövcuddur. E. coli ştammlarının əksəriyyəti insanlar üçün zərərsizdir; məsələn, laboratoriyalarda tədqiqat məqsədləri üçün geniş istifadə olunan B və K-12 ştammları. Lakin bəzi ştammlar zərərlidir və ciddi xəstəliklərə səbəb ola bilər.
E. coli ilə işləmək asan olduğundan bu bakteriya müasir bioloji mühəndislikdə və sənaye mikrobiologiyasında mühüm rol oynayır. E. coli-nin tez-tez istifadə olunduğu geniş yayılmış laboratoriya tətbiqlərinə, məsələn, rekombinant dezoksiribonuklein turşusunun (DNT) yaradılması və ya model orqanizm kimi istifadə daxildir.
E. coli heteroloji zülalların istehsalı üçün çoxfunksiyalı sahib orqanizmdir və E. coli-də rekombinant zülalların istehsalı üçün çoxsaylı zülal ekspressiya sistemləri mövcuddur. Zülalın yüksək səviyyədə ekspressiyasına imkan verən plazmidlərdən istifadə etməklə genlər bakteriyalara daxil edilə bilər; bu da sənaye fermentasiya proseslərində belə zülalların böyük miqdarlarda istehsalına imkan verir.
E.coli insulin istehsalı üçün hüceyrə fabrikləri kimi istifadə olunur. Digər tətbiqlərə vaksinlərin və immobilizasiya olunmuş fermentlərin hazırlanması və istehsalı, bioyanacaq istehsalı, eləcə də bioremediasiya üçün modifikasiya olunmuş E. coli hüceyrələrindən istifadə daxildir.
K-12 ştammı qələvi fosfataza (ALP) fermentini həddindən artıq ekspressiya edən E. coli mutant formasıdır. Bu mutasiya fermenti daim kodlaşdıran gendəki qüsur səbəbindən baş verir. Gen heç bir inhibisiya olmadan məhsul əmələ gətirirsə, bu, konstitutiv aktivlik adlanır. Bu xüsusi mutant forma ALP fermentinin ayrılması və təmizlənməsi üçün istifadə olunur.
E. coli bakteriyaları hüceyrə fabrikləri kimi də geniş istifadə olunur. Mühəndislik yolu ilə dəyişdirilmiş mikroblar (məsələn, bakteriyalar) və bitki hüceyrələri hüceyrə fabrikləri adlandırılan sistemlər kimi istifadə oluna bilər. Bu genetik modifikasiya olunmuş hüceyrələr, məsələn, əczaçılıq, qida və kimya sənayesində istifadə olunan molekullar, kimyəvi maddələr, polimerlər, zülallar və digər maddələr istehsal edir. Belə biomühəndislik hüceyrələrinin daxilində istehsal olunan molekulları sərbəst buraxmaq üçün ultrasəslə lizis hüceyrə divarlarının parçalanması və hədəf maddələrin ətrafdakı mayeyə keçirilməsi üçün geniş yayılmış üsuldur. Biomühəndislik hüceyrələrinin lizisi haqqında daha çox oxuyun!

DNT-nin ultrasəs kəsilmə qüvvələri ilə parçalanması

Ultrasəs kəsilmə qüvvələri hüceyrə daxilindən molekulların, orqanellərin və zülalların sərbəst buraxılması, həmçinin DNT zəncirlərinin hissələrə bölünməsi üçün geniş istifadə olunan üsuldur. Akustik kavitasiya hüceyrələrdən DNT-ni ekstraksiya etmək üçün hüceyrə divarlarını və membranlarını parçalayır və uzunluğu təxminən 600 – 800 bp olan fraqmentlər yaradır; bu uzunluq analiz üçün idealdır.
DNT fraqmentasiyası üçün ultrasəs homogenizatorları haqqında daha çox məlumat əldə etmək üçün buraya klikləyin!

Ədəbiyyat / İstinadlar

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs! Hielscher məhsul çeşidi yığcam laboratoriya ultrasəs cihazından masaüstü qurğulara və tam sənaye ultrasəs sistemlərinə qədər bütün spektri əhatə edir.

Hielscher Ultrasonics yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs homogenizatorlarını laboratoriya ölçüsündən sənaye ölçüsünədək istehsal edir.