Hielscher Ultrasəs Texnologiyası

E. Coli ultrasəs lizisi

  • E. coli bakteriyaları mikrobiologiya və biotexnologiya ən çox istifadə bakteriyalar var.
  • Ultrasonik mobil pozucular E. coli lizisi üçün etibarlı və reproducible nəticələr verir.
  • Güclü hələ dəqiq nəzarət çuxurluq və kəsmək qüvvələri tam pozulması və yüksək hasilatı verir (məsələn zülallar, DNT) ilə nəticələnəcək.

Çuxurluq ilə Cell pozulması

Escherichia coli bakteriyaları etibarlı ultrasəs toxuma homogenizers istifadə lysed olunur.Ultrasonik probe tipli homogenizers təqribən ilə fəaliyyət göstərir. (20kHz at) saniyədə 20.000 dövründən maye və supsensions ilə boşlama səbəb olur. ayrı hüceyrələri cırmaq vakuum kimi təzyiq və yüksək temperatur Acoustic boşlama mikroskopik sahələri. temperatur bir neçə min dərəcə Selsi çata bilər, baxmayaraq ki, boşlama həcmi onlar əhəmiyyətli dərəcədə prosesi istilik yoxdur, belə ki kiçik. ultrasəs akustik boşlama yaradılan və kəsmək qüvvələri deşmək və ya E.coli mobil membran qırmaq – ultrasəs Homogenizer cihaz qəbulu asılı olaraq.

Ultrasonik lizisi üstünlükləri

  • lizisi dəqiq nəzarət (intensivliyi, amplitude, temperatur)
  • xüsusi nümunələri optimal uyğunlaşması
  • temperatur nəzarət
  • çox kiçik çox böyük nümunələri (litr μL)
  • təmiz mexaniki müalicə
  • istehsal laboratoriya xətti miqyaslı-up
Eyni proses şəraitdə 10 ampula eyni zamanda nümunələrinin hazırlanması üçün imkan verir ki, VialTweeter ultrasəs cihaz. (Böyütmək üçün)

VialTweeter ultrasəs lizisi üçün

İnformasiya tələbi




Bizimlə əlaqə saxlayın Gizlilik Siyasəti.


kimya və enzymtic lizisi problemli ola bilər baxmayaraq – protein strukturları dəyişdirmək və təmizlənməsi problemləri və ferment lizisi təqdim edə bilər kimyəvi lizisi uzun inkubasiya dəfə tələb edir və reproducible deyil bəri – ultrasəs pozulması inkişaf etmiş bir, fast mobil pozulması metodudur.
Ultrasonik liziz yalnız mexaniki qüvvələrə əsaslanır. Heç bir kimyəvi maddə əlavə edilmir, sonication kəsici qüvvələr tərəfindən hüceyrə divarını pozur. Kimyəvi lizis protein strukturunu dəyişdirə və təmizlənmə problemlərini təqdim edə bilər. enzimatik pozulma uzun inkubasiya müddətləri tələb edir və təkrarlanmazdır.

General tövsiyələr

flow reaktoru ilə UP400St ultrasonicatorSonication mobil suspensions çox kiçik, orta və böyük miqdarda təsviri üçün ən məşhur texnika – 100L / saat qədər pico-litr (ultrasəs axını mobil istifadə edərək,). Cells maye kəsmək və kavitasiyasının tərəfindən lysed olunur. DNA də sonication zamanı qırxılmış, belə ki, mobil dayandırılması DNase əlavə etmək lazım deyil.
Temperatur nəzarət:
nümunə pre-soyutma və buz üzərində sonication zamanı nümunə tutaraq, nümunə istilik deqradasiyası asanlıqla önlənə bilər nümunə.
İdeal olaraq, nümunələr lizis zamanı buzlanmağa məruz qalmalıdır, lakin temperatur temperaturu mədəniyyət və ya toxuma mənbəyindən yuxarı qalmırsa, əksər nümunələr üçün kifayətdir. Buna görə, süsənni buz üzərində saxlamaq və bir neçə qısa ultrasonik paxlalı ilə sonicate etmək və 5-10 saniyə dayandırmaq və 10-30 saniyə dayandırmaq məsləhətdir. Duraklamalar zamanı istilik aşağı temperaturun yenidən qurulması üçün dağılır. Daha böyük hüceyrə nümunələri üçün soyuducu gödəkçələr olan müxtəlif akışlı hüceyrə reaktorları mövcuddur.

E. Coli Lysates hazırlanması üçün protokollar

Expression təhlili və rekombinant protein təmizlənməsi

E. coli kürəcik ultrasəs sistemi ilə sonicated edilmişdir UP100H (Hielscher). Bu məqsədlə, mobil kürəcik soyudulmuş lizisi bufer (50 mM Tris-HCl pH = 7.5, 100 mM NaCl, 5 mm DTT 1 mM PMSF) ilə təkrar asıldı 10 min buz soyudulur. Sonra mobil körpü soyutma 30 s interval sonra 10 s 10 qısa bursts ilə sonicated edilib. Nəhayət, mobil zibil 14000 rpm-da 15 min 4 ° C ultracentrifugation qaldırıldı. Rpr ifadə təsdiq üçün, supernatant 12% poliakrilamid gel run edilib və SDS-SƏHİFƏ və Qərb basma tərəfindən təhlil. Rpr təmizlənməsi Ni istifadə edildi2 +-NTA qatran istehsalçının bələdçi görə (Invitrogen, ABŞ). Bu mərhələdə, doğma təmizləyici metodu istifadə edilmişdir. təmizlənmiş protein təmizlik 12% poliakrilamid gel və sonrakı Coomassie mavi boyanma haqqında elektroforez istifadə qiymətləndirilmişdir. Təmizlənmiş zülal konsentrasiyası Micro BCA zülal təhlil dəsti (PIERCE, ABŞ) tərəfindən qiymətləndirilir edilib. (Azarnezhad et al. 2016)

lizisi, mobil pozulması və DNT shearing üçün Ultrasonik mobil Topu UP100H (100W).

Ultrasonik homogenizer UP100H (100W)

Cell artım, Crosslinking və E. coli Cell Özləri hazırlanması

SeqA və RNT polimeraza çip-Chip E. coli MG1655 ya MG1655 ΔseqA üçün OD 37 ° C artıb600 50 ml LB (+ 0.2% glyukoza) içərisində 0.15 mL-dən 27 ml'lik bir formaldehid (37%) ml orta maddəyə əlavə edildi (son konsantrasiya 1%). Çapraz bağlama 20 mq qədər otaq temperaturunda yavaş sarsıntıda (100 rpm), 10 ml 2.5 M glisinlə (son konsantrasyon 0.5 M) söndürmə ilə həyata keçirildi. İstilik şoku təcrübələri üçün, E. coli MG1655, 65 ml LB ortamında 30 ° C'de bir OD600 təxminən 0.3. Sonradan 30 ml mədəniyyət 43 ° C-də əvvəlcədən istilənilən şüşəya köçürülmüş, qalan hissəsi 30 ° C-də saxlanılmışdır. Çapraz bağlama və söndürmə yuxarıda göstərildiyi kimi idi ki istisna olmaqla, hüceyrələr otaq temperaturunda daha yavaş sarsılmadan əvvəl 5 və ya 30 ° C'de saxlanılırdı. Hücrelər santrifüqasiya ilə toplanmış və soyuq TBS (pH7.5) ilə iki dəfə yuyulmuşdur. 1 mL lizis tamponu (10 mM Tris (pH 8.0), 20% sukroz, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lizozim) və 30 dəqiqə 37 ° C-də inkübasyondan sonra 4 ml İP bufer, hüceyrələr 12 dəfə 30 saniyə və 30 saniyəlik buz ilə sonicated edilmişdir UP400St Ultrasəs prosessor 100% gücü ilə (Hielscher ultrason GmbH). 9000 g 10 min sentrifuqa sonra supernatant 800 μl aliquotes -20 ° C saxlanılır. (2010 Waldminghaus)

Overproduction və fermentlərin təmizlənməsi.

decahistidine (His10) Tagged zülalların overproduction üçün E. coli BL21 (DE3) pET19b inşa ilə çevrildi. Bir gecədə preculture sentrifuqa ilə yığılmış edilib və 1% ifadə mədəniyyət calamaq üçün istifadə edilmişdir. pET19mgtB daşıyan Cells OD (600 nm bir optik sıxlığı qədər 22 ° C yetişib600) 0,7. mədəniyyət 17 ° C köçürülür və 100 mkm IPTG induksiya edilmişdir. 16 saat sonra, mədəniyyət 4 ° C 7,500 × q sentrifuqa ilə yığılmış edilmişdir. Cells bir S2 mikro-tip sonotrode ilə ultrasonication tərəfindən pH 7,4 0,3 M NaCl 50 mM fosfat-buffered şoran (PBS) və resuspended və pozularsa edilmişdir UP200St 0.5 dövrü və 75% -i amplituda da ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Almaniya).
decahistidine-tagged GtfC overproduction bir OD 37 ° C induksiya edildi600 100 mkm IPTG ilə 0,6. Cells sonra 4 saat Soğutmalı yığılmış və MgtB üçün yuxarıda qeyd edildiyi kimi lysed edilmişdir.
Crude mobil çıxarışların mobil zibil çöküntülərdə 15,000 × q və 4 ° C centrifuged edilmişdir. aydınlıq çıxarışların bir ÄKTAprime Plus sistemi (GE Healthcare) istifadə 1-ml HisTrap FF Crude sütun üzərində yüklü edilmişdir. fermentlər Onun-tagged zülalların gradient elution üçün istehsalçının protokola görə pak idi. Eluted protein həlləri 4 ° C 0,3 M NaCl ilə 50 mM PBS, pH 7.4 1000 həcmdə qarşı iki dəfə dialyzed edilmişdir. təmizləyici 12% SDS-SƏHİFƏ tərəfindən təhlil edilmişdir. zülal konsentrasiyası Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Almaniya) istifadə Bradford üsulu ilə təyin olundu. (Rabausch et al. 2013)

E. coli Bakteriyalar olan Zülal hasilatı
Maraq A yemi zülal (bu halda, Arabidopsis thaliana of MTV1) bir GST tag əridilmiş və BL21 Escherichia coli (E. coli) hüceyrələri dilə gətirdi.
1. (50 ml bakterial mədəniyyət müvafiq) GST-MTV1 və GST bir kürəcik edin və 2,5 ml buz hasilatı bufer hər resuspend.
2. ultrasonicator istifadə UP100H onlar lysed olunur aşağı qeyri-şəffaflıq və artan özlülük tərəfindən göstərilən olan qədər bakterial hüceyrələri pozmaq (kiçik həcmdə MS3 microtip-sonotrode (2-5mL) ilə təchiz). Bu buz üzərində həyata keçirilir var və bu, (məsələn 10 sec sonicating belə 10 buz san və izlədi) fasilələrlə sonicate etmək tövsiyə olunur. Care çox yüksək intensivliyi ilə sonicate üçün qəbul edilməlidir. köpük və ya ağ precipitate formalaşması aşkar olunarsa, intensivliyi aşağı olmalıdır.
3. 4 ° C 20 min, 16,000 x g at lysed bakteriya 1,5 ml Mikrosantrifüj borular həll və sentrifuqaların Transfer.

E. coli in allicin redaktə zülallar

VialTweeter kiçik bir nümunə homogenization üçün rahat ultrasonicator deyil5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic turşusu) (DTNB) Assay ilə Sulfhydryl Contents təyini
An E. coli MG1655 gecə mədəniyyət mops minimal orta (100 1) calamaq üçün istifadə edilmişdir. 0,4 bir A600 çatdı qədər mədəniyyət aerobically artıb. mədəniyyət stress müalicə üçün üç 15 ml mədəniyyətlər parçalanması edilmişdir. An təmizlənməmiş mədəniyyət mənfi nəzarət kimi xidmət etmişdir. 0.79 mM allicin (128 mkq ml-1) Və ya 1 mM diamide qalan iki mədəniyyətlərin hər biri əlavə olundu. Cultures 15 min Soğutmalı edilmişdir. Hər mədəniyyət 5 ml sentrifuqa (8,525 × q, 4 ° C, 10 min) tərəfindən yığılıb. Cells PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 1 ml iki dəfə yuyulur2HPO42 mM KH2PO4, PH 7.4) 13000 × q, 4 ° C, 10 min (anaerobically əvvəl istifadə saxlanılır) və mərkəzdənqaçma. Cells ultrasonication 4 ° C əvvəl pozulması (6 mM guanidinium HCl, pH 7.4 ilə PBS) lysis bufer resuspended edildi (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Almaniya) (3 × 1 dəq). Cell zibil sentrifuqa (13,000 × q, 4 ° C, 15 min) tərəfindən yemlə edilib. supernatant maqnit stir bar ilə 3,5 ml QS-makro Cuvette (10 mm) köçürülür və lizisi bufer 1 ml ilə qarışdırılır edilmişdir. nümunələri Extinction otaq temperaturunda PSC-718 temperatur nəzarət mobil sahibi (Jasco) ilə təchiz olunmuş Jasco V-650 spektrometri ilə 412 nm monitorinq keçirilib. 3 mM dithiobis (2-nitrobenzoic turşusu) həll 100μl əlavə edildi. Bu doyma çatdı qədər Extinction monitorinq keçirilib. thiol konsentrasiyası hesablanması extinction əmsalı ε istifadə edərək həyata keçirilib412 = 13,700 M-1 santimetr-1 Thio-2-nitrobenzoic turşusu (TNB) üçün. Cellular thiol konsentrasiyası 6,7 × 10 E. coli hüceyrələri həcmi əsasında hesablanır edilmişdir-15 litr və A mobil sıxlığı600 = 0.5 (ekvivalent 1 × 108 hüceyrələri ml-1 mədəniyyət). (Müller et al. 2016)

Vivo Glutatyon müəyyən In

E.coli MG1655 A qədər 200ml ümumi həcmi mops minimal orta artıb600 0.5 çatdı. mədəniyyət stress müalicə üçün 50 ml mədəniyyətlər parçalanması edilmişdir. 0.79 mM allicin 1 mM diamide, və ya dimethyl sulfoxide (nəzarət) ilə inkubasiya 15 min sonra hüceyrələri 10 min 4 ° C 4,000g yığılmış edilmişdir. Cells əvvəl KPE bufer 700μl ilə qranullar Resuspension üçün KPE bufer ilə iki dəfə yuyulur edilmişdir. deproteination üçün 10% 300L (w / v) sulfosalicylic turşusu əvvəl ultrasonication (3 x 1 min by hüceyrələri pozulması əlavə edilmişdir; VialTweeter ultrasonicator). Supernatants (30 min, 13,000g, 4 ° C) sentrifuqa sonra toplandı. Sulfosalicylic turşusu konsentrasiyası KPE bufer 3 cilddə əlavə 1% -ə azalmışdır. ümumi glutatyon və GSSG of Ölçmələr yuxarıda təsvir kimi edildi. Cellular glutatyon konsentrasiyaları E. həcmi əsasında hesablanır edilmişdir 6.7 hüceyrələri coli×10-15 litr və A mobil sıxlığı600 01 .5 (ekvivalent×108 hüceyrələri ml-1 mədəniyyət). GSH konsentrasiyaları ümumi glutatyon 2 [GSSG] çıxarılması ilə hesablanmışdır. (Müller et al. 2016)

mobil lizisi və bioloji material çıxarılması üçün ultrasəs Topu (Böyütmək üçün)

Probe tipli ultrasonicator UP400St

E. coli İnsan mAspAT İfadə

hüceyrədaxili məsələnin çıxarılması üçün Ultrasonik mobil Topu UP400St (400W) (məsələn zülallar, organelles, DNT, RNT və s.)optik sıxlığı qədər 37ºC-də becərilən tək Luria-Bertani (LB) orta tərkibli 100μg / mL ampisillinə 30 ml ifadə vektor sığınacaq E. coli BL21 müstəmləkəsi (DE3), sonra (OD600) 0.6 çatdı. hüceyrələri 10 min 4000 × q sentrifuqa ilə yığılmış və 100μg / mL ampisillin olan 3L təzə LB orta resuspended edildi.
Daha sonra, protein ifadə 16ºC 20 saat üçün 1 mM izopropil β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ilə induksiya edilmişdir. hüceyrələri 15 min 8000 × q sentrifuqa ilə yığılmış və bufer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7.4) ilə yuyulur edilmişdir. Uyğunlaşdırılmalıdır 45g (yaş çəki) hüceyrələri 3 L mədəniyyət əldə edildi. sentrifuqa sonra, mobil qranullar buz hasilatı bufer A (1 L mədəniyyət üçün) 40 ml təkrar asıldı və istifadə buz temperaturda ultrasonication tərəfindən lysed UP400St alət (Dr. Hielscher GmbH, Almaniya). mobil lizisi həll (supernatant) və çökdürülmüş (kürəcik) fraksiyaları ayrı-ayrı 15 min 12,000 rpm centrifuged edilib. (Jiang et al. 2015)

Aşağıdakı cədvəldə bizim ultrasonicators təxmini emal gücü bir göstəriş verir:

Partiyanın həcmi Axın tövsiyə Cihazlar
01.5ml .5 na VialTweeter
1 500ml 10 200ml / dəq UP100H
10 2000ml üçün 20 400ml / dəq Uf200 ः t, UP400St
0.1 20L üçün 04L / min .2 UIP2000hdT
10 100L üçün 10L 2 / dəq UIP4000
na 10 100L / dəq UIP16000
na daha böyük çoxluq UIP16000

Bizimlə əlaqə saxlayın! Bizdən soruşun!

Ultrasonik homogenizasiya haqqında əlavə məlumat tələb etmək istəyirsinizsə, aşağıdakı formu istifadə edin. Sizin tələblərinizə cavab verən ultrasəs sistemi təklif etməkdən şadıq.









Xahiş edirik unutmayın Gizlilik Siyasəti.


Ədəbiyyat / Referanslar



Bilmək lazımdır

E.coli

Escherichia coli (E. coli) bir qram-mənfi, facultatively anaerob, rod formalı, çox isti qanlı orqanizmlərin (endotherms) aşağı bağırsaq aşkar növlü Escherichia of coliform bakteriya. E. çox sayda müxtəlif xüsusiyyətləri ilə suşlarının (və ya alt) coli var. Ən E. coli suşlarının məsələn insanlar üçün zərərsiz laboratoriyalarda tədqiqat proqramları üçün çox istifadə olunur B və K-12 suşlarının. Lakin, bəzi suşlarının zərərli və ciddi xəstəlik səbəb ola bilər.
bakteriyalar manipulyasiya etmək asandır, çünki E. coli müasir bioloji mühəndislik və sənaye mikrobiologiya mühüm rol oynayır. E. coli, məsələn tez-tez istifadə edilə Common laboratoriya applications rekombinant dezoksiribonuklein turşusu (DNT) yaratmaq və ya bir model orqanizm kimi hərəkət etmək.
E. coli heterologous zülal istehsalı üçün çox yönlü host və manifold protein ifadə sistemləri E. coli rekombinant zülalların istehsal mövcuddur. zülal yüksək səviyyədə ifadə icazə plasmids istifadə edərək, gen sənaye fermentasiya proseslərinin yüksək miqdarda belə zülal istehsal etməyə imkan verir bakteriya daxil edilə bilər.
E.coli insulin istehsal mobil fabriklər kimi istifadə olunur. Əlavə applications inkişaf etdirmək və bioyanacaq istehsal, eləcə də bioremediasiya üçün vaksinlər və immobilizə fermentlər istehsal redaktə E. coli hüceyrələri istifadə daxildir.
gərginlik K-12 E. bir mutant forma ferment Qələvi fosfataza (ALP) həddindən artıq ifadə edən coli edir. Bu mutasiya səbəbiylə ferment üçün daim kodları gen bir qüsur baş verir. bir gen hər hansı bir inhibe olmadan məhsul istehsal bu təsis fəaliyyəti kimi tanınır. Bu xüsusi mutant forma təcrid və təmizlənməsi ALP ferment üçün istifadə olunur.

Ultrasonik DNA Shearing

Ultrasonik kəsmək qüvvələri hüceyrə ayrı və parçalara DNA liflər qırmaq üçün istifadə olunan metodu var. Acoustic çuxurluq mobil divarları və membranların hüceyrələri DNT çıxarış və 600 fraqmentləri yaratmaq üçün pozur – analiz üçün ideal uzunluğu 800 bp.
DNA parçalanma üçün ultrasəs homogenizers haqqında daha ətraflı məlumat üçün buraya basın!