E. Coli-nin ultrasəs lizisi
- E. coli bakteriyaları mikrobiologiya və biotexnologiyada ən çox istifadə edilən bakteriyalardır.
- Ultrasəs hüceyrə pozucuları E. coli-nin parçalanması üçün etibarlı və təkrarlana bilən nəticələr verir.
- Güclü, lakin dəqiq idarə olunan kavitasiya və kəsmə qüvvələri tam pozulma və yüksək ekstraksiya məhsuldarlığı (məsələn, zülallar, DNT) ilə nəticələnir.
Niyə E. coli-nin Ultrasəs Hüceyrəsinin pozulmasına üstünlük verilən üsuldur?
Ultrasəs homojenizatorları və ya zond tipli ultrasəs cihazları E. coli lizisi üçün bir sıra üstünlüklər təklif edir, çünki intensiv ultrasəs hüceyrə divarlarını və membranlarını effektiv şəkildə pozur. Zond tipli ultrasəs cihazları aşağıdakı səbəblərə görə E. coli lizisi üçün geniş istifadə olunur:
E.coli hüceyrələrindən zülal çıxarılması effektiv şəkildə həyata keçirilir ultrasəs zondu UP200St
Prob tipli ultrasəs cihazı E. coli lizisi üçün bir çox üstünlüklər təklif edir. Ultrasəs proses parametrləri üzərində etibarlı və dəqiq nəzarət istənilən nəticələrə nail olmaq üçün güc, müddət və nümunə ilə işləmə kimi əməliyyat parametrlərini optimallaşdırmağa imkan verir.
E. coli EDL933-ün genomik DNT-nin elektroforetik analizləri 0 – 15 dəqiqə ultrasəslənməyə məruz qalır. L DNT nərdivanını göstərir.
(tədqiqat və şəkil: ©Basselet et al. 2008)
Ultrasəs kavitasiyasından istifadə edərək hüceyrənin pozulması
Ultrasonik prob tipli homogenizatorlar təqribən ilə işləyir. Saniyədə 20.000 dövrə (20kHz-də) və mayelərdə və ya süspansiyonlarda kavitasiyaya səbəb olur. Hüceyrələri parçalayan vakuuma bənzər təzyiqlərin və yüksək temperaturun akustik kavitasiya mikroskopik sahələri. Temperatur bir neçə min dərəcə Selsiyə çatsa da, kavitasiya həcmi o qədər kiçikdir ki, prosesi əhəmiyyətli dərəcədə qızdırmır. Ultrasəs nəticəsində yaranan akustik kavitasiya və kəsici qüvvələr E.coli kimi bakteriya hüceyrələrinin hüceyrə membranını perforasiya edir və ya qırır. Hielscher ultrasonicators ultrasəs intensivliyi, amplituda, enerji girişi və temperatur kimi proses parametrləri üzərində dəqiq nəzarət etməyə imkan verir. Beləliklə, ultrasəs lizis prosesi hüceyrə növünə, hüceyrə mədəniyyətinə və prosesin məqsədinə optimal şəkildə düzəldilə bilər.
- lizisin dəqiq nəzarəti (intensivlik, amplituda, temperatur)
- etibarlı, təkrarlana bilən nəticələr
- xüsusi nümunələrə optimal uyğunlaşma
- Temperatur nəzarəti
- çox kiçikdən çox böyük nümunələr üçün (µL - litr)
- Sırf mexaniki müalicə
- istifadəçi dostu, təhlükəsiz əməliyyat
- laboratoriyadan istehsala qədər xətti miqyas
VialTweeter ultrasəs lizis üçün
Ultrasəs Homogenizatoru Digər Lizis Texnikalarına qarşı
Kimyəvi və enzimatik liziz problemli ola bilər – kimyəvi lizis zülal strukturlarını dəyişdirə və təmizlənmə problemləri yarada bildiyindən və fermentativ lizis uzun inkubasiya müddəti tələb edir və təkrar istehsal olunmur. – ultrasəs pozulması mürəkkəb, sürətli hüceyrə parçalanması üsuludur.
Ultrasəs lizis yalnız mexaniki qüvvələrə əsaslanır. Kimyəvi maddələr əlavə edilmir, sonikasiya kəsmə qüvvələri ilə hüceyrə divarını pozur. Kimyəvi lizis zülalın strukturunu dəyişdirə və təmizlənmə problemləri yarada bilər. Fermentlərin pozulması uzun inkubasiya müddəti tələb edir və təkrar istehsal olunmur. E.coli bakteriya hüceyrələrinin ultrasəs hüceyrələrinin pozulması sürətli, sadə, etibarlı və təkrarlana bilir. Buna görə də Hielscher ultrasəs aparatları dünyanın bioloji və biokimyəvi laboratoriyalarında nümunə hazırlamaq, analitikdən əvvəl, in-vitro diaqonstika və manifold analizləri üçün istifadə olunur.
Ultrasonik Lizis üçün Ümumi Tövsiyələr
Sonication çox kiçik, orta və böyük miqdarda hüceyrə süspansiyonlarını parçalamaq üçün ən məşhur texnikadır. – pikolitrdən 100L/saata qədər (ultrasəs axını hüceyrəsindən istifadə etməklə). Hüceyrələr maye kəsilməsi və kavitasiya ilə parçalanır. Sonikasiya zamanı DNT də kəsilir, ona görə də hüceyrə suspenziyasına DNase əlavə etmək lazım deyil.
Ultrasonik E.coli lizisi zamanı temperaturun idarə edilməsi
Nümunəni qabaqcadan soyudaraq və sonikasiya zamanı nümunəni buzda saxlamaqla nümunənin termal deqradasiyasının qarşısını asanlıqla almaq olar.
İdeal olaraq nümunələr lizis zamanı buz kimi saxlanılmalıdır, lakin əksər nümunələr üçün temperaturun mədəniyyətin və ya toxuma mənbəyinin temperaturundan yuxarı qalxmaması kifayətdir. Buna görə də, suspenziyanı buz üzərində saxlamaq və 5-10 saniyəlik bir neçə qısa ultrasəs impulsları və 10-30 saniyəlik fasilələrlə sonikasiya etmək tövsiyə olunur. Fasilələr zamanı aşağı temperaturu bərpa etmək üçün istilik yayıla bilər. Daha böyük hüceyrə nümunələri üçün soyutma gödəkçələri olan müxtəlif axın hüceyrə reaktorları mövcuddur.
Uğurlu ultrasəs lizis üçün ətraflı məsləhətləri və tövsiyələri burada oxuyun!
E. Coli Lizatlarının Ultrasonik Hazırlanması üçün Protokollar
Tədqiqatçılar E.coli hüceyrələrinin pozulması üçün Hielscher ultrasəs homogenizatorlarından istifadə edirlər. Aşağıda müxtəlif E. coli ilə əlaqəli tətbiqlər üçün Hielscher ultrasəs homogenizatorlarından istifadə edərək E.coli lizisi üçün müxtəlif sınaqdan keçirilmiş və sübut edilmiş protokolları tapa bilərsiniz.
Hüceyrələrin böyüməsi, çarpaz bağlanması və ultrasəsdən istifadə edərək E. coli hüceyrə ekstraktlarının hazırlanması
SeqA və RNT polimeraza ChIP-Chip E. coli MG1655 və ya MG1655 üçün ΔseqA 37°C-də OD-yə qədər böyüdüldü.600 ml mühitə 27 μl formaldehid (37%) əlavə edilməzdən əvvəl 50 ml LB-də təxminən 0,15 (+ 0,2% qlükoza) (son konsentrasiya 1%). Çarpaz bağlama yavaş silkələnmədə (100 rpm) otaq temperaturunda 20 dəqiqə ərzində aparıldı, sonra 10 ml 2,5 M qlisin (son konsentrasiya 0,5 M) ilə söndürüldü. İstilik şoku təcrübələri üçün E. coli MG1655 65 ml LB mühitində 30°C temperaturda OD-yə qədər böyüdüldü.600 təxminən 0,3. Sonradan 30 ml mədəniyyət 43°C-də əvvəlcədən isidilmiş kolbaya köçürüldü, qalanı isə 30°C-də saxlanıldı. Çarpaz bağlama və söndürmə yuxarıda təsvir edildiyi kimi idi, istisna olmaqla, hüceyrələr otaq temperaturunda daha yavaş silkələnmədən əvvəl 5 dəqiqə 30 və ya 43 ° C-də saxlanıldı. Hüceyrələr sentrifuqa ilə toplanmış və iki dəfə soyuq TBS (pH7.5) ilə yuyulmuşdur. 1 ml lizis buferində (10 mM Tris (pH 8.0), 20% saxaroza, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mq/ml lizozim) yenidən suspenziyadan və 30 dəqiqə ərzində 37°C-də inkubasiyadan sonra, ardınca 4 ml İP əlavə edilir. bufer, hüceyrələr 100% güc parametrində Hielscher ultrasəs prosessoru UP400St istifadə edərək, 12 dəfə 30 saniyə və 30 saniyə fasilələrlə buz üzərində ultrasəs edildi. 9000 q-da 10 dəqiqə sentrifuqa edildikdən sonra, supernatantın 800 μl aliquotes -20 ° C-də saxlanıldı. (Waldminghaus 2010)
Ultrasonik prob ilə fermentlərin həddindən artıq istehsalı və təmizlənməsi
Dekahistidin (His10) ilə işarələnmiş zülalların həddindən artıq istehsalı üçün E. coli BL21(DE3) pET19b konstruksiyaları ilə çevrilmişdir. Bir gecəlik prekultura sentrifuqa yolu ilə yığıldı və 1% ifadə mədəniyyətini aşılamaq üçün istifadə edildi. pET19mgtB daşıyan hüceyrələr 600 nm (OD600) 0,7 optik sıxlığa qədər 22°C-də böyüdüldü. Mədəniyyət 17°C-yə köçürüldü və 100 μM IPTG ilə induksiya edildi. 16 saatdan sonra mədəniyyət 4°C-də 7500 × g-də sentrifuqa ilə yığıldı. Hüceyrələr pH 7.4-də 0.3 M NaCl ilə 50 mM fosfat tamponlu şoran məhlulunda (PBS) yenidən dayandırıldı və Hielscher ultrasəs cihazı UP200St-də 0.5 və amp 75% bir dövrədə S2 mikro-ucu sonotrodu ilə ultrasəslə pozuldu.
Dekahistidin etiketli GtfC-nin həddindən artıq istehsalı OD-də 37°C-də induksiya edilmişdir.600 100 μM IPTG ilə 0,6. Hüceyrələr daha sonra 4 saat inkubasiya edildi, yığıldı və MgtB üçün yuxarıda göstərildiyi kimi parçalandı.
Xam hüceyrə ekstraktları hüceyrə zibilini çökdürmək üçün 15,000 × g və 4 ° C-də sentrifuqa edilmişdir. Aydınlaşdırılmış ekstraktlar ÄKTAprime Plus sistemindən istifadə edərək 1 ml HisTrap FF Crude sütunlarına yüklənmişdir. Fermentlər His etiketli zülalların gradient elüsyonu üçün istehsalçının protokoluna uyğun olaraq təmizləndi. Elut edilmiş zülal məhlulları 4°C-də 0,3 M NaCl ilə 50 mM PBS, pH 7.4, 1000 həcmə qarşı iki dəfə dializ edilmişdir. Təmizləmə 12% SDS-PAGE ilə təhlil edilmişdir. Zülalın konsentrasiyası Roti-Quant istifadə edərək Bradford üsulu ilə müəyyən edilmişdir. (Rabausch et al. 2013)
E. coli bakteriyasından zülalın ultrasəs çıxarılması
Maraqlanan yem zülalı (bu halda, Arabidopsis thaliana'nın MTV1) GST etiketinə birləşdirilir və BL21 Escherichia coli (E. coli) hüceyrələrində ifadə edilir.
- GST-MTV1 və GST-dən bir qranul götürün (50 ml bakterial mədəniyyətə uyğundur) və hər birini 2,5 ml buz soyuducu ekstraksiya tamponunda yenidən dayandırın.
- Bakterial hüceyrələri parçalanana qədər pozmaq üçün ultrasəs cihazı UP100H istifadə edin (təxminən 2-5ml kiçik həcmlər üçün MS3 mikrotip-sonotrodu ilə təchiz olunub), bu, azalmış qeyri-şəffaflıq və artan özlülük ilə ifadə edilir. Bu buz üzərində aparılmalıdır və fasilələrlə sonikasiya etmək tövsiyə olunur (məsələn, 10 saniyə sonikasiya, sonra buzda 10 saniyə fasilə və s.). Çox yüksək intensivliklə sonikasiya etməməyə diqqət yetirilməlidir. Köpüklənmə və ya ağ çöküntünün meydana gəlməsi aşkar edilərsə, intensivliyi azaltmaq lazımdır.
- Lizis olunmuş bakteriya məhlulunu 1,5 mL mikrosentrifuqa borularına köçürün və 4°C, 16,000 xq-da 20 dəqiqə sentrifuqa edin.
UP400St kimi zond tipli ultrasəs cihazları E.coli-nin səmərəli lizisi üçün akustik kavitasiyanın iş prinsipindən istifadə edin.
Sonikasiyadan istifadə edərək rekombinant zülalın ifadə analizi və təmizlənməsi
E. coli qranulları Hielscher ultrasəs cihazı UP100H ilə ultrasəs edildi. Bu məqsədlə hüceyrə qranulları soyudulmuş lizis tamponunda (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) yenidən dayandırıldı və 10 dəqiqə ərzində buz üzərində soyudu. Sonra hüceyrə süspansiyonu 10 saniyəlik 10 qısa partlayışla, sonra soyutma üçün 30 saniyəlik fasilə ilə sonikləşdirildi. Nəhayət, hüceyrə zibilləri 14000 rpm-də 15 dəqiqə 4 ° C-də ultrasentrifuqa ilə çıxarıldı. rPR ifadəsinin təsdiqi üçün supernatant 12% poliakrilamid gel üzərində işlədilmiş və SDS-PAGE və Western blotting ilə təhlil edilmişdir. rPR-nin təmizlənməsi istehsalçı təlimatına uyğun olaraq Ni2+-NTA qatranı (Invitrogen, ABŞ) istifadə edilməklə aparılmışdır. Bu mərhələdə yerli təmizləmə üsulundan istifadə edilmişdir. Təmizlənmiş zülalın saflığı 12% poliakrilamid gel üzərində elektroforez və sonradan Coomassie mavi rəngə boyanma üsulu ilə qiymətləndirilib. Təmizlənmiş protein konsentrasiyası Micro BCA protein analiz dəsti (PIERCE, ABŞ) ilə ölçüldü. (Azarnezhad et al. 2016)
E. coli lizisi üçün ultrasəs homojenizatorları
Hielscher Ultrasonics, E. coli bakteriyasının və digər hüceyrə növlərinin, toxumalarının və hüceyrə mədəniyyətlərinin etibarlı və səmərəli lizisi üçün yüksək performanslı ultrasəs homogenizatorları dizayn edir, istehsal edir və təmin edir.
Ultrasəs zondlarının, eləcə də dolayı sonikasiya sistemlərinin geniş portfeli sizə hüceyrənin pozulması və çıxarılması tətbiqi üçün ideal ultrasəs toxuma homogenizatorunu təklif etməyə imkan verir.
Dizayn, İstehsalat və Konsaltinq – Keyfiyyətli Almaniya istehsalı
Hielscher ultrasəs cihazları ən yüksək keyfiyyət və dizayn standartları ilə tanınır. Ağıllı proqram təminatı, intuitiv menyu, proqramlaşdırıla bilən parametrlər və avtomatik məlumat protokolu Hielscher ultrasəs cihazının yalnız bir neçə xüsusiyyətləridir. Sağlamlıq və asan əməliyyat bizim ultrasəs aparatlarımızın tədqiqat və biotexnoloji obyektlərə rahat inteqrasiyasına imkan verir. Hətta kobud şərtlər və tələbkar mühitlər Hielscher ultrasəs cihazları tərəfindən asanlıqla idarə olunur.
Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikatlı bir şirkətdir və ən müasir texnologiya və istifadəçi dostu olan yüksək performanslı ultrasəs cihazlarına xüsusi diqqət yetirir. Əlbəttə ki, Hielscher ultrasəs cihazları CE-yə uyğundur və UL, CSA və RoHs tələblərinə cavab verir.
Aşağıdakı cədvəl ultrasəs cihazlarımızın təxmini emal qabiliyyətinin göstəricisini verir:
| Partiya Həcmi | Axın | Tövsiyə olunan Cihazlar |
|---|---|---|
| çox quyulu / mikrotitr plitələr | na | UIP400MTP |
| Flakonlar və ya stəkanlar üçün CupBuynuz | na | Ultrasonik Kubok Horn |
| ultrasəs mikro axın reaktoru | na | GDmini2 |
| 0,5-1,5 mL olan 10 flakona qədər | na | VialTweeter |
| 0,5 - 1,5 ml | na | VialTweeter |
| 1 ilə 500 ml | 10-200 ml/dəq | UP100H |
| 10 ilə 2000 ml | 20 - 400 ml/dəq | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 - 20L | 0.2 ilə 4L/dəq | UIP2000hdT |
| 10-100 l | 2 ilə 10 L / dəq | UIP4000 |
| na | 10-100 l/dəq | UIP16000 |
| na | daha böyük | klaster UIP16000 |
Bizimlə əlaqə saxlayın! / Bizdən soruşun!
Ultrasonik E. coli lizisi üçün əlavə protokollar
Ultrasonik VialTweeter istifadə edərək E. coli-də allisin dəyişdirilmiş zülallar
Sulfhidril tərkibinin 5,5′-Ditiobis (2-nitrobenzoy turşusu) (DTNB) analizi ilə təyini
MOPS minimal mühitini (1:100) aşılamaq üçün E. coli MG1655 gecə mədəniyyətindən istifadə edilmişdir. A600 0,4-ə çatana qədər mədəniyyət aerobik şəkildə yetişdirildi. Stress müalicəsi üçün mədəniyyət üç 15 ml kulturaya bölündü. Müalicə olunmamış mədəniyyət mənfi nəzarət rolunu oynayır. Qalan iki kulturanın hər birinə 0,79 mM allisin (128 μg ml-1) və ya 1 mM diamid əlavə edildi. Mədəniyyətlər 15 dəqiqə inkubasiya edildi. Hər mədəniyyətdən 5 ml sentrifuqalama yolu ilə yığılmışdır (8,525 × g, 4°C, 10 dəq). Hüceyrələr iki dəfə 1 ml PBS ilə yuyuldu (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, istifadədən əvvəl anaerob olaraq saxlanıldı) və sentrifuqa edildi (13.000 × 10 ° C,). Hüceyrələr ultrasəslə 4°C-də pozulmazdan əvvəl lizis tamponunda (6 mM guanidinium HCl, pH 7.4 ilə PBS) yenidən dayandırıldı (VialTweeter ultrasəs cihazı, Hielscher GmbH, Almaniya) (3 × 1 dəq). Hüceyrə zibilləri sentrifuqalama (13,000 × g, 4 °C, 15 dəq) ilə peletlənmişdir. Supernatant maqnit qarışdırıcı çubuğu olan 3,5 ml QS-makrokyuvetə (10 mm) köçürüldü və 1 ml lizis tamponu ilə qarışdırıldı. Nümunələrin sönməsi otaq temperaturunda PSC-718 temperaturu ilə idarə olunan hüceyrə tutucusu ilə təchiz edilmiş Jasco V-650 spektrofotometri ilə 412 nm-də nəzarət edildi. 100μl 3 mM ditiobis (2-nitrobenzoy turşusu) məhlulu əlavə edildi. Sönmə doyma səviyyəsinə çatana qədər izlənilirdi. Tiol konsentrasiyasının hesablanması ϵ sönmə əmsalı ilə aparılmışdır412 = 13,700 M-1 sm-1 tio-2-nitrobenzoic turşusu (TNB) üçün. Hüceyrə tiol konsentrasiyası 6,7 × 10 E. coli hüceyrələrinin həcminə əsasən hesablanmışdır.-15 litr və hüceyrə sıxlığı A600 = 0,5 (1 × 10-a bərabərdir)8 hüceyrələr ml-1 mədəniyyət). (Müller et al. 2016)
Ultrasonik Hüceyrə Kırıcıdan istifadə edərək Vivo Qlutatyon Təyinatı
E.coli MG1655, A600 0,5-ə çatana qədər 200ml ümumi həcmdə MOPS minimal mühitində yetişdirildi. Stress müalicəsi üçün kultura 50 ml-lik kulturalara bölündü. 0,79 mM allisin, 1 mM diamid və ya dimetil sulfoksid (nəzarət) ilə 15 dəqiqəlik inkubasiyadan sonra hüceyrələr 10 dəqiqə ərzində 4000 q-da 4°C-də yığılmışdır. 700µl KPE tamponunda qranulların yenidən suspenziyasından əvvəl hüceyrələr iki dəfə KPE tamponu ilə yuyuldu. Deproteinasiya üçün, ultrasəslə hüceyrələrin pozulmasından əvvəl (3 x 1 dəq; VialTweeter ultrasəs aparatı). Supernatantlar sentrifuqadan sonra toplandı (30 dəq, 13000 q, 4°C). Sulfosalisil turşusunun konsentrasiyası 3 həcmli KPE tamponunun əlavə edilməsi ilə 1%-ə endirildi. Ümumi glutatyon və GSSG ölçüləri yuxarıda göstərildiyi kimi aparılmışdır. Hüceyrə glutatyon konsentrasiyaları E. coli hüceyrələrinin 6,7 həcminə əsasən hesablanmışdır.×10-15 litr və hüceyrə sıxlığı A600 0,5 (1×108 hüceyrələr ml-1 mədəniyyət). GSH konsentrasiyaları ümumi glutatyondan 2[GSSG] çıxılmaqla hesablanmışdır. (Müller et al. 2016)
Ultrasonik Homogenizatordan istifadə edərək E. coli-də İnsan mAspAT-ın ifadəsi
Tərkibində 100μg/mL ampisilin olan 30 mL Luria-Bertani (LB) mühitində ifadə vektorunu saxlayan E. coli BL21 (DE3) tək koloniyası və sonra optik sıxlığa (OD) qədər 37ºC-də becərilir.600) 0,6-a çatdı. Hüceyrələr 10 dəqiqə ərzində 4000 × g-də sentrifuqa ilə yığıldı və 100 μg/mL ampisilin olan 3L təzə LB mühitində yenidən dayandırıldı.
Daha sonra zülal ifadəsi 16ºC-də 20 saat ərzində 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tioqalaktopiranosid (IPTG) ilə induksiya edilmişdir. Hüceyrələr 15 dəqiqə ərzində 8000 × g-də sentrifuqa ilə yığılmış və tampon A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4) ilə yuyulmuşdur. 3 L mədəniyyətdən təxminən 45 q (yaş çəki) hüceyrələr əldə edilmişdir. Santrifüjdən sonra hüceyrə qranulları 40 mL (1 L mədəniyyət üçün) buz kimi soyuq ekstraksiya tamponu A-da yenidən dayandırıldı və Hielscher ultrasəs hüceyrə qırıcısı UP400St istifadə edərək buz kimi soyuq temperaturda ultrasəslə parçalandı. Hüceyrə lizisi həll olunan (supernatant) və çökdürülmüş (qranul) fraksiyaları ayırmaq üçün 15 dəqiqə ərzində 12,000 rpm-də sentrifuqa edilmişdir. (Jiang et al. 2015)
Bilməyə Dəyər Faktlar
E.coli
Escherichia coli (E. coli) adətən isti qanlı orqanizmlərin (endotermlərin) aşağı bağırsaqlarında rast gəlinən Escherichia cinsindən olan qram-mənfi, fakultativ anaerob, çubuqşəkilli, koliform bakteriyadır. Müxtəlif xüsusiyyətlərə malik çoxlu sayda E. coli ştammları (və ya alt növləri) var. E. coli ştammlarının əksəriyyəti insanlar üçün zərərsizdir, məsələn, laboratoriyalarda tədqiqat tətbiqləri üçün adətən istifadə olunan B və K-12 ştammları. Ancaq bəzi suşlar zərərlidir və ciddi xəstəliklərə səbəb ola bilər.
E. coli müasir bioloji mühəndislik və sənaye mikrobiologiyasında mühüm rol oynayır, çünki bakteriyalarla manipulyasiya etmək asandır. Tez-tez E. coli-nin istifadəsini əhatə edən ümumi laboratoriya tətbiqləri, məsələn, rekombinant dezoksiribonuklein turşusu (DNT) yaratmaq və ya model orqanizm kimi fəaliyyət göstərmək üçün.
E. coli heteroloji zülalların istehsalı üçün çox yönlü bir ev sahibidir və E. coli-də rekombinant zülalların istehsalı üçün manifold protein ifadə sistemləri mövcuddur. Proteinin yüksək səviyyədə ifadəsini təmin edən plazmidlərdən istifadə edərək, genlər bakteriyalara daxil edilə bilər ki, bu da sənaye fermentasiya proseslərində belə zülalları yüksək miqdarda istehsal etməyə imkan verir.
E.coli insulin istehsal etmək üçün hüceyrə fabrikləri kimi istifadə olunur. Əlavə tətbiqlərə peyvəndlər və immobilizasiya olunmuş fermentlər hazırlamaq və istehsal etmək, bioyanacaq istehsal etmək, eləcə də bioremediasiya üçün dəyişdirilmiş E. coli hüceyrələrinin istifadə edilməsi daxildir.
K-12 ştammı qələvi fosfataz (ALP) fermentini həddindən artıq ifadə edən E. coli-nin mutant formasıdır. Bu mutasiya, fermenti daim kodlayan gendəki qüsur səbəbindən baş verir. Əgər gen heç bir maneə olmadan məhsul istehsal edirsə, bu, konstitusiya fəaliyyəti kimi tanınır. Bu xüsusi mutant forma ALP fermentinin təcrid edilməsi və təmizlənməsi üçün istifadə olunur.
E. coli bakteriyaları hüceyrə fabrikləri kimi də geniş istifadə olunur. Mühəndis mikroblar (məsələn, bakteriya) və bitki hüceyrələrindən sözdə hüceyrə fabrikləri kimi istifadə edilə bilər. Bu geni dəyişdirilmiş hüceyrələr, məsələn, əczaçılıq, qida və kimya sənayesində istifadə olunan molekullar, kimyəvi maddələr, polimerlər, zülallar və digər maddələr istehsal edir. Belə biomühəndis hüceyrələrinin içərisində istehsal olunan molekulları sərbəst buraxmaq üçün ultrasəs lizis hüceyrə divarlarını pozmaq və hədəf maddələri ətrafdakı mayeyə köçürmək üçün ümumi bir üsuldur. Biomühəndis hüceyrələrinin parçalanması haqqında daha çox oxuyun!
Ultrasonik DNT kəsimi
Ultrasəs kəsmə qüvvələri molekulları, orqanoidləri və zülalları hüceyrə daxilindən azad etmək, həmçinin DNT zəncirlərini parçalara ayırmaq üçün çox istifadə edilən üsuldur. Akustik kavitasiya hüceyrələrdən DNT çıxarmaq və təxminən 600 ədəd fraqment yaratmaq üçün hüceyrə divarlarını və membranlarını qırır. – Analiz üçün ideal olan 800 bp uzunluğunda.
DNT parçalanması üçün ultrasəs homogenizatorları haqqında daha çox öyrənmək üçün buraya klikləyin!
Ədəbiyyat / İstinadlar
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics yüksək performanslı ultrasəs homogenizatorları istehsal edir laboratoriya üçün sənaye ölçüsü.