Toxuma və Hüceyrə Mədəniyyətlərindən Ultrasonik Zülal Ekstraksiya
- Proteinin çıxarılması proteomikada nümunənin hazırlanmasının vacib mərhələsidir.
- Zülalları bitki və heyvan toxumalarından, mayalardan və mikroorqanizmlərdən çıxarmaq olar.
- Sonication qısa ekstraksiya müddətində yüksək protein məhsulu verən etibarlı, səmərəli zülal çıxarma üsuludur.
Dokulardan və Hüceyrələrdən Zülal Ekstraksiya
Toxumalardan və mədəni hüceyrələrdən zülal çıxarılması ELISA, PAGE, Western blotting, kütləvi spektrometriya və ya zülalın təmizlənməsi kimi bir çox biokimyəvi və analitik üsullar zamanı həyata keçirilən mühüm nümunə hazırlama mərhələsidir. Ultrasonik hüceyrənin pozulması, lizisi və çıxarılması zülalların yüksək məhsuldarlığını təmin etmək üçün dəqiq idarə olunan, qeyri-termik bir texnikadır.
Hüceyrələrdən zülal çıxarılması ultrasəs zondu UP200St
- Sürətli
- yüksək məhsuldarlıq
- Yüksək Səmərəli
- Parametrlər üzərində dəqiq nəzarət
- təkrarlana bilən nəticələr
- xətti miqyaslılıq
Ultrasonik Lizis və Zülal Ekstraksiyasına dair Ümumi Təlimatlar
- Temperatur nəzarəti: Termal denatürasiya olmadan yüksək protein məhsuldarlığını təmin etmək üçün ekstraksiya zamanı temperatur nəzarət edilməlidir. Hielscher-in ən müasir ultrasəs homogenizatorları – ultrasəs parçalayıcı və ya ultrasəsləndirici də deyilir – dəqiq idarə oluna bilirlər. Onlar qoşula bilən temperatur sensoru ilə gəlir. Ultrasəs homojenizatorunun parametrlərində maksimum temperatur təyin edilə bilər. Bu temperatur maksimuma çatdıqda, ultrasəs cihazı nümunə soyudulana qədər avtomatik olaraq dayanır.
- Bufer: Uyğun buferin seçimi və lazımi tampon həcmi toxumadan toxumaya dəyişir və sınaq və səhv testi ilə müəyyən edilməlidir.
- İzolyasiya/təmizləmə: Protein lizatlarında DNT və ya karbohidratlar kimi çoxlu biomolekullar ola bilər ki, bu da protein çöküntüsü (dezoksixolat-trikloroasetik turşu) və ya tampon mübadiləsi yolu ilə çıxarıla bilər.
Chittapalo və Noomhorm (2009) öz araşdırmalarında sonikasiyadan istifadə edərək zülal məhsuldarlığının artdığını və ultrasəs toxumasının homojenləşməsi və lizis prosesinin mövcud ekstraksiya proseslərini əhəmiyyətli dərəcədə artıra biləcəyini bildirdilər. – yeni kommersiya hasilatı imkanlarına şərait yaradır.
Ultrasonik Kubok Horn zülal izolyasiyası və DNT-nin parçalanması üçün eyni şəraitdə çoxsaylı nümunələrin eyni vaxtda, yüksək effektiv nümunə hazırlığı üçün.
Heyvan toxumasından zülal çıxarılması
Tam ölçülü toxumanın (məsələn, böyrək, ürək, ağciyər, əzələ və s.) hazırlanması üçün toxuma təmiz alətlərlə, tercihen buz üzərində və proteazlar tərəfindən deqradasiyanın qarşısını almaq üçün mümkün qədər tez bir zamanda çox kiçik parçalara bölünməlidir (məs. RIPA kimi lizis tamponu və ya proteaz və fosfataz inhibitor kokteyli olan hipotonik lizis tamponu). Parçalandıqdan sonra nümunə tez dondurulmaq üçün maye azota batırılır. Nümunə sonradan istifadə üçün -80°C-də saxlanıla bilər və ya dərhal homogenləşmə üçün buz üzərində saxlanıla bilər. Ultrasəs ekstraksiyasından dərhal əvvəl, buz soyuducu lizis tamponu (proteaz inhibitorları DTT, leupeptin və aprotinin ilə) sürətlə nümunə borusuna əlavə edilir (hər ~10 mq toxuma üçün təqribən ~600 μL tampon tövsiyə olunur). təqribən. Hər bir nümunə borusuna 20-60 mq toxuma tövsiyə olunur.
Ultrasonik homojenləşdirmə, liziz və ekstraksiya mikro-ucu sonotrode ilə təchiz olunmuş UP100H və ya UP200Ht kimi ultrasəs homojenizatoru ilə həyata keçirilir. Sonikasiya müddəti 60-90 saniyədir. 15 saniyəlik ultrasəs dövrü rejimində. sonication və 10 san. istirahət vaxtı. Nümunə hər zaman buzda saxlanmalıdır.
Ultrasonik homogenləşdirmə / ekstraksiyadan sonra lizat təqribən 27,000 q-da sentrifuqalanır. 20 dəq. Daha sonra supernatent toplanır, beləliklə zülal konsentrasiyası Pirs protein analizi BCA kimi bir protein analizi ilə müəyyən edilə bilər.
Qan Serumundan Protein Ekstraksiya
Serum və fosfat tamponunun homojen bir qarışığı üçün nümunə ultrasəs hüceyrə parçalanmasından əvvəl əvvəlcə burulğalanır. Ultrasəs lizis üçün nümunə UP100H kimi ultrasəs laboratoriya homogenizatoru ilə 20% amplituda 8 dövrə, hər 5 saniyəlik dövrələr üçün açıq və 15 saniyə söndürülür. Protein çıxarılması dövrlərdə sonikasiya yolu ilə (pulsasiya rejimi) və nümunənin həddindən artıq istiləşməsinin və termal deqradasiyasının qarşısını almaq üçün nümunəni buz üzərində yerləşdirməklə həyata keçirilir. Serumda İEF zamanı aşağı molekulyar çəkili zülalların ayrılmasına mane olan çoxlu miqdarda yüksək molekulyar ağırlıqlı zülallar (məsələn, albumin, α1-antitripsin, transferrin, haptoglobulin, immunoqlobulin G və immunoqlobulin A) olduğundan, onların tükənməsi tövsiyə olunur. tükənmə sütunundan istifadə edərək serumdan.
Bitki toxumasından zülal çıxarılması
Təzə, yumşaq bitki toxuması, məsələn, mamır və s., sadəcə olaraq doğranmış nümunə materialını sonikasiya üçün lizis buferinə yerləşdirməklə asanlıqla pozula bilər. Toxumlar, küknar iynələri və s. kimi sərt, ligen bitki toxumaları qurudulmuş olmalıdır. Bəzi sərt, odunlu bitki materialları sonikasiya ilə çıxarılmazdan əvvəl dondurulmalı və maye azotda üyüdülməlidir. Bitki hüceyrə mədəniyyəti süspansiyonları üçün liziz tamponunda 30 ilə 150 saniyə arasında ultrasəs müalicəsi əsasən kifayətdir. Balqabaq toxumu kimi daha sərt material aşağıda təsvir olunduğu kimi daha sıx sonikasiya tələb edir.
Balqabaq toxumlarından albuminin ultrasəslə çıxarılması üçün protokol
İncə üyüdülmüş balqabaq toxumu tozundan albuminin ultrasəs zülalının çıxarılması üçün 250 ml şüşə stəkana həlledici kimi 10 q yağsız balqabaq toxumu tozu və 100 ml deionlaşdırılmış su əlavə edilir. Protein çıxarılması iki mərhələdən ibarətdir: Birincisi, nümunə sonikasiya olunur sonotrode S24d7 ilə təchiz olunmuş zond tipli ultrasəs cihazı UP400St (400W, 24kHz). Ultrasonik homojenləşdirmə zamanı şüşə qab soyuq su banyosuna yerləşdirilir. UP400St ultrasəs cihazının qoşula bilən temperatur sensoru və temperatur nəzarəti parametrləri nümunə temperaturunun həmişə 30°C-dən aşağı saxlanmasını təmin edir. Sonikasiya zamanı temperaturun dəqiq tənzimlənməsi ilə albuminin denatürasiyasının qarşısı alınır. İkincisi, ekstraksiya mikserlə 200 rpm sürətlə və 30°C-də aparılmışdır. Daha sonra şüşə termostatik çalkalayıcıya köçürülür. Globulin distillə edilmiş su ilə dializ yolu ilə çıxarılır. Qlobulinin çıxarılmasından sonra, protein ekstraktı albumin profilinin müəyyən edilməsi üçün nümunə götürülə bilər və daha sonra albumin laxtalanması üçün 0,1 M HCl istifadə edərək, pI=3,0-a uyğunlaşdırıla bilər. Bərk faza 5000 q, 20°C-də sentrifuqalama yolu ilə ayrılır və deionlaşdırılmış suda yenidən həll edilir. Albumin konsentratında protein nisbətini artırmaq üçün albumin laxtalanması iki dəfə aparılır.
Düyü kəpəyindən zülal konsentratının hazırlanması üçün ultrasəs qələvi zülal ekstraktı göstərir ki, ultrasəs müalicəsi əhəmiyyətli dərəcədə daha qısa ekstraksiya müddətində yüksək protein məhsulu ilə nəticələnir. – ənənəvi hasilat üsulları ilə müqayisədə.
Funksional iNOS Enzimi üçün Nümunə Hazırlama Protokolu
Tam funksional iNOS fermentini əldə etmək üçün (məsələn, dərman skrininqi üçün) aşağıdakı protokol tövsiyə olunur: Hüceyrə suspenziyası buz üzərində yerləşdirilməlidir və 5 saniyəlik dövr rejimində 10 µm amplituda UP100H ilə sonikasiya edilməlidir. sonication və 25 san. buz üzərində istirahət edin. Prosedur təxminən təkrarlanmalıdır. 3 dəfə. Sonikasiya dövrləri arasındakı istirahət müddəti temperaturun yüksəlməsini azaldır və buna görə də denatürasiya riskini azaldır.
ultrasəs zülal həlli
Sonication adətən bir neçə saat tələb edən zülalların həll edilməsi prosesini sürətləndirə bilər. Nümunəni həddindən artıq qızdırmamaq və zülalın deqradasiyası və tərkibində karbamid olan məhlullarda dəyişikliklərin qarşısını almaq üçün ultrasəs partlayışları bir neçə saniyədən çox davam etməməlidir.
Ultrasəs cihazı UP200Ht kiçik nümunələrin sonikasiyası üçün 2 mm mikrotip S26d2 ilə.
Proteinlərin çıxarılması üçün ultrasəs avadanlığı
Hielscher Ultrasonics, hüceyrələrin, toxumaların, bakteriyaların, mikroorqanizmlərin, mayaların və sporların parçalanması üçün geniş spektrli ultrasəs homogenizatorları təklif edir.
Hielscher laboratoriya ultrasəs cihazları güclü və istifadəsi asandır. 24/7 işləmək üçün qurulmuş, onlar möhkəm və səmərəli laboratoriya və dəzgah üstü cihazlar kimi hazırlanmışdır. Bütün cihazlar üçün enerji çıxışı və amplituda dəqiq idarə oluna bilər. Aksesuarların geniş çeşidi əlavə quraşdırma seçimlərini açır. VialTweeter, UP200Ht, UP200St və UP400St kimi rəqəmsal ultrasəs aparatları inteqrasiya edilmiş temperatur nəzarətinə və məlumatların avtomatik qeyd edilməsi üçün quraşdırılmış SD karta malikdir.
Birdən çox nümunənin dolayı, çarpaz çirklənmədən və eyni vaxtda sonikasiyası üçün biz VialTweeter və ya ultrasəs CupHorn təklif edirik.
Aşağıdakı cədvəl nümunənin hazırlanması, hüceyrənin pozulması və çıxarılması üçün ultrasəs aparatlarımız haqqında ümumi məlumat verir. Hər bir ultrasəs homojenizatoru haqqında daha çox məlumat əldə etmək üçün cihaz növünə klikləyin. Bizim yaxşı təlim keçmiş və uzunmüddətli təcrübəyə malik texniki heyətimiz nümunə hazırlamağınız üçün ən uyğun ultrasəs aparatını seçməkdə sizə kömək etməkdən məmnun olacaqlar!
| Partiya Həcmi | Axın | Tövsiyə olunan Cihazlar |
|---|---|---|
| 10 flakon və ya boruya qədər | na | VialTweeter |
| çoxqulu / mikrotitr plitələr | na | UIP400MTP |
| çoxlu borular / damarlar | na | kubok |
| 1 ilə 500 ml | 10-200 ml/dəq | UP100H |
| 10 ilə 1000 ml | 20-200 ml/dəq | UP200Ht, UP200 St |
| 10 ilə 2000 ml | 20 - 400 ml/dəq | UP400St |
Tətbiqinizdən, materialınızdan və nümunə həcmindən asılı olaraq, biz sizə nümunə hazırlığınız üçün ən uyğun quraşdırmanı tövsiyə edəcəyik. Bu gün bizimlə əlaqə saxlayın!
Bizimlə əlaqə saxlayın! / Bizdən soruşun!
Hielscher rəqəmsal ultrasəs cihazları brauzerin uzaqdan idarə edilməsini və inteqrasiya olunmuş SD kartda avtomatik məlumat protokollaşdırılmasını təmin edir.
VialTweeter dolayı sonication üçün.
Bilməyə Dəyər Faktlar
proteomika
Proteomika zülalları və proteomları araşdıran tədqiqat sahəsidir. Zülallar orqanizmlərdə çoxlu həyati funksiyaları yerinə yetirir. Proteom müəyyən bir zamanda bir genom, hüceyrə, toxuma və ya orqanizm tərəfindən ifadə edilən zülalların bütün dəstidir. Proteom zamana və hüceyrənin və ya orqanizmin məruz qaldığı fərqli tələblərə və ya stresslərə görə dəyişir. Daha dəqiq desək, bu, müəyyən bir şəraitdə, müəyyən bir zamanda, müəyyən bir hüceyrə və ya orqanizm növündə ifadə olunan zülalların məcmusudur. Termin zülalların və genomun qarışığıdır. Proteomika proteomun öyrənilməsidir.
protein
Zülallar böyük biomolekullardır, sözdə makromolekullardır – amin turşusu qalıqlarının bir və ya bir neçə uzun zəncirindən ibarətdir. Zülallar həm bitki mənşəli, həm də heyvan mənşəli bütün orqanizmlərdə mövcuddur və onlar bioloji funksiyaların əksəriyyəti üçün vacibdir. Zülallarda çoxlu bioloji məlumat olduğundan, onlar analitik məqsədlər üçün, məsələn, proteomik tədqiqatlar üçün çıxarılır. Zülalların yerinə yetirdiyi ən mühüm funksiyaya metabolik reaksiyaların katalizi, DNT replikasiyası, stimullara reaksiya və molekulların bir yerdən digərinə daşınması daxildir. Zülallar bir-birindən ilk növbədə onların genlərinin nukleotid ardıcıllığı ilə diktə edilən amin turşularının ardıcıllığına görə fərqlənir və bu, adətən zülalın fəaliyyətini təyin edən spesifik üçölçülü struktura qatlanması ilə nəticələnir. Proteinlərdir – peptidlərdən başqa – qidanın əsas komponentlərindən biridir. Buna görə də, proteomika prosesləri, qida təhlükəsizliyini və qidalanma qiymətləndirməsini optimallaşdırmaq üçün qida elmində güclü bir vasitədir.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction analitikləri ayırmaq və əvvəlcədən konsentrasiya etmək üçün analitikdən əvvəlki prosedurdur. Ultrasonikasiya ilə birlikdə bulud nöqtəsinin çıxarılması prosesi daha səmərəli, daha sürətli və ətraf mühitə uyğunlaşdıraraq intensivləşdirilə bilər. Ultrasonikasiya ilə bulud nöqtəsinin çıxarılması analitin hazırlanmasının əhəmiyyətli dərəcədə daha səmərəli üsuludur. Ultrasəs köməyi ilə bulud nöqtəsinin çıxarılması haqqında daha çox oxuyun!Gel elektroforezi
Gel elektroforezi DNT, RNT və zülallar kimi makromolekulların, eləcə də onların fraqmentlərinin ölçüsünə və yükünə görə ayrılması və təhlili üçün əsas üsuldur. Klinik kimyada zülalları yük və/və ya ölçüyə görə ayırmaq üçün (IEF agaroza, mahiyyətcə ölçüdən asılı deyil) və biokimyada, molekulyar biologiyada və proteomikada DNT və RNT fraqmentlərinin qarışıq populyasiyasını uzunluğa görə ayırmaq, DNT ölçüsünü qiymətləndirmək üçün istifadə olunur. və RNT fraqmentləri və ya zülalları yüklə ayırmaq.
hüceyrə mədəniyyətləri
Hüceyrə mədəniyyəti, nəzarət edilən şəraitdə hüceyrələrin yetişdirildiyi idarə olunan böyümə prosesidir. Hüceyrə mədəniyyəti şərtləri hər hüceyrə növü üçün dəyişir. Ümumiyyətlə, hüceyrə kulturasının mühiti əsas qida maddələrini (amin turşuları, karbohidratlar, vitaminlər, minerallar), böyümə faktorları, hormonlar və qazları (CO2, O2) və fiziki-kimyəvi mühiti (pH tamponu, osmotik təzyiq, temperatur) tənzimləyir. Əksər hüceyrələr səthə və ya süni substrata ehtiyac duyur, digər hüceyrə kulturaları isə mədəniyyət mühitində (asma kulturası, hüceyrə süspansiyonu) sərbəst üzən şəkildə becərilə bilər.
Heyvan hüceyrə xətlərinin kütləvi kulturaları viral peyvəndlərin və digər biotexnoloji mənşəli məhsulların sənaye istehsalında istifadə olunur. İnsan kök hüceyrələri hüceyrələrin sayını artırmaq və transplantasiya məqsədləri üçün hüceyrələri müxtəlif somatik hüceyrə tiplərinə diferensiallaşdırmaq üçün yetişdirilir.
Doku nümunələri
Toxuma termini hüceyrə materialının hüceyrələr və tam orqan arasında təşkilati səviyyədə olduğu hüceyrə ara məhsulunu təsvir edir. Dokuda eyni mənşəli, birlikdə müəyyən bir funksiyanı yerinə yetirən oxşar hüceyrələr yığılır. Çoxlu toxumaların funksional qruplaşması ilə orqanların mürəkkəb strukturları əmələ gəlir.
Toxuma biologiya, histologiya/histopatologiya, parazitologiya, biokimya, immunohistokimya sahəsində tədqiqatlar, həmçinin DNT-ni yetişdirmək və çıxarmaq üçün nümunə götürülür. Onu heyvan (bölmə: məməli toxuması) və bitki toxuması arasında ayırmaq olar. Heyvan toxumaları birləşdirici, əzələ, sinir və epitelial toxumanın dörd əsas növünə qruplaşdırılır. Bitki toxuması aşağıdakı üç toxuma sisteminə bölünür: epidermis, torpaq toxuması və damar toxuması.
Toxuma nümunələri heyvan və ya bitki hissələrindən, məsələn, sümük, əzələ, yarpaq və s. hazırlana bilər.
Bədən Mayeləri
Qan, serum, plazma, serebrospinal maye, tüpürcək və sinovial maye bədən mayeləridir və diaqnostik cəhətdən əhəmiyyətli məlumat mənbəyidir. Buna görə də, analiz üçün bədən mayesi nümunələrinin mürəkkəb hazırlanması vacibdir. Birinci çətinlik bədən mayelərində mövcud olan komponentlərin geniş dinamik diapazonu ilə bağlıdır.
Protein konsentrasiyasının təyini
Bradford testi, Lowry testi və bicinchoninic acid (BCA) analizi zülalların konsentrasiyasını təyin etmək üçün ümumi analizlərdir. Bovine serum albumin (BSA) ən çox istifadə edilən protein standartlarından biridir.
liziz tamponu
Lizis tamponu hüceyrə materialına və ya toxumasına (toxuma mədəniyyəti, bitki, bakteriya, göbələk və s.) və hüceyrələrin strukturda olub-olmamasına və quruluş növünə uyğun seçilməlidir. Zülalların, membranların və orqanoidlərin çıxarılması üçün geniş çeşidli liziz tamponları bir və ya daha çox yuyucu vasitə ilə hazırlanmışdır. Yuyucu vasitə adətən sınaq və səhv testləri ilə seçilir – varsa – mövcud zülal çıxarılması protokoluna uyğun olaraq. Yuyucu vasitə toxuma mənbəyi və zülallarla uyğun olmalıdır. Ümumiyyətlə, xüsusi toxuma/zülal üçün işləyən ən yumşaq yuyucu vasitə ekstraktın maksimum funksionallığını qorumaq üçün seçilir. Bundan əlavə, membranların və orqanoidlərin çıxarılması halında, yumşaq bir yuyucu vasitə membranı toxunulmaz saxlayır. Lizis tamponlarında tez-tez istifadə olunan yuyucu vasitələr əsasən qeyri-ionik və ya zvitterionikdir, məsələn, CHAPS, deoksixolat, Triton™ X-100, NP40 və Tween 20.
Məsələn, beyin, qaraciyər, bağırsaq, böyrək, dalaq və s. kimi toxumalar RIPA ilə sadəcə tamponlana bilər. – lakin proteaz inhibitorları və DTT (məsələn, gel elektroforezi üçün) daxil edilməlidir.
Skelet əzələ toxuması üçün liziz tamponu (buz soyuqluğu): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (ağırlıq/həc) qliserin, 1 mM EDTA , proteaz və fosfataz inhibitor kokteyli ilə əlavə edilmiş 1 mM ditiotreitol
Ümumi tamponların cədvəli və onların pH diapazonu. Ümumiyyətlə, bu tamponlar normal olaraq 20-50 mM konsentrasiyalarda istifadə olunur.
| bufer | pH diapazonu |
|---|---|
| Sitrik turşusu – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Natrium sitrat – Sitrik turşusu | 3.0 – 6.2 |
| Natrium asetat – sirkə turşusu | 3.6 – 5.6 |
| Kakodil turşusu natrium duzu – HCl | 5.0 – 7.4 |
| FHN – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Natrium dihidrogen fosfat – disodium hidrogen fosfat | 5.8 – 8.0 |
| imidazol – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Trietanolamin hidroxlorid – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Natrium tetraborat – borik turşusu | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| qlisin – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Əksər tamponlar temperaturdan pH-asılılıq göstərir. Bu xüsusilə Tris tamponları üçün doğrudur. pKa 25°C-də 8.06-dan 0°C-də 8.85-ə dəyişir.
(buferin pH və pKa: pH sulu məhlulda hidrogen ionlarının konsentrasiyasını ölçür. pKa (= turşu dissosiasiya sabiti) əlaqəli, lakin daha spesifik bir ölçüdür, çünki o, molekulun xüsusi bir yerdə necə hərəkət edəcəyini proqnozlaşdırmağa kömək edir. pH dəyəri.)
TRIzol
TRIzol guanidinium tiosiyanat-fenol-xloroformun çıxarılması zamanı RNT/DNT/zülal çıxarmaq üçün istifadə edilən kimyəvi məhluldur. Ultrasonik yardımlı TRIzol ekstraksiyasının istifadəsi eyni nümunədən yüksək DNT, RNT və zülal məhsuldarlığı ilə nəticələnir və bununla da digər ekstraksiya üsullarından üstündür.
Ədəbiyyat / İstinadlar
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.