Toxuma və Cell Mədəniyyətlərarası olan ultrasəs Zülal hasilatı
- Zülal hasilatı proteomics mühüm nümunə hazırlanması addımdır.
- Zülallar bitki və heyvan toxuma, mayalar və mikroorqanizmlərin hasil edilə bilər.
- Sonication qısa hasilatı müddət ərzində yüksək protein verir verən etibarlı, səmərəli protein hasilatı üsuludur.
Dokular və hüceyrələrdən zülal çıxarılması
Toxumalardan və mədəni hüceyrələrdən zülal çıxarılması ELISA, PAGE, Western blotting, kütləvi spektrometriya və ya zülalın təmizlənməsi kimi bir çox biokimyəvi və analitik üsullar zamanı həyata keçirilən mühüm nümunə hazırlama mərhələsidir. Ultrasonik hüceyrənin pozulması, lizisi və çıxarılması zülalların yüksək məhsuldarlığını təmin etmək üçün dəqiq idarə olunan, qeyri-termik bir texnikadır.
Hüceyrələrdən zülal çıxarılması ultrasəs zondu UP200St
- sürətli
- yüksək verir
- Yüksək səmərəli
- parametrlərinin dəqiq nəzarət
- reproducible nəticələri
- xətti genişlənmə
Ultrasonik Lizis və Zülal Ekstraksiyasına dair Ümumi Təlimatlar
- Temperatur nəzarət: istilik denaturation olmadan yüksək protein gəlir təmin etmək üçün, hasilatı zamanı temperatur nəzarət olmalıdır. Hielscher dövlət-of-art ultrasəs homogenizers – ultrasəs parçalayıcı və ya ultrasəsləndirici də deyilir – dəqiq nəzarət edir. Onlar plugable temperatur sensor ilə gəlir. ultrasəs Homogenizer qəbulu variantları, bir maksimum temperatur müəyyən edilə bilər. Bu temperatur max əldə zaman nümunə aşağı soyudulur qədər ultrasonicator avtomatik olaraq dayanır.
- Tampon: uyğun bufer və bufer sağ həcmi choise toxuma toxuma dəyişir və sınaq və səhv test fiqurlu-out olmalıdır.
- Isolation / təmizlənməsi: Protein Lysates protein yağıntı (deoxycholate-trichloroacetic turşusu) tərəfindən çıxarıla bilər belə DNT və ya karbohidratlar kimi biomolecules, bir artıq olan və ya mübadiləsi bufer bilər.
Chittapalo və Noomhorm (2009) öz araşdırmalarında sonikasiyadan istifadə edərək zülal məhsuldarlığının artdığını və ultrasəs toxuma homogenləşməsi və liziz prosesinin mövcud ekstraksiya proseslərini əhəmiyyətli dərəcədə artıra biləcəyini bildirdilər. – yeni kommersiya hasilatı imkanları imkan.
Ultrasonik cuphorn zülal izolyasiyası və DNT-nin parçalanması üçün eyni şəraitdə çoxsaylı nümunələrin eyni vaxtda yüksək effektiv nümunə hazırlığı üçün.
heyvan toxuma Zülal hasilatı
Bütün ölçülü toxumaların (məsələn, böyrək, ürək, ağciyər, əzələ və s.) Hazırlanması üçün toxum təmiz vasitələrlə, tercihen buzda çox kiçik parçalara bölünməlidir və proteazların pozulması qarşısını almaq üçün mümkün qədər tezdir (məsələn, RIPA ya da proteaz və fosfataz inhibitor kokteyli olan hipotonik lizis tamponu kimi lizis tamponu. Dəyişdikdən sonra nümunə snap dondurmaq üçün maye azotla batırılır. Nümunə, dərhal homojenləşdirmə üçün daha sonra istifadəsi üçün -80 ° C-də saxlana və ya buzda saxlana bilər. Ultrasonik ekstraksiyadan dərhal əvvəl, nümunə tüpünə sürətlə əlavə olaraq buzlu soyuq lizis tamponu (proteaz inhibitorları DTT, leupeptin və aprotininlə) (təxminən ~ 600 mL tamponun təxminən 10 mq toxuması təklif olunur). Təxminən. Hər bir nümunə tüpün başına 20-60mg toxuma təklif edilir.
Ultrasonik homojenləşdirmə, liziz və ekstraksiya mikro-ucu sonotrode ilə təchiz olunmuş UP100H və ya UP200Ht kimi ultrasəs homojenizatoru ilə həyata keçirilir. Sonikasiya müddəti 60-90 saniyədir. 15 saniyəlik ultrasəs dövrü rejimində. sonication və 10 san. istirahət vaxtı. Nümunə hər zaman buzda saxlanmalıdır.
ultrasəs homogenization / hasilatı sonra lysate təqribən 27,000g da mərkəzdənqaçma olunur. 20 min. zülal konsentrasiyası belə Pierce zülal təhlil BCA bir protein təhlil ilə müəyyən edilə bilər ki, sonra supernatent, toplanır.
qan zərdabında olan Zülal hasilatı
Serum və fosfat tamponunun homojen bir qarışığı üçün nümunə ultrasəs hüceyrə parçalanmasından əvvəl əvvəlcə burulğalanır. Ultrasəs lizis üçün nümunə UP100H kimi ultrasəs laboratoriya homogenizatoru ilə 20% amplituda 8 dövrə, hər 5 saniyəlik dövrələr üçün açıq və 15 saniyə söndürülür. Protein çıxarılması dövrlərdə sonikasiya (pulsasiya rejimi) və nümunənin həddindən artıq istiləşməsinin və istilik deqradasiyasının qarşısını almaq üçün nümunəni buzun üzərinə qoymaqla həyata keçirilir. Serumda İEF zamanı aşağı molekulyar çəkili zülalların ayrılmasına mane olan çoxlu miqdarda yüksək molekulyar çəki zülalları (məsələn, albumin, α1-antitripsin, transferrin, haptoqlobulin, immunoqlobulin G və immunoqlobulin A) olduğundan, onların tükənməsi tövsiyə olunur. tükənmə sütunundan istifadə edərək serumdan.
bitki toxuma Zülal hasilatı
Təzə, yumşaq bitki toxuma, məsələn moss və s. asanlıqla sadəcə sonication üçün lizisi bufer doğranmış nümunə maddi yerləşdirilməsi ilə pozularsa bilər. belə fir iynələr və s. toxum kimi sərt, ligenous bitki toxumalarının, quru yer olmalıdır. Bəzi ağır, meşəli bitki materialları dondurulmuş olunmalıdır və maye azot torpaq əvvəl sonication tərəfindən hasil. bitki mobil mədəniyyət suspensions, bir lizisi bufer 30 və 150 saniyə arasında ultrasəs müalicə əsasən kifayətdir. aşağıda təsvir kimi balqabaq toxumu kimi sərt material daha sıx sonication tələb edir.
balqabaq toxum albumin ultrasəs çıxarılması üçün Protokol
İncə üyüdülmüş balqabaq toxumu tozundan albuminin ultrasəs zülalının çıxarılması üçün 250 ml şüşə stəkana həlledici kimi 10 q yağsız balqabaq toxumu tozu və 100 ml deionlaşdırılmış su əlavə edilir. Protein çıxarılması iki mərhələdən ibarətdir: Birincisi, nümunə sonikasiya olunur sonotrode S24d7 ilə təchiz olunmuş zond tipli ultrasəs cihazı UP400St (400W, 24kHz). Ultrasonik homojenləşdirmə zamanı şüşə qab soyuq su banyosuna yerləşdirilir. UP400St ultrasəs cihazının qoşula bilən temperatur sensoru və temperatur nəzarəti parametrləri nümunə temperaturunun həmişə 30°C-dən aşağı saxlanmasını təmin edir. Sonikasiya zamanı temperaturun dəqiq tənzimlənməsi ilə albuminin denatürasiyasının qarşısı alınır. İkincisi, ekstraksiya mikserlə 200 rpm sürətlə və 30°C-də aparılmışdır. Daha sonra şüşə termostatik çalkalayıcıya köçürülür. Globulin distillə edilmiş su ilə dializ yolu ilə çıxarılır. Qlobulinin çıxarılmasından sonra, protein ekstraktı albumin profilinin müəyyən edilməsi üçün nümunə götürülə bilər və daha sonra albumin laxtalanması üçün 0,1 M HCl istifadə edərək, pI=3,0-a düzəldilir. Bərk faza 5000 q, 20°C-də sentrifuqa ilə ayrılır və deionlaşdırılmış suda yenidən həll edilir. Albumin konsentratında protein nisbətini artırmaq üçün albumin laxtalanması iki dəfə aparılır.
düyü kəpək olan protein konsentrat hazırlanması üçün Ultrasonik qələvi protein hasilatı göstərir ki, əhəmiyyətli dərəcədə qısa hasilatı vaxt ali protein gəlir ultrasəs müalicə nəticələri – şərti hasilatı üsullarla müqayisədə.
funksional İnose ferment üçün Nümunə hazırlanması protokol
Tam funksional iNOS fermentini əldə etmək üçün (məsələn, dərman skrininqi üçün) aşağıdakı protokol tövsiyə olunur: Hüceyrə suspenziyası buz üzərində yerləşdirilməlidir və 5 saniyəlik dövr rejimində 10 µm amplituda UP100H ilə sonikasiya edilməlidir. sonication və 25 san. buz üzərində istirahət edin. Prosedur təxminən təkrarlanmalıdır. 3 dəfə. Sonikasiya dövrləri arasındakı istirahət müddəti temperaturun yüksəlməsini azaldır və buna görə də denatürasiya riskini azaldır.
Ultrasonik Zülal Solubilization
Sonication adətən bir neçə saat tələb protein solubilization prosesi sürətləndirə bilər. sidik cövhəri olan həlləri protein tənəzzül və dəyişikliklər nümunə overheat və qarşısını almaq üçün, ultrasəs bursts neçə saniyə daha uzun olmamalıdır.
Ultrasəs cihazı UP200Ht kiçik nümunələrin sonikasiyası üçün 2 mm mikrotip S26d2 ilə.
Zülal hasilatı üçün Ultrasonic Equipment
Hielscher ultrason hüceyrələri, toxumaların, bakteriya, mikroorqanizmlərin, maya, və sporlar dağılması üçün ultrasəs homogenizers geniş çeşidini təklif edirik.
Hielscher laboratoriya ultrasəs cihazları güclü və istifadəsi asandır. 24/7 işləmək üçün qurulmuş, onlar möhkəm və səmərəli laboratoriya və dəzgah üstü cihazlar kimi hazırlanmışdır. Bütün cihazlar üçün enerji çıxışı və amplituda dəqiq idarə oluna bilər. Aksesuarların geniş çeşidi əlavə quraşdırma seçimlərini açır. VialTweeter, UP200Ht, UP200St və UP400St kimi rəqəmsal ultrasəs aparatları inteqrasiya edilmiş temperatur nəzarətinə və məlumatların avtomatik qeyd edilməsi üçün quraşdırılmış SD karta malikdir.
Birdən çox nümunənin dolayı, çarpaz çirklənmədən və eyni vaxtda sonikasiyası üçün biz VialTweeter və ya ultrasəs CupHorn təklif edirik.
Aşağıdakı cədvəl nümunənin hazırlanması, hüceyrənin pozulması və çıxarılması üçün ultrasəs aparatlarımız haqqında ümumi məlumat verir. Hər bir ultrasəs homojenizatoru haqqında daha çox məlumat əldə etmək üçün cihaz növünə klikləyin. Bizim yaxşı təlim keçmiş və uzunmüddətli təcrübəyə malik texniki heyətimiz nümunə hazırlamağınız üçün ən uyğun ultrasəs aparatını seçməkdə sizə kömək etməkdən məmnun olacaqlar!
| Partiyanın həcmi | Axın | tövsiyə Cihazlar |
|---|---|---|
| 10 flakon və ya boruya qədər | na | VialTweeter |
| çoxqulu / mikrotitr plitələr | na | UIP400MTP |
| çoxlu borular / damarlar | na | Cuphorn |
| 1 500ml | 10 200ml / dəq | UP100H |
| 10 ilə 1000 ml | 20-200 ml/dəq | Uf200 ः t, UP200St |
| 10 2000ml üçün | 20 400ml / dəq | UP400St |
Sizin tətbiqi, maddi və nümunə həcmi asılı olaraq, biz sizin nümunə hazırlayıcı üçün ən uyğun quraşdırma tövsiyə edəcəkdir. Bu gün bizə müraciət edin!
Bizimlə əlaqə saxlayın! Bizdən soruşun!
Hielscher rəqəmsal ultrasəs cihazları brauzerin uzaqdan idarə edilməsini və inteqrasiya olunmuş SD kartda avtomatik məlumat protokollaşdırılmasını təmin edir.
VialTweeter dolayı sonication üçün.
Bilmək lazımdır
proteomics
Proteomics zülal və proteome araşdırır tədqiqat sahəsidir. Zülallar orqanizmlərin ərzində həyati funksiyaları geniş array fullfil. proteome müəyyən bir zaman bir genomu, hüceyrə, toxuma, və ya orqanizm ifadə zülalların bütün müəyyən edilir. proteome bir hüceyrə və ya orqanizm məruz ki, vaxt və fərqli tələbləri və ya stress ilə dəyişir. Daha konkret desək, bu hüceyrə və ya orqanizmin bir növü ifadə zülalların müəyyən edilir, müəyyən şəraitdə bir zamanda. müddətli zülal və genomu bir qarışığı var. Proteomics proteome öyrənilməsi edir.
zülal
böyük biomolecules olunur zülallar, qondarma macromolecules – amin turu qalıqlarının bir və ya daha uzun zəncirlərindən ibarətdir. Proteinlər bitki və heyvan mənşəli bütün orqanizmlərdə mövcuddur və bioloji funksiyaların çoxu üçün vacibdir. Zülalların çoxu bioloji məlumatları olduğu üçün analitik məqsədlər üçün, məsələn, proteomik tədqiqatlar üçün çıxarılırlar. Zülalların ən əhəmiyyətli funksiyası arasında metabolik reaksiyaların kataliziyası, DNT replikasiyası, xəbərdarlıqlara cavab və molekulların bir yerdən digərinə nəql edilməsi daxildir. Proteinlər bir-birindən fərqlənirlər, əsasən onların genlərinin nükleotid sekansı ilə diktə edilən və adətən, onun fəaliyyətini təyin edən xüsusi bir üç ölçülü strukturun tərkibinə protein qatmağına səbəb olan amin turşuları sırası ilə fərqlənirlər. Proteinlər var – peptid başqa – Qida əsas komponentlərindən biridir. Buna görə də, proteomics proseslər, ərzaq təhlükəsizliyi və qida qiymətləndirilməsi optimize qida elm güclü bir vasitədir.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction analitikləri ayırmaq və əvvəlcədən konsentrasiya etmək üçün analitikdən əvvəlki prosedurdur. Ultrasonikasiya ilə birlikdə bulud nöqtəsinin çıxarılması prosesi daha səmərəli, daha sürətli və ətraf mühitə uyğunlaşdıraraq intensivləşdirilə bilər. Ultrasonikasiya ilə bulud nöqtəsinin çıxarılması analitin hazırlanmasının əhəmiyyətli dərəcədə daha səmərəli üsuludur. Ultrasəs köməyi ilə bulud nöqtəsinin çıxarılması haqqında daha çox oxuyun!Gel Elektroforez
Gel elektroforez ayrılması və DNA, RNT və zülal, eləcə də onların ölçüsü və pulsuz əsasında onların fraqmentləri kimi makromolekulların təhlili üçün əsas metodudur. Bu pulsuz və / və ya ölçüsü ilə zülal ayırmaq üçün klinik kimya istifadə olunur (İEF agarose, mahiyyətcə ölçüsü asılı olmayaraq) və biokimya, molekulyar biologiya və proteomics DNT ölçüsünü hesablamaq üçün, uzunluğu DNT və RNT fraqmentləri bir qarışıq əhalisi ayrı-ayrı və ya RNT parçaları vəzifəli ilə zülal ayırmaq üçün.
Cell Cultures
Cell mədəniyyət hüceyrələri nəzarət şəraitində yetişdirilir olan nəzarət artan prosesdir. Cell mədəniyyət şərait hər bir hüceyrə növü üçün dəyişir. Ümumiyyətlə, bir mobil mədəniyyət mühiti substrat və ya əsas qida (amin turşuları, karbohidratlar, vitaminlər, minerallar), böyümə faktorları, hormonlar təchizatı orta və qazlar (CO ilə uyğun gəmi (məsələn Petri yeməyi) ibarətdir2,2) Və Physio-kimyəvi mühit (pH bufer, osmotik təzyiq, temperatur) tənzimləyir. digər mobil mədəniyyətlər mədəniyyət orta (körpü mədəniyyət, mobil körpü) üzən pulsuz becərilir bilər isə ən hüceyrələri, bir yerüstü və ya süni döşənəyi lazımdır.
heyvan mobil xətləri kütləvi mədəniyyət virus vaksinlər və digər biotechnologically edilən məhsulların sənaye istehsalında istifadə olunur. İnsan kök hüceyrələri hüceyrələrinin sayını artırmaq və nəqli məqsədlər üçün müxtəlif somatik hüceyrə növə hüceyrələri fərqləndirmək mədəni var.
toxuma nümunələri
mobil material hüceyrələri və tam orqanı arasında təşkilati səviyyədə olduğu müddət toxuma, mobil ara təsvir edir. toxuma bənzər hüceyrələr birlikdə xüsusi funksiyası yerinə yetirmək eyni mənşəli olan, yığılmış olunur. Çox toxumaların funksional qruplaşdırılması ki, orqanların kompleks strukturları formalaşır.
Toxuma biologiya, histologiya / Histopatoloji, parazitologiya, biokimya, immunhistokimya tədqiqat, eləcə də yetişdirmək və DNT çıxarış üçün örnek olunur. və bitki toxuma: Bu heyvan (məməli toxuma subdivision) arasında fərq ola bilər. Animal toxumaların birləşdirici, əzələ, sinir, və epitel toxuma dörd əsas növ qruplaşdırılıb. epidermisin, torpaq toxuma və damar toxuma: Plant toxuma Aşağıdakı üç toxuma sistemi bölünür.
Toxuma nümunələri heyvan və ya bitki hissələri, məsələn hazırlanmış ola bilər sümük, əzələ, yarpaq, və s.
Bədən mayeləri
Qan, serum, plazma, cerebrospinal maye, tüpürcək və sinovial maye diaqnostik müvafiq məlumatların böyük bir mənbə təklif bədən mayeləri var. Buna görə də, analiz üçün bədən maye nümunələrinin inkişaf etmiş bir hazırlıq vacibdir. ilk çətinlik bədən mayeləri mövcud komponentlərinin geniş dinamik diapazonu ilə bağlıdır.
zülal konsentrasiyası müəyyən edilməsi
Bradford təhlil, Lowry təhlil və bicinchoninic turşusu (BCA) təhlil zülal konsentrasiyası müəyyən etmək üçün ümumi təhlillər var. İri Buynuzlu serum albumin (BSA) ən çox istifadə olunan zülal standart biridir.
lizisi Buffer
Lizisi bufer mobil maddi və ya toxumasının (toxuma mədəniyyət, bitki, bakteriya, göbələklərin, və s.) Uyğun olaraq seçilmiş və olmalıdır hüceyrələri bir quruluş və quruluş növü olub. lizisi geniş zülal, membranların çıxarılması üçün TAKOZLARI və organelles bir və ya daha çox yuyucu ilə ifadə olunur. yuyucu adətən sınaq və səhv testlər və ya vasitəsilə seçilmiş – əgər varsa – Mövcud protein hasilatı protokola görə. yuyucu toxuma mənbəyi və zülalları ilə uyğun olmalıdır. Ümumiyyətlə, müəyyən bir toxuma / protein üçün çalışır mildest yuyucu, çıxarış maksimal funksionallıq təmin etmək üçün seçilir. Bundan başqa, membranların və orqanoidlərinin bir çıxarıldığı halda, mülayim yuyucu membran bütöv saxlayır. lizisi arabellekleri istifadə olunan yuyucu məsələn, əsasən nonionic ya zwitterionic var Chaps, deoxycholate, Triton ™ X-100, NP40 və Tween 20.
Məsələn, belə beyin, qaraciyər, bağırsaq, böyrək kimi toxumaların, dalaq və s. sadəcə RIPA ilə buffered bilər – lakin protease inhibitorları və (məsələn gel elektroforez üçün) DTT daxil edilməlidir.
20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% qliserin (/ v w), 1 mM EDTA: skelet əzələ toxuması (buz soyuq) üçün lizisi bufer 1 mM protease və fosfataza inhibitor kokteyl əlavə dithiothreitol
ümumi buferlər Cədvəl və onların pH üçündür. Ümumiyyətlə, bu buferlər adətən 20-50 mm konsentrasiyaları istifadə olunur.
| Buffer | pH sıra |
|---|---|
| Limon turşusu – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Sodium sitrat – Limon turşusu | 3.0 – 6.2 |
| Sodium asetat – sirkə turşusu | 3.6 – 5.6 |
| Cacodylic turşusu natrium duz – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MY – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Sodium dihydrogen fosfat – dinatrium hidrogen fosfat | 5.8 – 8.0 |
| imidazol – HCl | 6.2 – 7.8 |
| Mops – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Trietanolamin hidroxlorid – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Sodium tetraborate – Bor turşusu | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| Glycine – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Ən buferlər temperatur bir pH-asılılığını göstərir. Bu Tris buferlər üçün xüsusilə doğrudur. pKa 0 ° C 8.85 25 ° C 8,06 dəyişir.
bir bufer (pH və pKa: pH bir suda həll hidrogen ionlarının konsentrasiyası tədbirlər pKa (= turşusu dissosiasiya sabit) əlaqəli, lakin daha konkret tədbir bir molekul müəyyən bir çıxış edəcək necə proqnozlaşdırmaq üçün kömək edir ki, edir. pH dəyəri.)
TRIzol
TRIzol guanidinium Thiocyanate-fenol-xloroform hasilatı zamanı RNT / DNT / protein çıxarmaq üçün istifadə olunan kimyəvi həll edir. Eyni nümunə yüksək DNT, RNT və zülal rekoltesinde ultrasonically yardım TRIzol hasilatı nəticələri istifadə və bununla da digər hasilatı üsulları excels.
Ədəbiyyat / Referanslar
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.