Qərb basma üçün Ultrasonik lizisi

  • qərb blot toxuma homogenate və ya mobil çıxarış nümunəsi xüsusi zülalların aşkarlanması üçün bir analitik prosedurdur.
  • Qərb blot çalıştırmak üçün və ya ferment fəaliyyətini ölçmək üçün bir çox təhlillər hüceyrə kəməndə materialları (məsələn zülallar, DNT, subcellular fraqmentləri) daxil tələb edir.
  • Sonication nəzarət mobil pozulması və lizisi üçün etibarlı və asan-idarə üsuludur.

Ultrasonik Cell pozulması

toxuma və mədəni hüceyrələri Zülal hasilatı çox bioloji biokimyəvi və analitik üsulları (PAGE, Western basma, ELISA, kütləvi spektrometri, və s.) və ya protein təmizlənməsi üçün ilk addımdır. Yüksək protein gəlir əldə etmək üçün, mobil material və toxuma səmərəli lysed / pozularsa olmalıdır. bitki hüceyrə və ya heyvan toxuma olsun, sonication mobil lysate asan və sürətli hazırlamaq üçün metodudur.

Sonication üstünlükləri

  • sürətli & səmərəli
  • asan əməliyyat
  • yüksək protein gəlir
  • reproducible / repeatable
  • dəqiq nəzarət
  • ölçeklenebilir

İnformasiya tələbi




Bizimlə əlaqə saxlayın Gizlilik Siyasəti.


Hielscher's VialTweeter is ideal for the lysis of multiple samples

VialTweeter sonikatoru hüceyrənin pozulması və protein izolyasiyası kimi ultrasəs nümunəsinin hazırlanması üçün

Western Immunoblotting üçün immunoprecipitation Protokol

A. Reagentlər

həllərin hazırlanması üçün belə Milli-Q kimi təmizlənmiş su istifadə edin.

  • 1X Fosfat Önbellekli Saline (PBS)
  • 1X Cell lizisi Buffer: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM Sodium pyrophosphate 1 mM β-glycerophosphate 1 mM Na3VO4, 1 mkq / ml Leupeptin
    Mühüm: istifadə etmək üçün əlavə 1 mM PMSF dərhal əvvəl.
  • 15 μl Zülal A + 15 μl Zülal G IP kifayətdir, ancaq əsas antikor və nümunə həcmi asılı ola bilər. Siz həmçinin pre-qarışıq protein A / G agarose istifadə edə bilərsiniz (məsələn Zülal A dovşan üçün IgG aşağı çəkmək və Zülal G siçan IgG üçün açılan)
  • 3X SDS Nümunə Buffer: 187.5 mM Tris-HCl (25 ° C pH 6,8), w 6% / 0.03% mavi / v bromophenol w SDS, 30% qliserin, 150 mM DTT, v

Cell Lysates B. hazırlanması

  • hüceyrələri məhsul. nondenaturing şərtlər altında hüceyrələri məhsul, media aradan qaldırılması və buz PBS bir dəfə hüceyrələri yaxalamaq.
  • PBS çıxarın və hər boşqab (10 sm) 0,5 ml buz 1X mobil lizisi bufer əlavə 5 dəqiqə buz plitələr cücə.
  • plitələr off hüceyrələri qaşımaq və Mikrosantrifüj borular transfer. buz üzərində saxlayın.
  • Sonicate iki dəfə buz immunoprecipitation bufer 10 saniyə üçün (IP bufer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 və protease inhibitor mix). sonication üçün, VialTweeter və ya kimi bir probe ultrasonicator belə UP100H və ya Uf200 ः t ən uygundur.
  • 4 ° C 10 dəqiqə 15,000 g Lysates sentrifuqa.
  • yeni boru supernatant Transfer. (Lazım gələrsə, lysate -80 ° C saxlanıla bilər.)
  • supernatant əsas antikor əlavə edin. əsas antikor ilə supernatant yüngül təşviqat altında 4 ° C 1 saat Soğutmalı olunur. İbtidai antikor adətən qərb basma üçün istifadə olunur daha çox konsentrasiya məbləğində 10x əlavə olunur. (Siz 100μL başına 1μg ilə başlaya bilər.)
  • supernatant sonra başqa 1 saat üçün Protein A-agarose (Invitrogen) və Zülal G agarose bərabər qarışığı ilə daha kürtə olunur.
  • IP bufer ilə agarose qranullar üç dəfə yumaq. Daha sonra 5 dəqiqə 95 ° C istilik ilə SDS-PAGE loading bufer ilə bağlı zülal çıxarış.

C. immunoprecipitation

  • 200 μl mobil lysate edin və ibtidai antikor əlavə edin. incə 4 ° C gecə sallanan ilə cücə.
  • protein A və ya G agarose muncuq (50% bead məhlulu 20 μl) ya əlavə edin. incə 4 ° C 1-3 saat üçün sallanan ilə cücə.
  • 4 ° C 30 saniyə Mikrosantrifüj. Wash 1X mobil lizisi bufer 500 μl ilə beş dəfə kürəcik. Yıkama Ürünleri ərzində buz üzərində saxlayın.
  • 20 μl 3X SDS nümunə bufer ilə kürəcik Resuspend. Vortex, sonra 30 saniyə Mikrosantrifüj.
  • 14,000 X g 1 dəqiqə 95-100 ° 2-5 dəqiqə C və Mikrosantrifüj üçün nümunə qızdırmaq.
  • SDS-PAGE gel (12-15%) üzrə nümunə (15-30 μl) bərpa edin.
  • Qərb basma ilə nümunə təhlili.

Sonicator UP50H ilə Western Blot Analizi

Kriebisch et al. tədqiqatında zond tipli sonikator UP50H istifadə edən aşağıdakı protokoldan istifadə edilmişdir. (2011):
Ultrasonik prob tipli homojenizator UP50H adətən hüceyrənin pozulması və zülal izolyasiyası üçün Western Blottingdən əvvəl nümunə hazırlamaq mərhələsi kimi istifadə olunur.Ümumi zülal 1,25 ilə müalicə MC3T3-E1 hüceyrələri təcrid edildi (OH)2D3 (10-8 M) və ya vasitə. Cells 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich) olan bufer ilə lysed edilmişdir; 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1% natrium dodecyl sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) və 0,5% natrium deoxycholate (Merck). mobil lysate dövrü 1 2 × 10 s sonicated və 80 amplitude edildi UP50H Ultrasonik Processor (Hielscher, Ultrasəs texnologiyası, Teltow, Almaniya). Bundan sonra maddə 14 min rpmdə 10 dəqiqə santrifüj edilmiş və supernatant Western blotting üçün istifadə edilmişdir. Yirmi beş μq protein nümunə tampon və azaldıcı maddə (Invitrogen) qaynadılmış və sonradan 4-12% poliakrilamid jelləri (Invitrogen) istifadə edərək SDS-PAGE ilə ayrılmış və nitroselüloz membrana (GE sağlamlıq xidməti) ötürülmüşdür. 1% kalium (Sigma-Aldrich) və 1% Tris (1 M) olan TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl) ilə 1 saat bloklandı. Bloklandıqdan sonra, membran gecə 4 ° C-də birincil antikorla (R. Banerjee, Ann Arbor, MI, ABŞ laboratoriyasında hazırlanmış dovşan anti-insan CBS 1/500) 4 ° C-də yüngül təşviq ilə inkubasiya edilmişdir. Bir horseradish peroksidaz (HPR) -haqqında orta antikor (Dako) ilə inkubasiya oda temperaturu 1 saat müddətində həyata keçirildi. Bütün blotlar inkişaf etmiş xemilüminesans tərəfindən hazırlanmışdır (Perkin Elmer).
 

Bu dərslik lizis, hüceyrənin pozulması, zülal izolyasiyası, laboratoriyalarda DNT və RNT fraqmentasiyası, analiz və tədqiqat kimi nümunə hazırlama tapşırıqlarınız üçün hansı tip sonikatorun ən yaxşı olduğunu izah edir. Tətbiqiniz, nümunə həcmi, nümunə sayı və ötürmə qabiliyyəti üçün ideal sonikator tipini seçin. Hielscher Ultrasonics sizin üçün ideal ultrasəs homojenizatoruna malikdir!

Elm və təhlildə hüceyrənin pozulması və zülal çıxarılması üçün mükəmməl sonikatoru necə tapmaq olar

Video Miniatür

 

Ultrasəs hüceyrə lizisi və çıxarılması üçün ən yaxşı təcrübələr, lizatların hazırlanması və prosesi təkmilləşdirmək üçün tövsiyələr haqqında ətraflı oxumaq üçün buraya klikləyin!
 
Aşağıdakı cədvəl sizə laboratoriya ölçülü ultrasəs aparatlarımızın təxmini emal qabiliyyətinin göstəricisini verir:

tövsiyə Cihazlar Partiyanın həcmi Axın
UIP400MTP 96 Quyu Plitə Sonikatoru çox quyulu / mikrotitr plitələr na
Ultrasonik cuphorn Flakonlar və ya stəkanlar üçün CupBuynuz na
GDmini2 ultrasəs mikro axın reaktoru na
VialTweeter 01.5ml .5 na
UP100H 1 500ml 10 200ml / dəq
Uf200 ः t, UP200St 10 ilə 1000 ml 20-200 ml/dəq
UP400St 10 2000ml üçün 20 400ml / dəq
ultrasəs ələk çalkalayıcı na na

Bizimlə əlaqə saxlayın! Bizdən soruşun!

Daha ətraflı məlumat üçün müraciət edin

Western Blots-dan əvvəl nümunə hazırlamaq üçün sonikatorlarımız haqqında əlavə məlumat, ətraflı tətbiq protokolları və qiymət tələb etmək üçün aşağıdakı formadan istifadə edin. Nümunə hazırlamaq prosesinizi sizinlə müzakirə etməkdən və tələblərinizə cavab verən ultrasəs sistemi təklif etməkdən şad olarıq!









Xahiş edirik unutmayın Gizlilik Siyasəti.


UIP400MTP plitə sonikatorundan istifadə etməklə mikroplitələr, çox quyulu lövhələr, PCR lövhələri və 96 quyulu lövhələr rahat və bərabər şəkildə səslənə bilər.

UIP400MTP Plate Sonicator 96 quyulu plitələrin yüksək məhsuldarlıqlı sonication üçün



Qərb basma haqqında

Blots onlar ayrılmış bilər ki, DNT, RNT və zülal bir daşıyıcı üzərində köçürülür analitik prosedurlar var.
Cənubi blot DNT təsbiti, RNT Şimali blot və zülal Qərb blot üçün istifadə olunur.
bir antikor xüsusilə onun antigen aşkar etmək üçün istifadə olunur, çünki Qərb basma də zülal immunoblotting adlanır. Qərb Qurudan nümunə xüsusi zülal aşkar etmək üçün ən mühüm analiz üsullardan biridir. Qərb blot ildə, zülallar monoklonal ya poliklonal antikor istifadə edərək, onları aşkar etmək üçün membranların hərəkətsiz olunur.
SDS-poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) tərəfindən yerli proteinlər polipeptidin uzunluğu ilə 3-D strukturu və ya denatüre proteinlər ilə ayrılır. Proteinlər daha sonra hədəf proteinə özgü antikorlar ilə boyanmış bir membrana (tipik olaraq nitroselüloz və ya PVDF) köçürülür. Antikorların qarşılıqlı reaktivlik məsələsini həll etmək üçün qələm elektroforez mərhələsi qərbdə blot analizinə daxil edilir.
Daha sonra ayrılan zülallar bir matrisə (əsasən bir nitroselüloz və ya PVDF membranı) qarışdırılır, burada antikorlar ilə boyanırlar. Antikorlar bir prob kimi fəaliyyət göstərir və xüsusi olaraq hədəf proteinə seçilir. Xüsusi reaksiyanın yerinin və intensivliyinin analizi, verilən nümunədə hədəf zülalların ifadə ifadələrini əks etdirir. Western blotting, jel elektroforezinin yüksək qətnaməsi və güclü spesifiklik və immunoassayın yüksək həssaslığı səbəbindən 1ng qədər aşağı olan hədəf proteinini aşkar edə bilər. Western blot metodu molekulyar biologiya, biokimya, immunogenetika və digər molekulyar tədqiqat sahələrində istifadə olunur.
Digər əlaqəli texnika dot blot təhlili, immunhistokimya və antikor immunostaining ilə toxuma və hüceyrələri zülal aşkar etmək üçün istifadə olunur immunocytochemistry və ferment bağlı İmmunosorbent ayar (ELISA) daxildir.


Ədəbiyyat / İstinadlar

Tam VialTweeter quraşdırma: ultrasəs prosessor VialTweeter sonotrode UP200St

VialTweeter sonikatoru birdən çox flakonun eyni vaxtda nümunə hazırlanması üçün

Bizimlə əlaqə saxlayın! Bizdən soruşun!





Xahiş edirik unutmayın Gizlilik Siyasəti.


Sonication nümunə hazırlanması zamanı mühüm addımdır

nümunə sonication üçün mikro-ucu ilə UP200St

Prosesinizi müzakirə etməkdən məmnun olarıq.

Əlaqə saxlayaq.