Western Blotting üçün ultrasəs lizis

• Vestern blot, toxuma homogenatı və ya hüceyrə ekstraktı nümunəsində xüsusi zülalların aşkarlanması üçün analitik prosedurdur.
• Western blotunu işə salmaq və ya ferment aktivliyini ölçmək üçün bir çox analizlər hüceyrədə sıxışdırılmış materiallara (məsələn, zülallar, DNT, hüceyrəaltı fraqmentlər) daxil olmağı tələb edir.
• Sonication idarə olunan hüceyrənin pozulması və lizisi üçün etibarlı və idarə olunması asan bir üsuldur.

Ultrasəs Hüceyrəsinin pozulması

Toxumalardan və mədəni hüceyrələrdən zülal çıxarılması bir çox bioloji, biokimyəvi və analitik üsullar (PAGE, Western blotting, ELISA, kütləvi spektrometriya və s.) və ya zülalın təmizlənməsi üçün ilk addımdır. Yüksək zülal məhsulu əldə etmək üçün hüceyrə materialı və toxuması effektiv şəkildə pozulmalıdır/lizizə edilməlidir. Bitki hüceyrəsi və ya heyvan toxuması olsun, sonikasiya hüceyrə lizatını asan və sürətli hazırlamaq üsuludur.

Sonikasiyanın üstünlükləri

• Tez & Səmərəli
• Asan əməliyyat
• yüksək protein məhsuldarlığı
• təkrarlana bilən/təkrarlana bilən
• dəqiq idarə olunur
• miqyaslana bilən

Qərb İmmunoblotinqi üçün İmmunopresipitasiya Protokolu

A. Reagentlər

Məhlulların hazırlanması üçün Milli-Q kimi təmizlənmiş sudan istifadə edin.

• 1X Fosfat Tamponlu Salin (PBS)
• 1X Hüceyrə Lizis Buferi: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM Natrium pirofosfat, 1 mM β-sph/glyce, Natrium pirofosfat ml Leupeptin
  Əhəmiyyətli: İstifadədən dərhal əvvəl 1 mM PMSF əlavə edin.
• 15 μl Protein A+15 μl Protein G IP üçün kifayətdir, lakin bu, əsas antikorunuzdan və nümunə həcmindən asılı ola bilər. Siz həmçinin əvvəlcədən qarışdırılmış protein A/G agarozadan istifadə edə bilərsiniz (məsələn, dovşan IgG aşağı çəkmək üçün Protein A və siçan IgG aşağı çəkmək üçün Protein G)
• 3X SDS Nümunə Tamponu: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8-də 25°C), 6% w/v SDS, 30% qliserin, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromofenol mavi

B. Hüceyrə Lizatlarının Hazırlanması

• Hüceyrələri yığın. Hüceyrələri qeyri-denaturasiya şəraitində toplamaq üçün medianı çıxarın və hüceyrələri bir dəfə buz kimi soyuq PBS ilə yuyun.
• PBS çıxarın və hər boşqaba (10 sm) 0,5 ml buz kimi soyuq 1X hüceyrə lizis buferi əlavə edin və plitələri 5 dəqiqə buz üzərində inkubasiya edin.
• Hüceyrələri lövhələrdən çıxarın və mikrosentrifuqa borularına köçürün. Buz üzərində saxlayın.
• Buz kimi soyuq immunoprecipitation buferində 10 saniyə ərzində iki dəfə sonikasiya edin (IP tampon: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 və proteaz inhibitoru qarışığı). sonication üçün, the VialTweeter və ya zond ultrasəs cihazı kimi UP100H və ya UP200Ht ən uyğundur.
• Lizatları 15000 q-da 4°C-də 10 dəqiqə sentrifuqa edin.
• Supernatantı yeni bir boruya köçürün. (Lazım olduqda, lizat -80°C-də saxlanıla bilər.)
• Supernatant üçün əsas antikor əlavə edin. Birincili antikor ilə supernatant yüngül çalkalama altında 4°C-də 1 saat inkubasiya edilir. Birincili antikor adətən western blotlama üçün istifadə ediləndən 10 qat daha çox konsentrasiya edilmiş miqdarda əlavə edilir. (100μL üçün 1μg ilə başlaya bilərsiniz.)
• Daha sonra supernatant bərabər miqdarda Protein A-agaroz (Invitrogen) və Protein G agaroza qarışığı ilə daha 1 saat ərzində inkubasiya edilir.
• Agaroz qranullarını üç dəfə İP buferlə yuyun. Daha sonra SDS-PAGE yükləmə tamponu ilə bağlı zülalları 95°C-də 5 dəqiqə qızdırmaqla çıxarın.

C. İmmunopresipitasiya

• 200 μl hüceyrə lizatını götürün və əsas antikor əlavə edin. Gecədə 4°C-də yumşaq silkələnmə ilə inkubasiya edin.
• Protein A və ya G agaroza muncuqları (20 μl 50% muncuq şlamı) əlavə edin. 4°C temperaturda 1-3 saat yumşaq silkələnmə ilə inkubasiya edin.
• 4°C-də 30 saniyə mikrosentrifuqa edin. 500 µl 1X hüceyrə lizisi tamponu ilə qranulları beş dəfə yuyun. Yuma zamanı buz üzərində saxlayın.
• Peleti 20 μl 3X SDS nümunə tamponu ilə yenidən dayandırın. Vorteks edin, sonra 30 saniyə mikrosentrifuqa edin.
• Nümunəni 2-5 dəqiqə ərzində 95-100°C-ə qədər qızdırın və 14000 X g-də 1 dəqiqə mikrosentrifuqa edin.
• Nümunəni (15-30 μl) SDS-PAGE gelinə (12-15%) yükləyin.
• Western blotlama üsulu ilə nümunəni təhlil edin.

Sonicator UP50H ilə Western Blot Analizi

Kriebisch və digərlərinin tədqiqatında zond tipli sonikator UP50H istifadə edən aşağıdakı protokoldan istifadə edilmişdir. (2011):
Ümumi protein 1,25(OH) ilə müalicə edilmiş MC3T3-E1 hüceyrələrindən təcrid edilmişdir.₂D₃ (10⁻⁸ M) və ya nəqliyyat vasitəsi. Hüceyrələr 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich) olan bir tamponla parçalandı; 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natrium dodesil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) və 0,5% natrium deoksixolat (Merck). Hüceyrə lizatı 1-ci dövrədə və amplituda 80-də 2 × 10 s ultrasonikasiya edildi. UP50H Ultrasonik Prosessor (Hielscher, Ultrasəs Texnologiyası, Teltow, Almaniya). Bundan sonra material 14,000 rpm-də 10 dəqiqə sentrifuqa edildi və supernatant Western blotting üçün istifadə edildi. İyirmi beş μg protein nümunə tamponunda və reduksiyaedici maddədə (Invitrogen) qaynadıldı və sonra 4-12% poliakrilamid gellərdən (Invitrogen) istifadə edərək SDS-PAGE ilə ayrıldı və nitroselüloz membrana (GE Healthcare) köçürüldü. Membran 1% kazein (Sigma-Aldrich) və 1% Tris (1 M) olan TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl) ilə 1 saat ərzində bloklandı. Bloklamadan sonra membran bir gecədə 4°C temperaturda əsas antikor (dovşan anti-insan CBS 1/500, Prof. R. Banerji, Ann Arbor, MI, ABŞ) laboratoriyasında işlənib hazırlanmışdır. Horseradish peroksidaza (HPR) ilə birləşdirilmiş ikincil antikor (Dako) ilə inkubasiya otaq temperaturunda 1 saat ərzində aparıldı. Bütün ləkələr gücləndirilmiş kimilüminesans (Perkin Elmer) tərəfindən hazırlanmışdır.
 

Ultrasəs hüceyrə lizisi və çıxarılması, lizat hazırlanması və prosesi təkmilləşdirmək üçün tövsiyələr üçün ən yaxşı təcrübələr haqqında ətraflı oxumaq üçün buraya klikləyin!
 
Aşağıdakı cədvəl sizə laboratoriya ölçülü ultrasəs aparatlarımızın təxmini emal qabiliyyətinin göstəricisini verir:

Ədəbiyyat / İstinadlar