Western blotinq üçün ultrasəs lizisi

• Western blot toxuma homogenatı və ya hüceyrə ekstraktı nümunəsində spesifik zülalların aşkarlanması üçün analitik prosedurdur.
• Western blot aparmaq və ya ferment aktivliyini ölçmək üçün bir çox analiz hüceyrə daxilində qalan materiallara (məsələn, zülallara, DNT-yə, subhüceyrə fraqmentlərinə) çıxış tələb edir.
• Sonikasiya hüceyrələrin nəzarətli parçalanması və lizisi üçün etibarlı və istifadəsi asan üsuldur.

Hüceyrələrin ultrasəslə parçalanması

Toxumalardan və kulturada yetişdirilmiş hüceyrələrdən zülalların ekstraksiyası bir çox bioloji, biokimyəvi və analitik üsul (PAGE, Western blotinq, ELISA, kütlə spektrometriyası və s.) və ya zülalların təmizlənməsi üçün ilk mərhələdir. Yüksək zülal çıxımı əldə etmək üçün hüceyrə materialı və toxuma səmərəli şəkildə parçalanmalı/ lizisə uğradılmalıdır. İstər bitki hüceyrəsi, istərsə də heyvan toxuması olsun, sonikasiya hüceyrə lizatınızı asan və sürətli hazırlamaq üçün uyğun üsuldur.

Sonikasiyanın üstünlükləri

• sürətli və səmərəli
• asan istifadə
• yüksək zülal çıxımı
• təkrar əldə edilə bilən/ təkrarlana bilən nəticələr
• dəqiq nəzarət edilən
• miqyası artırıla bilən

Western immunoblotinq üçün immunopresipitasiya protokolu

A. Reagentlər

Məhlulların hazırlanması üçün Milli-Q kimi təmizlənmiş sudan istifadə edin.

• 1X fosfatla buferləşdirilmiş fizioloji məhlul (PBS)
• 1X hüceyrə lizisi buferi: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natrium pirofosfat, 1 mM β-qliserofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptin
  Vacib: İstifadədən dərhal əvvəl 1 mM PMSF əlavə edin.
• 15 μl Protein A+15 μl Protein G IP üçün kifayətdir, lakin bu, ilkin anticisminizdən və nümunənin həcmindən asılı ola bilər. Əvvəlcədən qarışdırılmış Protein A/ G aqaroza da istifadə edə bilərsiniz (məsələn, dovşan IgG-sinin çökdürülərək ayrılması üçün Protein A və siçan IgG-sinin çökdürülərək ayrılması üçün Protein G)
• 3X SDS nümunə buferi: 187,5 mM Tris-HCl (25°C-də pH 6,8), 6% w/v SDS, 30% qliserol, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromfenol mavisi

B. Hüceyrə lizatlarının hazırlanması

• Hüceyrələri toplayın. Hüceyrələri denaturasiya yaratmayan şəraitdə toplamaq üçün qida mühitini uzaqlaşdırın və hüceyrələri bir dəfə buz kimi soyuq PBS ilə yaxalayın.
• PBS-i uzaqlaşdırın, hər qaba (10 cm) 0,5 ml buz kimi soyuq 1X hüceyrə lizisi buferi əlavə edin və qabları buz üzərində 5 dəqiqə inkubasiya edin.
• Hüceyrələri qablardan qaşıyaraq ayırın və mikrosentrifuqa sınaq borularına köçürün. Buz üzərində saxlayın.
• Buz kimi soyuq immunopresipitasiya buferində hər dəfə 10 saniyə olmaqla iki dəfə sonikasiya edin (IP buferi: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 və proteaza inhibitorları qarışığı). Sonikasiya üçün VialTweeter və ya zond tipli ultrasəs cihazları, məsələn, UP100H və ya UP200Ht, ən uyğundur.
• Lizatları 4°C-də 15.000 g ilə 10 dəqiqə sentrifuqalayın.
• Supernatantı yeni sınaq borusuna köçürün. (Lazım gələrsə, lizat –80°C-də saxlanıla bilər.)
• Supernatanta ilkin anticismi əlavə edin. İlkin anticisim əlavə edilmiş supernatant yüngül qarışdırılmaqla 4°C-də 1 h inkubasiya edilir. İlkin anticisim adətən Western blotinq üçün istifadə ediləndən 10x daha yüksək konsentrasiyada əlavə edilir. (100μL üçün 1μg ilə başlaya bilərsiniz.)
• Sonra supernatant bərabər miqdarda Protein A-aqaroza (Invitrogen) və Protein G aqaroza qarışığı ilə daha 1 h inkubasiya edilir.
• Aqaroza çöküntülərini IP buferi ilə üç dəfə yuyun. Daha sonra SDS-PAGE yükləmə buferi ilə 95°C-də 5 dəqiqə qızdıraraq bağlanmış zülalları ekstraksiya edin.

C. İmmunopresipitasiya

• 200 μl hüceyrə lizatı götürün və ilkin anticismi əlavə edin. 4°C-də gecə boyu yavaşca yırğalanmaqla inkubasiya edin.
• Protein A və ya G aqaroza dənəcikləri əlavə edin (50% dənəcik suspenziyasından 20 μl). 4°C-də 1–3 saat yavaşca yırğalanmaqla inkubasiya edin.
• 4°C-də 30 saniyə mikrosentrifuqalayın. Çöküntünü 500 µl 1X hüceyrə lizisi buferi ilə beş dəfə yuyun. Yuma zamanı buz üzərində saxlayın.
• Çöküntünü 20 μl 3X SDS nümunə buferində yenidən suspenziyalaşdırın. Vorteksdə qarışdırın, sonra 30 saniyə mikrosentrifuqalayın.
• Nümunəni 2–5 dəqiqə ərzində 95–100°C-yə qədər qızdırın və 14.000 X g ilə 1 dəqiqə mikrosentrifuqalayın.
• Nümunəni (15–30 μl) SDS-PAGE gelinə (12–15%) yükləyin.
• Nümunəni Western blotinq ilə analiz edin.

UP50H sonikatoru ilə Western blot analizi

Zond tipli UP50H sonikatorundan istifadə edilən aşağıdakı protokol Kriebisch və həmmüəlliflərinin (2011) tədqiqatında tətbiq edilmişdir:
Ümumi zülalın təcrid edildiyi MC3T3-E1 hüceyrələri 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) və ya daşıyıcı ilə işlənmişdi. Hüceyrələr tərkibində 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natrium dodesil sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) və 0,5% natrium deoksixolat (Merck) olan buferlə lizisə uğradılmışdı. Hüceyrə lizatı dövr 1 və amplituda 80 parametrlərində 2 × 10 s müddətində sonikasiya edilmişdi; istifadə olunan cihaz UP50H ultrasəs prosessoru (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Almaniya) idi. Daha sonra material 14.000 rpm-də 10 min sentrifuqalanmış və supernatant Western blotinq üçün istifadə edilmişdi. İyirmi beş μg zülal nümunə buferində və reduksiyaedici reagentdə (Invitrogen) qaynadılmış, sonra 4–12% poliakrilamid gellərindən (Invitrogen) istifadə edilməklə SDS-PAGE vasitəsilə ayrılmış və nitrosellüloza membranına (GE health care) köçürülmüşdü. Membran tərkibində 1% kazein (Sigma-Aldrich) və 1% Tris (1 M) olan TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) ilə 1 h bloklanmışdı. Bloklamadan sonra membran ilkin anticisimlə (Prof. R. Banerjee-nin laboratoriyasında hazırlanmış insan CBS-inə qarşı dovşan anticismi, 1/500, Ann Arbor, MI, ABŞ) 4°C-də gecə boyu yüngül qarışdırılmaqla inkubasiya edilmişdi. Xren peroksidazası (HPR) ilə konyuqasiya edilmiş ikincili anticisimlə (Dako) inkubasiya otaq temperaturunda 1 h aparılmışdı. Bütün blotlar gücləndirilmiş xemilüminessensiya (Perkin Elmer) vasitəsilə görüntülənmişdi.
 

Ultrasəslə hüceyrə lizisi və ekstraksiyası üzrə ən yaxşı təcrübələr, lizatın hazırlanması və prosesin təkmilləşdirilməsinə dair tövsiyələr haqqında daha çox oxumaq üçün buraya klikləyin!
 
Aşağıdakı cədvəl laboratoriya ölçülü ultrasəs cihazlarımızın təxmini emal tutumu haqqında məlumat verir:

Ədəbiyyat / İstinadlar

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.