Qərb basma üçün Ultrasonik lizisi
- qərb blot toxuma homogenate və ya mobil çıxarış nümunəsi xüsusi zülalların aşkarlanması üçün bir analitik prosedurdur.
- Qərb blot çalıştırmak üçün və ya ferment fəaliyyətini ölçmək üçün bir çox təhlillər hüceyrə kəməndə materialları (məsələn zülallar, DNT, subcellular fraqmentləri) daxil tələb edir.
- Sonication nəzarət mobil pozulması və lizisi üçün etibarlı və asan-idarə üsuludur.
Ultrasonik Cell pozulması
toxuma və mədəni hüceyrələri Zülal hasilatı çox bioloji biokimyəvi və analitik üsulları (PAGE, Western basma, ELISA, kütləvi spektrometri, və s.) və ya protein təmizlənməsi üçün ilk addımdır. Yüksək protein gəlir əldə etmək üçün, mobil material və toxuma səmərəli lysed / pozularsa olmalıdır. bitki hüceyrə və ya heyvan toxuma olsun, sonication mobil lysate asan və sürətli hazırlamaq üçün metodudur.
Sonication üstünlükləri
- sürətli & səmərəli
- asan əməliyyat
- yüksək protein gəlir
- reproducible / repeatable
- dəqiq nəzarət
- ölçeklenebilir

VialTweeter sonikatoru hüceyrənin pozulması və protein izolyasiyası kimi ultrasəs nümunəsinin hazırlanması üçün
Western Immunoblotting üçün immunoprecipitation Protokol
A. Reagentlər
həllərin hazırlanması üçün belə Milli-Q kimi təmizlənmiş su istifadə edin.
- 1X Fosfat Önbellekli Saline (PBS)
- 1X Cell lizisi Buffer: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM Sodium pyrophosphate 1 mM β-glycerophosphate 1 mM Na3VO4, 1 mkq / ml Leupeptin
Mühüm: istifadə etmək üçün əlavə 1 mM PMSF dərhal əvvəl. - 15 μl Zülal A + 15 μl Zülal G IP kifayətdir, ancaq əsas antikor və nümunə həcmi asılı ola bilər. Siz həmçinin pre-qarışıq protein A / G agarose istifadə edə bilərsiniz (məsələn Zülal A dovşan üçün IgG aşağı çəkmək və Zülal G siçan IgG üçün açılan)
- 3X SDS Nümunə Buffer: 187.5 mM Tris-HCl (25 ° C pH 6,8), w 6% / 0.03% mavi / v bromophenol w SDS, 30% qliserin, 150 mM DTT, v
Cell Lysates B. hazırlanması
- hüceyrələri məhsul. nondenaturing şərtlər altında hüceyrələri məhsul, media aradan qaldırılması və buz PBS bir dəfə hüceyrələri yaxalamaq.
- PBS çıxarın və hər boşqab (10 sm) 0,5 ml buz 1X mobil lizisi bufer əlavə 5 dəqiqə buz plitələr cücə.
- plitələr off hüceyrələri qaşımaq və Mikrosantrifüj borular transfer. buz üzərində saxlayın.
- Sonicate iki dəfə buz immunoprecipitation bufer 10 saniyə üçün (IP bufer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 və protease inhibitor mix). sonication üçün, VialTweeter və ya kimi bir probe ultrasonicator belə UP100H və ya Uf200 ः t ən uygundur.
- 4 ° C 10 dəqiqə 15,000 g Lysates sentrifuqa.
- yeni boru supernatant Transfer. (Lazım gələrsə, lysate -80 ° C saxlanıla bilər.)
- supernatant əsas antikor əlavə edin. əsas antikor ilə supernatant yüngül təşviqat altında 4 ° C 1 saat Soğutmalı olunur. İbtidai antikor adətən qərb basma üçün istifadə olunur daha çox konsentrasiya məbləğində 10x əlavə olunur. (Siz 100μL başına 1μg ilə başlaya bilər.)
- supernatant sonra başqa 1 saat üçün Protein A-agarose (Invitrogen) və Zülal G agarose bərabər qarışığı ilə daha kürtə olunur.
- IP bufer ilə agarose qranullar üç dəfə yumaq. Daha sonra 5 dəqiqə 95 ° C istilik ilə SDS-PAGE loading bufer ilə bağlı zülal çıxarış.
C. immunoprecipitation
- 200 μl mobil lysate edin və ibtidai antikor əlavə edin. incə 4 ° C gecə sallanan ilə cücə.
- protein A və ya G agarose muncuq (50% bead məhlulu 20 μl) ya əlavə edin. incə 4 ° C 1-3 saat üçün sallanan ilə cücə.
- 4 ° C 30 saniyə Mikrosantrifüj. Wash 1X mobil lizisi bufer 500 μl ilə beş dəfə kürəcik. Yıkama Ürünleri ərzində buz üzərində saxlayın.
- 20 μl 3X SDS nümunə bufer ilə kürəcik Resuspend. Vortex, sonra 30 saniyə Mikrosantrifüj.
- 14,000 X g 1 dəqiqə 95-100 ° 2-5 dəqiqə C və Mikrosantrifüj üçün nümunə qızdırmaq.
- SDS-PAGE gel (12-15%) üzrə nümunə (15-30 μl) bərpa edin.
- Qərb basma ilə nümunə təhlili.
Sonicator UP50H ilə Western Blot Analizi
Kriebisch et al. tədqiqatında zond tipli sonikator UP50H istifadə edən aşağıdakı protokoldan istifadə edilmişdir. (2011):
Ümumi zülal 1,25 ilə müalicə MC3T3-E1 hüceyrələri təcrid edildi (OH)2D3 (10-8 M) və ya vasitə. Cells 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich) olan bufer ilə lysed edilmişdir; 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1% natrium dodecyl sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) və 0,5% natrium deoxycholate (Merck). mobil lysate dövrü 1 2 × 10 s sonicated və 80 amplitude edildi UP50H Ultrasonik Processor (Hielscher, Ultrasəs texnologiyası, Teltow, Almaniya). Bundan sonra maddə 14 min rpmdə 10 dəqiqə santrifüj edilmiş və supernatant Western blotting üçün istifadə edilmişdir. Yirmi beş μq protein nümunə tampon və azaldıcı maddə (Invitrogen) qaynadılmış və sonradan 4-12% poliakrilamid jelləri (Invitrogen) istifadə edərək SDS-PAGE ilə ayrılmış və nitroselüloz membrana (GE sağlamlıq xidməti) ötürülmüşdür. 1% kalium (Sigma-Aldrich) və 1% Tris (1 M) olan TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl) ilə 1 saat bloklandı. Bloklandıqdan sonra, membran gecə 4 ° C-də birincil antikorla (R. Banerjee, Ann Arbor, MI, ABŞ laboratoriyasında hazırlanmış dovşan anti-insan CBS 1/500) 4 ° C-də yüngül təşviq ilə inkubasiya edilmişdir. Bir horseradish peroksidaz (HPR) -haqqında orta antikor (Dako) ilə inkubasiya oda temperaturu 1 saat müddətində həyata keçirildi. Bütün blotlar inkişaf etmiş xemilüminesans tərəfindən hazırlanmışdır (Perkin Elmer).
Aşağıdakı cədvəl sizə laboratoriya ölçülü ultrasəs aparatlarımızın təxmini emal qabiliyyətinin göstəricisini verir:
tövsiyə Cihazlar | Partiyanın həcmi | Axın |
---|---|---|
UIP400MTP 96 Quyu Plitə Sonikatoru | çox quyulu / mikrotitr plitələr | na |
Ultrasonik cuphorn | Flakonlar və ya stəkanlar üçün CupBuynuz | na |
GDmini2 | ultrasəs mikro axın reaktoru | na |
VialTweeter | 01.5ml .5 | na |
UP100H | 1 500ml | 10 200ml / dəq |
Uf200 ः t, UP200St | 10 ilə 1000 ml | 20-200 ml/dəq |
UP400St | 10 2000ml üçün | 20 400ml / dəq |
ultrasəs ələk çalkalayıcı | na | na |
Bizimlə əlaqə saxlayın! Bizdən soruşun!

UIP400MTP Plate Sonicator 96 quyulu plitələrin yüksək məhsuldarlıqlı sonication üçün
Qərb basma haqqında
Blots onlar ayrılmış bilər ki, DNT, RNT və zülal bir daşıyıcı üzərində köçürülür analitik prosedurlar var.
Cənubi blot DNT təsbiti, RNT Şimali blot və zülal Qərb blot üçün istifadə olunur.
bir antikor xüsusilə onun antigen aşkar etmək üçün istifadə olunur, çünki Qərb basma də zülal immunoblotting adlanır. Qərb Qurudan nümunə xüsusi zülal aşkar etmək üçün ən mühüm analiz üsullardan biridir. Qərb blot ildə, zülallar monoklonal ya poliklonal antikor istifadə edərək, onları aşkar etmək üçün membranların hərəkətsiz olunur.
SDS-poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) tərəfindən yerli proteinlər polipeptidin uzunluğu ilə 3-D strukturu və ya denatüre proteinlər ilə ayrılır. Proteinlər daha sonra hədəf proteinə özgü antikorlar ilə boyanmış bir membrana (tipik olaraq nitroselüloz və ya PVDF) köçürülür. Antikorların qarşılıqlı reaktivlik məsələsini həll etmək üçün qələm elektroforez mərhələsi qərbdə blot analizinə daxil edilir.
Daha sonra ayrılan zülallar bir matrisə (əsasən bir nitroselüloz və ya PVDF membranı) qarışdırılır, burada antikorlar ilə boyanırlar. Antikorlar bir prob kimi fəaliyyət göstərir və xüsusi olaraq hədəf proteinə seçilir. Xüsusi reaksiyanın yerinin və intensivliyinin analizi, verilən nümunədə hədəf zülalların ifadə ifadələrini əks etdirir. Western blotting, jel elektroforezinin yüksək qətnaməsi və güclü spesifiklik və immunoassayın yüksək həssaslığı səbəbindən 1ng qədər aşağı olan hədəf proteinini aşkar edə bilər. Western blot metodu molekulyar biologiya, biokimya, immunogenetika və digər molekulyar tədqiqat sahələrində istifadə olunur.
Digər əlaqəli texnika dot blot təhlili, immunhistokimya və antikor immunostaining ilə toxuma və hüceyrələri zülal aşkar etmək üçün istifadə olunur immunocytochemistry və ferment bağlı İmmunosorbent ayar (ELISA) daxildir.
Ədəbiyyat / İstinadlar
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.

VialTweeter sonikatoru birdən çox flakonun eyni vaxtda nümunə hazırlanması üçün