Qərb basma üçün Ultrasonik lizisi

• qərb blot toxuma homogenate və ya mobil çıxarış nümunəsi xüsusi zülalların aşkarlanması üçün bir analitik prosedurdur.
• Qərb blot çalıştırmak üçün və ya ferment fəaliyyətini ölçmək üçün bir çox təhlillər hüceyrə kəməndə materialları (məsələn zülallar, DNT, subcellular fraqmentləri) daxil tələb edir.
• Sonication nəzarət mobil pozulması və lizisi üçün etibarlı və asan-idarə üsuludur.

Ultrasonik Cell pozulması

toxuma və mədəni hüceyrələri Zülal hasilatı çox bioloji biokimyəvi və analitik üsulları (PAGE, Western basma, ELISA, kütləvi spektrometri, və s.) və ya protein təmizlənməsi üçün ilk addımdır. Yüksək protein gəlir əldə etmək üçün, mobil material və toxuma səmərəli lysed / pozularsa olmalıdır. bitki hüceyrə və ya heyvan toxuma olsun, sonication mobil lysate asan və sürətli hazırlamaq üçün metodudur.

Sonication üstünlükləri

• sürətli & səmərəli
• asan əməliyyat
• yüksək protein gəlir
• reproducible / repeatable
• dəqiq nəzarət
• ölçeklenebilir

Western Immunoblotting üçün immunoprecipitation Protokol

A. Reagentlər

həllərin hazırlanması üçün belə Milli-Q kimi təmizlənmiş su istifadə edin.

• 1X Fosfat Önbellekli Saline (PBS)
• 1X Cell lizisi Buffer: 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM Sodium pyrophosphate 1 mM β-glycerophosphate 1 mM Na3VO4, 1 mkq / ml Leupeptin
  Mühüm: istifadə etmək üçün əlavə 1 mM PMSF dərhal əvvəl.
• 15 μl Zülal A + 15 μl Zülal G IP kifayətdir, ancaq əsas antikor və nümunə həcmi asılı ola bilər. Siz həmçinin pre-qarışıq protein A / G agarose istifadə edə bilərsiniz (məsələn Zülal A dovşan üçün IgG aşağı çəkmək və Zülal G siçan IgG üçün açılan)
• 3X SDS Nümunə Buffer: 187.5 mM Tris-HCl (25 ° C pH 6,8), w 6% / 0.03% mavi / v bromophenol w SDS, 30% qliserin, 150 mM DTT, v

Cell Lysates B. hazırlanması

• hüceyrələri məhsul. nondenaturing şərtlər altında hüceyrələri məhsul, media aradan qaldırılması və buz PBS bir dəfə hüceyrələri yaxalamaq.
• PBS çıxarın və hər boşqab (10 sm) 0,5 ml buz 1X mobil lizisi bufer əlavə 5 dəqiqə buz plitələr cücə.
• plitələr off hüceyrələri qaşımaq və Mikrosantrifüj borular transfer. buz üzərində saxlayın.
• Sonicate iki dəfə buz immunoprecipitation bufer 10 saniyə üçün (IP bufer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 və protease inhibitor mix). sonication üçün, VialTweeter və ya kimi bir probe ultrasonicator belə UP100H və ya Uf200 ः t ən uygundur.
• 4 ° C 10 dəqiqə 15,000 g Lysates sentrifuqa.
• yeni boru supernatant Transfer. (Lazım gələrsə, lysate -80 ° C saxlanıla bilər.)
• supernatant əsas antikor əlavə edin. əsas antikor ilə supernatant yüngül təşviqat altında 4 ° C 1 saat Soğutmalı olunur. İbtidai antikor adətən qərb basma üçün istifadə olunur daha çox konsentrasiya məbləğində 10x əlavə olunur. (Siz 100μL başına 1μg ilə başlaya bilər.)
• supernatant sonra başqa 1 saat üçün Protein A-agarose (Invitrogen) və Zülal G agarose bərabər qarışığı ilə daha kürtə olunur.
• IP bufer ilə agarose qranullar üç dəfə yumaq. Daha sonra 5 dəqiqə 95 ° C istilik ilə SDS-PAGE loading bufer ilə bağlı zülal çıxarış.

C. immunoprecipitation

• 200 μl mobil lysate edin və ibtidai antikor əlavə edin. incə 4 ° C gecə sallanan ilə cücə.
• protein A və ya G agarose muncuq (50% bead məhlulu 20 μl) ya əlavə edin. incə 4 ° C 1-3 saat üçün sallanan ilə cücə.
• 4 ° C 30 saniyə Mikrosantrifüj. Wash 1X mobil lizisi bufer 500 μl ilə beş dəfə kürəcik. Yıkama Ürünleri ərzində buz üzərində saxlayın.
• 20 μl 3X SDS nümunə bufer ilə kürəcik Resuspend. Vortex, sonra 30 saniyə Mikrosantrifüj.
• 14,000 X g 1 dəqiqə 95-100 ° 2-5 dəqiqə C və Mikrosantrifüj üçün nümunə qızdırmaq.
• SDS-PAGE gel (12-15%) üzrə nümunə (15-30 μl) bərpa edin.
• Qərb basma ilə nümunə təhlili.

ultrasonicator UP50H ilə Qərb Blot təhlili

Sonra protokol Kriebisch et al öyrənilməsi istifadə edilmişdir. (2011):
Ümumi zülal 1,25 ilə müalicə MC3T3-E1 hüceyrələri təcrid edildi (OH)₂D₃ (10^-8 M) və ya vasitə. Cells 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich) olan bufer ilə lysed edilmişdir; 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1% natrium dodecyl sulfat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) və 0,5% natrium deoxycholate (Merck). mobil lysate dövrü 1 2 × 10 s sonicated və 80 amplitude edildi UP50H Ultrasonik Processor (Hielscher, Ultrasəs texnologiyası, Teltow, Almaniya). Bundan sonra maddə 14 min rpmdə 10 dəqiqə santrifüj edilmiş və supernatant Western blotting üçün istifadə edilmişdir. Yirmi beş μq protein nümunə tampon və azaldıcı maddə (Invitrogen) qaynadılmış və sonradan 4-12% poliakrilamid jelləri (Invitrogen) istifadə edərək SDS-PAGE ilə ayrılmış və nitroselüloz membrana (GE sağlamlıq xidməti) ötürülmüşdür. 1% kalium (Sigma-Aldrich) və 1% Tris (1 M) olan TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl) ilə 1 saat bloklandı. Bloklandıqdan sonra, membran gecə 4 ° C-də birincil antikorla (R. Banerjee, Ann Arbor, MI, ABŞ laboratoriyasında hazırlanmış dovşan anti-insan CBS 1/500) 4 ° C-də yüngül təşviq ilə inkubasiya edilmişdir. Bir horseradish peroksidaz (HPR) -haqqında orta antikor (Dako) ilə inkubasiya oda temperaturu 1 saat müddətində həyata keçirildi. Bütün blotlar inkişaf etmiş xemilüminesans tərəfindən hazırlanmışdır (Perkin Elmer).

Ədəbiyyat / İstinadlar