ELISA analizləri üçün nümunələrin ultrasəslə hazırlanması

ELISA kimi analizlər in vitro diaqnostikada, xəstəliklə əlaqəli zülalların aşkarlanmasında və keyfiyyətə nəzarətdə (məs., qida allergenlərinin monitorinqində) geniş istifadə olunur. Nümunələrin ultrasəslə hazırlanması hüceyrələri lizisə uğratmaq və hüceyrədaxili zülalları, DNA, RNA və orqanelləri ayırmaq üçün sürətli, etibarlı və təkrarlana bilən bir üsuldur. Hielscher Ultrasonics ayrı-ayrı nümunələrin, çoxsaylı flakonların, həmçinin mikrotitr lövhələrinin və 96 quyulu lövhələrin rahat hazırlanması üçün müxtəlif ultrasəs həlləri təklif edir.

ELISA – Fermentlə əlaqəli immunosorbent analiz

ELISA fermentlə əlaqəli immunosorbent analiz deməkdir və liqand bağlanmasına əsaslanan analizlər kateqoriyasına aid, geniş istifadə olunan biokimyəvi analiz üsuludur. ELISA zamanı maye nümunə xüsusi bağlanma xüsusiyyətlərinə malik stasionar bərk fazanın üzərinə əlavə edilir. Adətən stasionar bərk faza quyulu lövhəyə və ya ELISA lövhəsinə örtük şəklində tətbiq olunur. Sonra müxtəlif maye reagentlər ardıcıl olaraq əlavə edilir, inkubasiya olunur və yuyulur; nəticədə quyudakı son mayedə optik dəyişiklik (məs., fermentativ reaksiya məhsulunun yaratdığı rəng əmələgəlməsi) baş verir. Optik dəyişiklik analitin miqdarını kəmiyyət üzrə «oxuma» adlandırılan ölçmə ilə müəyyən etməyə imkan verir. Kəmiyyət üzrə oxuma zamanı keçən işığın intensivliyini aşkarlamaq və ölçmək üçün spektrofotometr, flüorometr və ya lüminometr istifadə olunur. Aşkarlamanın həssaslığına analitik reaksiyalar zamanı siqnalın gücləndirilməsi təsir edir. Ferment reaksiyaları yaxşı öyrənilmiş və etibarlı gücləndirmə prosesləri olduğundan, siqnal yaratmaq üçün fermentlərdən istifadə olunur. Dəqiq kəmiyyət təyinini təmin etmək üçün fermentlər aşkarlama reagentlərinə sabit nisbətlərdə bağlanır; bu, immunosorbent analizin «fermentlə əlaqəli» adını da izah edir.
ELISA analizləri mikrotitr lövhələrində / 96 quyulu lövhələrdə aparıldığından, bu üsul lövhə əsaslı analiz üsulu kimi tanınır və məsələn, klinik in vitro diaqnostikada, tədqiqatlarda, dərman hazırlanmasında və s. anticisimlərin, peptidlərin, zülalların və hormonların aşkarlanması və miqdarının təyini üçün istifadə olunur.
ELISA üsulu tibbdə, biotexnologiyada və bitki patologiyasında tez-tez diaqnostik vasitə kimi istifadə olunur, həmçinin müxtəlif sənaye sahələrində keyfiyyətə nəzarət üçün mühüm ölçmə üsuludur.

Tam VialTweeter sistemi: UP200St ultrasəs prosessoruna qoşulmuş VialTweeter sonotrodu

Nümunələrin ultrasəslə hazırlanması üçün VialTweeter qurğusu ELISA analizlərindən əvvəl hüceyrə lizisi və zülal ekstraksiyası üçün istifadə olunur

ELISA-dan əvvəl nümunələrin ultrasəslə hazırlanması

ELISA analizi aparılmazdan əvvəl nümunələr hüceyrə lizisi və hüceyrədaxili zülalların, DNA, RNA və s. ekstraksiyası kimi hazırlıq mərhələlərindən keçməlidir. Ultrasəslə hüceyrə lizisinin və zülal ayrılmasının üstünlüyü yüksək səmərəlilik, etibarlılıq və təkrarlana bilməsidir. Bütün bu amillər yüksək keyfiyyətli diaqnostika və tədqiqat nəticələri əldə etmək üçün vacibdir

ELISA-dan əvvəl ultrasəslə lizisin üstünlükləri

Nümunənin bərabər işlənməsi
Tam lizis
Zülalların tam ekstraksiyası (məs., anticisimlər, DNA)
Hüceyrə tipinə optimal uyğunlaşdırma
İstənilən ölçüdə nümunə üçün
Təkrarlana bilən
Temperatur nəzarəti ilə
Məlumatların SD kartda avtomatik qeydə alınması

Bu təlimat laboratoriya, analiz və tədqiqat işlərində lizis, hüceyrələrin parçalanması, zülalların ayrılması, DNT və RNT fraqmentasiyası kimi nümunə hazırlama tapşırıqları üçün hansı növ ultrasəs cihazının daha uyğun olduğunu izah edir. Tətbiqinizə, nümunə həcminə, nümunə sayına və emal məhsuldarlığına uyğun ideal ultrasəs cihazı növünü seçin. Hielscher Ultrasonics sizin üçün ideal ultrasəs homogenizatoruna malikdir!

ELISA-dan əvvəl ultrasəslə hüceyrə lizisi protokolu

Hüceyrə kulturları üçün: Ultrasəslə hüceyrə lizisindən əvvəl hüceyrələri mikrosentrifuqada 270 x g-də 5 mins sentrifuqalayın. Supernatantı aspirasiya ilə kənarlaşdırın və hüceyrələri 30 – 100 μL RIPA buferində yenidən suspenziyalaşdırın. Sonra hüceyrə çöküntüsünü buz üzərində 30 min inkubasiya edin.
İndi hüceyrə nümunəsi ultrasəslə lizisə hazırdır:
Hazırlamalı olduğunuz nümunələrin sayından asılı olaraq, zond tipli ultrasəs cihazından (məs., UP200Ht S26d2 zondu ilə) və ya çoxsaylı nümunələr üçün ultrasəs cihazından (məs., eyni vaxtda 10-a qədər flakonun sonikasiyası üçün VialTweeter və ya mikrotitr lövhələri / 96 quyulu lövhələr üçün UIP400MPT) istifadə edin.
Tək nümunənin zondla sonikasiyası üçün hüceyrələri 1,5 mL-lik mikrosentrifuqa sınaq borularına yerləşdirin.
Ultrasəs cihazının rəqəmsal menyusunda ultrasəslə işləmə müddətini, ümumi enerji girişini, dövr rejimini və/və ya temperatur hədlərini əvvəlcədən təyin edin. Bu, yüksək dərəcədə etibarlı sonikasiyanı və təkrarlanmanı təmin edir.
Sonotrodu daxil edin və ultrasəs cihazını işə salın. Nümunəni bərabər sonikasiya etmək üçün ultrasəs zondunun mikro ucunu nümunənin daxilində ehtiyatla hərəkət etdirin.
Əksər hüceyrələr üçün ultrasəs lizisi hər biri 10 sec davam edən 2 –4 sonikasiya dövründən sonra tamamlanacaq.
Sonikasiyadan sonra sonotrodu nümunədən çıxarın. Nümunələr buz üzərində 5 min inkubasiya edilməlidir. Sonra hüceyrə qalıqlarını çökdürmək üçün 10.000 x g-də 20 min sentrifuqalayın. Supernatantları yeni mikrosentrifuqa sınaq borusuna köçürün. Analitləri etiketləyin və -20°C-də saxlayın.
Ultrasəs sonotrodu spirtlə yaxşıca silinərək və ya spirt, məsələn, 70% etanol ilə doldurulmuş stəkanda sonikasiya edilərək təmizlənə bilər. Titandan hazırlanmış bütün ultrasəs zondları avtoklavda sterilizasiya edilə bilər.

UP200St kimi zond tipli ultrasəs cihazları etibarlı toxuma homogenizatorlarıdır və genetikada nümunələrin hazırlanması, məsələn, E.coli lizisi üçün geniş istifadə olunur

E.coli hüceyrələrindən zülalların ekstraksiyası – UP200St ultrasəs zondu ilə

Toxuma homogenatları üçün:

Artıq hemolizə uğramış qanı tam kənarlaşdırmaq üçün toxumanı buz kimi soyuq PBS (0,01M, pH=7,4) ilə yuyun.
Toxumanı (böyrək, ürək, ağciyər, dalaq və s.) çəkin və xırda hissələrə parçalayın; bu hissələr PBS-də homogenləşdirilir. Tələb olunan PBS həcmi toxumanın çəkisindən asılıdır. Ümumi qayda olaraq, 1g toxuma üçün təxminən 9mL PBS tələb olunur. PBS-ə bir qədər proteaza inhibitoru əlavə etmək tövsiyə olunur. (Alternativ olaraq, proteaza və fosfataza inhibitorları qarışığı olan RIPA və ya hipotonik lizis buferi istifadə edilə bilər.)
Toxumanın ölçüsündən asılı olaraq, qısa müddətli vorteks işlənməsi (15 sec-lik impulslarla təxminən 1–2 min.) toxumanın ilkin işlənməsi üçün faydalı ola bilər.
Ultrasəs cihazınıza mikro uc, məsələn, S26d2 quraşdırın. Toxuma olan nümunə sınaq borusunu buz vannasına yerləşdirin.
Nümunəni ultrasəs cihazınızla, məsələn, UP200St (80% amplituda) ilə impuls rejimində (15sec işləmə, 15sec fasilə) 1 min. sonikasiya edin. Nümunəni buz vannasında saxlayın.
Daha sonra analiz üçün zülalı zənginləşdirmək məqsədilə xüsusi fraksiyalar (sitozolik, nüvə, mitoxondrial və ya lizosomal) əldə etmək üçün homogenatlar sentrifuqalanır. Nümunəni 5000×g-də 5 dəqiqə sentrifuqalayaraq supernatant əldə edilir.

MTP-24-8-96 sonotrodunun mikrotitr lövhələrinin quyularını sonikasiya etmək üçün səkkiz ultrasəs zondu var.

Sonikasiya zamanı etibarlı temperatur nəzarəti

Temperatur prosesə təsir edən həlledici amildir və bioloji nümunələrin işlənməsi üçün, məsələn, zülalların termik parçalanmasının qarşısını almaq baxımından xüsusilə vacibdir. Bütün mexaniki nümunə hazırlama üsulları kimi, sonikasiya da istilik yaradır. Bununla belə, Hielscher Ultrasonics cihazlarından istifadə edərkən nümunələrin temperaturuna yaxşı nəzarət etmək mümkündür. Nümunələrinizi analizdən əvvəl zond tipli ultrasəs cihazı və ya VialTweeter ilə hazırlayarkən onların temperaturunu izləmək və idarə etmək üçün sizə müxtəlif imkanlar təqdim edirik.

Nümunənin temperaturunun izlənməsi: Bütün Hielscher rəqəmsal ultrasəs prosessorları intellektual proqram təminatı və qoşula bilən temperatur sensoru ilə təchiz olunub. Temperatur sensorunu ultrasəs cihazına (məs., UP200Ht, UP200St, VialTweeter, çoxquyulu lövhələr üçün UIP400MTP sonikatoru) qoşun və temperatur sensorunun ucunu nümunə sınaq borularından birinə daxil edin. Rəqəmsal rəngli sensor ekran vasitəsilə ultrasəs prosessorunun menyusunda nümunənizin sonikasiyası üçün müəyyən temperatur intervalı təyin edə bilərsiniz. Maksimal temperatura çatdıqda ultrasəs cihazı avtomatik dayanacaq və nümunənin temperaturu təyin edilmiş temperatur ∆-nın aşağı həddinə enənədək fasilə verəcək. Sonra sonikasiya avtomatik olaraq yenidən başlayır. Bu ağıllı funksiya istiliyin yaratdığı parçalanmanın qarşısını alır.
Çoxsaylı nümunələr üçün VialTweeter ultrasəs qurğusunda nümunə sınaq borularını saxlayan titan blok əvvəlcədən soyudula bilər. Titan bloku əvvəlcədən soyutmaq üçün VialTweeter blokunu (yalnız sonotrodu, çevirici olmadan!) soyuducuya və ya dondurucuya qoymaq nümunədə temperaturun yüksəlməsini gecikdirməyə kömək edir. Mümkündürsə, nümunənin özü də əvvəlcədən soyudula bilər.
Sonikasiya zamanı soyutmaq üçün buz vannasından və ya quru buzdan istifadə edin. Sonikasiya zamanı nümunə sınaq borunuzu və ya borularınızı buz vannasına yerləşdirin. VialTweeter üçün quru buzla doldurulmuş dayaz qabdan istifadə edin və istiliyin sürətlə yayılması üçün VialTweeter qurğusunu quru buzun üzərinə qoyun.

Dünyanın hər yerində müştərilər bioloji, biokimyəvi, tibbi və klinik laboratoriyalarda gündəlik nümunə hazırlama işləri üçün Hielscher zond tipli ultrasəs cihazlarından, həmçinin çoxsaylı nümunələrin sonikasiyası üçün VialTweeter və UIP400MTP qurğularından istifadə edirlər. Hielscher prosessorlarının intellektual proqram təminatı və temperatur nəzarəti sayəsində temperatur etibarlı şəkildə idarə olunur və nümunələrin istiliyin təsirindən parçalanmasının qarşısı alınır. Hielscher ultrasəs həlləri ilə nümunələrin ultrasəslə hazırlanması yüksək dərəcədə etibarlı və təkrarlana bilən nəticələr verir!
Analizlər üçün çoxquyulu lövhələrə uyğun UIP400MTP sonikatoru ilə yüksək nümunə emal məhsuldarlığına malik sonikasiya haqqında daha ətraflı oxuyun!

Bizimlə əlaqə saxlayın! / Bizə sual verin!

Yüksək kəsmə təsirli ultrasəs homogenizatorları laboratoriya, laboratoriya masası, pilot və sənaye səviyyəsində emal üçün istifadə olunur.

Hielscher Ultrasonics laboratoriya, pilot və sənaye miqyasında qarışdırma tətbiqləri, dispersiya, emulsiyalaşdırma və ekstraksiya üçün yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs homogenizatorları istehsal edir.

Əlaqəli mövzular

Ədəbiyyat / İstinadlar

Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.

Bilməyə dəyər faktlar

ELISA-nın hansı növləri var?

ELISA-nın iş prinsipinə görə fərqlənən bir neçə növü var. Bunlar birbaşa ELISA, dolayı ELISA, sendviç ELISA, rəqabətli ELISA və tərs ELISA kimi tanınır. Aşağıda müxtəlif ELISA növlərinin, onların əsas xüsusiyyətlərinin və fərqlərinin icmalını təqdim edirik.
ELISA keyfiyyət və ya kəmiyyət formatında aparıla bilər. Keyfiyyət nəticələri sadəcə müsbət və ya mənfi nəticə verir, kəmiyyət ELISA-sında isə nümunənin optik sıxlığı (OD) standart əyri ilə müqayisə olunur; bu əyri adətən hədəf molekulun məlum konsentrasiyalı məhlulunun ardıcıl durulaşdırılması ilə əldə edilir.

Birbaşa ELISA

Birbaşa ELISA yalnız fermentlə işarələnmiş birincili anticismin istifadə olunduğu və ikincili anticisimlərin tələb olunmadığı ən sadə ELISA analiz formasıdır. Fermentlə işarələnmiş birincili anticisim birbaşa hədəfə, yəni antigenə bağlanır. Buferləşdirilmiş antigen məhlulu mikrotitr lövhəsinin (adətən 96 quyulu lövhələrin, ELISA lövhələrinin) hər quyusuna əlavə edilir və burada elektrik yüklərinin qarşılıqlı təsiri vasitəsilə plastik səthə yapışır. Birincili anticismə bağlı ferment öz substratı ilə reaksiyaya girdikdə spektrofotometr, flüorometr və ya lüminometrlə ölçülə bilən görünən siqnal yaradır.

Dolayı ELISA

Dolayı ELISA testi üçün həm birincili, həm də ikincili anticisim tələb olunur. Lakin birbaşa ELISA-dan fərqli olaraq, fermentlə işarələnən birincili deyil, ikincili anticisimdir. Antigen quyulu lövhədə immobilizasiya olunur və birincili anticisim ona bağlanır. Ardınca fermentlə işarələnmiş ikincili anticisim birincili anticismə bağlanır. Nəhayət, ikincili anticismə bağlı ferment öz substratı ilə reaksiyaya girərək aşkarlana bilən görünən siqnal yaradır.

Sendviç ELISA

Birbaşa və dolayı ELISA testlərində antigen quyulu lövhənin səthində immobilizasiya olunaraq örtük əmələ gətirdiyi halda, sendviç ELISA-da anticisim ELISA lövhəsinin plastik səthində immobilizasiya olunur. Sendviç ELISA-da immobilizasiya olunmuş anticisimlər tutucu anticisimlər kimi tanınır. Tutucu anticisimlərə əlavə olaraq, sendviç ELISA-da aşkarlayıcı anticisimlər adlandırılan anticisimlər də tələb olunur. Aşkarlayıcı anticisimlərə işarələnməmiş birincili aşkarlayıcı anticisim və fermentlə işarələnmiş ikincili aşkarlayıcı anticisim daxildir.
Mərhələli şəkildə, maraq doğuran antigen lövhədə immobilizasiya olunmuş tutucu anticismə bağlanır. Sonra birincili aşkarlayıcı anticisim antigenə bağlanır. Bundan sonra ikincili aşkarlayıcı anticisim birincili aşkarlayıcı anticismə bağlanır. Son reaksiya mərhələsində ferment öz substratı ilə reaksiyaya girərək optik yolla aşkarlana bilən görünən siqnal yaradır.

Rəqabətli ELISA

İnhibisiya ELISA-sı kimi də tanınan rəqabətli ELISA inhibitor antigenin istifadəsini nəzərdə tutduğundan ən mürəkkəb ELISA növüdür. Üç formatın hər biri – birbaşa, dolayı və sendviç ELISA – rəqabətli ELISA formatına uyğunlaşdırıla bilər. Rəqabətli ELISA-da inhibitor antigen və maraq doğuran antigen birincili anticismə bağlanmaq üçün rəqabət aparır.
Rəqabətli ELISA üçün işarələnməmiş anticisim öz antigeninin, yəni nümunənin iştirakı ilə inkubasiya olunur. Sonra bu bağlanmış anticisim/antigen kompleksləri antigenlə örtülmüş quyuya əlavə edilir.
Bağlanmamış anticisimləri kənarlaşdırmaq üçün lövhə yuyulur. Rəqabətli ELISA-nın adı nümunədə antigen nə qədər çox olarsa, bir o qədər çox antigen-anticisim kompleksinin yaranması ilə bağlıdır. Bu o deməkdir ki, quyudakı antigenə bağlana biləcək bağlanmamış anticisimlər daha az olur və antigenlər mövcud anticisim uğrunda rəqabət aparmalıdır. Birincili anticismə uyğun ikincili anticisim əlavə edilir. Bu ikinci anticisim fermentlə əlaqəlidir. Substrat əlavə edildikdə qalan fermentlər xromogen və ya flüoresan siqnal yaradır.
Bu mərhələdə siqnalın sonradan doyma həddinə çatmasının qarşısını almaq üçün reaksiya dayandırılır.
Bəzi rəqabətli ELISA dəstlərində fermentlə əlaqəli anticisim əvəzinə fermentlə əlaqəli antigen olur. İşarələnmiş antigen birincili anticismin bağlanma yerləri uğrunda nümunənin antigeni ilə (işarələnməmiş) rəqabət aparır. Nümunədə antigen nə qədər az olarsa, quyuda bir o qədər çox işarələnmiş antigen saxlanılır və siqnal bir o qədər güclü olur.

Tərs ELISA

Tərs ELISA quyulu lövhələrdən istifadə etmir, antigenləri test mayesində suspenziya halında saxlayır. Tərs ELISA testi antigen vasitəsilə bağlanmış anticismin miqdarını ölçür. Bu üsul xüsusi olaraq Qərbi Nil virusunun zərf zülalını və onun virusa spesifik anticisimləri necə tapa bildiyini aşkarlamaq və araşdırmaq üçün hazırlanmışdır.

ELISA üçün hansı fermentativ markerlər istifadə olunur?

Aşağıdakı siyahıda ELISA analizlərində ən çox istifadə olunan və analiz tamamlandıqdan sonra nəticələrin ölçülməsinə imkan verən fermentativ markerlər göstərilir.

OPD (o-fenilendiamin dihidroxlorid) tez-tez konyuqasiya olunmuş zülal kimi istifadə olunan HRP-ni (xren peroksidazasını) aşkarlamaq üçün kəhrəba rənginə çevrilir.
TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin) HRP-ni aşkarlayarkən mavi rəngə, sulfat və ya fosfat turşusu əlavə edildikdən sonra isə sarı rəngə çevrilir.
ABTS (2,2′-azinobis [3-etilbenzotiazolin-6-sulfon turşusu]-diammonium duzu) HRP-ni aşkarlayarkən yaşıl rəngə çevrilir.
PNPP (p-nitrofenil fosfat, dinatrium duzu) qələvi fosfatazanı aşkarlayarkən sarı rəngə çevrilir.