ELISA Təhlilləri üçün Ultrasəs Nümunəsinin Hazırlanması
ELISA kimi analizlər in vitro diaqnostika, xəstəliklə əlaqəli zülalların aşkarlanması və keyfiyyətə nəzarət (məsələn, qida allergenlərinin monitorinqi) üçün geniş istifadə olunur. Ultrasəs nümunəsinin hazırlanması hüceyrəni parçalamaq və hüceyrədaxili zülalları, DNT, RNT və orqanelləri təcrid etmək üçün sürətli, etibarlı və təkrarlana bilən bir texnikadır. Hielscher Ultrasonics tək nümunələrin, çoxlu flakonların, həmçinin mikrotitr plitələrin və 96 quyu boşqablarının rahat hazırlanması üçün müxtəlif ultrasəs həllər təklif edir.
ELISA – Fermentlə Bağlı İmmunosorbent Təhlili
ELISA fermentlə əlaqəli immunosorbent analizi ifadə edir və liqand bağlayan analizlər kateqoriyasında geniş istifadə olunan biokimyəvi analiz üsuludur. ELISA-da maye nümunə xüsusi bağlayıcı xüsusiyyətlərə malik stasionar bərk fazaya əlavə edilir. Normalda stasionar bərk faza quyu lövhəsinə və ya ELISA plitəsinə örtük kimi tətbiq olunur. Sonra müxtəlif maye reagentlər ardıcıl olaraq əlavə edilir, inkubasiya edilir və yuyulur ki, sonda quyudakı son mayedə optik dəyişiklik (məsələn, fermentativ reaksiyanın məhsulu ilə rəng inkişafı) baş verir. Optik dəyişiklik analitin kəmiyyətini sözdə kəmiyyətlə ölçməyə imkan verir “oxu”. Kəmiyyət oxunması üçün ötürülən işığın intensivliyini aşkar etmək və ölçmək üçün spektrofotometr, flüorometr və ya luminometr istifadə olunur. Aşkarlamanın həssaslığına analitik reaksiyalar zamanı siqnalın gücləndirilməsi təsir göstərir. Ferment reaksiyaları yaxşı araşdırıldığından və etibarlı gücləndirmə prosesləri olduğundan, siqnal yaratmaq üçün fermentlərdən istifadə olunur. Dəqiq kəmiyyətin müəyyən edilməsinə imkan vermək üçün fermentlər müəyyən nisbətlərdə aşkarlama reagentləri ilə əlaqələndirilir ki, bu da “fermentlə əlaqəli” immunosorbent analizinin adını da izah edir.
ELISA analizləri mikrotiter plitələrdə / 96 quyu boşqablarda aparıldığı üçün o, boşqab əsaslı analiz texnikası kimi tanınır və məsələn, klinik in-vitro diaqnostikada, tədqiqatda, dərman hazırlanmasında və s. antikorların, peptidlərin, zülalların, və hormonlar.
ELISA texnikası tez-tez tibbdə, biotexnologiyada, bitki patologiyasında diaqnostika vasitəsi kimi istifadə olunur və eyni zamanda bir çox sənaye sahələrində keyfiyyətə nəzarətin vacib ölçülməsidir.
Ultrasonik nümunə hazırlama vahidi VialTweeter ELISA analizlərindən əvvəl hüceyrə lizisi və zülal çıxarılması üçün istifadə olunur
ELISA-dan əvvəl ultrasəs nümunəsinin hazırlanması
ELISA analizi həyata keçirilməzdən əvvəl nümunələr hüceyrə lizisi və hüceyrədaxili zülalların, DNT, RNT və s. ekstraksiyası kimi hazırlıq mərhələlərini tələb edir. Ultrasəs hüceyrə lizisi və zülal izolyasiyasının üstünlüyü onun yüksək effektivliyi, etibarlılığı və təkrar istehsalıdır. Bütün bu amillər yüksək keyfiyyətli diaqnostika və tədqiqat nəticələri əldə etmək üçün vacibdir
- Homojen nümunə müalicəsi
- Tam lizis
- Tam zülal çıxarılması (məsələn, antikorlar, DNT)
- Hüceyrə tipinə optimal uyğunlaşma
- İstənilən nümunə ölçüsü üçün
- təkrarlana bilən
- temperatura nəzarət
- SD kartda məlumatların avtomatik protokollaşdırılması
Pre-ELISA Ultrasonik Hüceyrə Lizisi üçün Protokol
- Hüceyrə mədəniyyətləri üçün: Ultrasəs hüceyrə lizizindən əvvəl hüceyrələri mikrosentrifuqada 270 xg-də 5 dəqiqə sentrifuqa edin. Süpernatantı aspirasiya yolu ilə çıxarın və hüceyrələri 30 – 100 μL RIPA buferində yenidən dayandırın. Sonra hüceyrə qranulunu 30 dəqiqə buz üzərində inkubasiya edin.
- İndi hüceyrə nümunəsi ultrasəs lizisi üçün hazırdır:
Zond tipli ultrasəs cihazından istifadə edin (məs UP200Ht S26d2 probu ilə) və ya ultrasəs çox nümunəli cihaz (məsələn, 10 flakonun eyni vaxtda sonikasiyası üçün VialTweeter və ya mikrotitr plitələr üçün UIP400MPT / 96 quyu boşqabları) hazırlamağınız lazım olan nümunələrin miqdarından asılı olaraq.
Tək nümunənin zond tipli sonikasiyası üçün hüceyrələri 1,5 ml mikrosentrifuqa borularına yerləşdirin. - Ultrasonikatorun rəqəmsal menyusunda ultrasəs müddətinizi, ümumi enerji daxilolmanızı, dövr rejimini və/və ya temperatur hədlərini əvvəlcədən təyin edin. Bu, yüksək etibarlı sonikasiya və təkrarlanma təmin edir.
- Sonotrodu daxil edin və ultrasəs cihazı yandırın. Nümunəni bərabər şəkildə sonlandırmaq üçün ultrasəs zondunun mikro ucunu nümunənin içindən yumşaq bir şəkildə hərəkət etdirin.
Əksər hüceyrələr üçün ultrasəs lizis 10 saniyəlik sonikasiyanın 2-4 dövründən sonra tamamlanacaq. - Sonikasiyadan sonra sonotrodu nümunədən çıxarın. Nümunələr buz üzərində 5 dəqiqə inkubasiya edilməlidir. Sonra zibilləri qranullaşdırmaq üçün 20 dəqiqə 10,000 xg-də sentrifuqa edin. Supernatantları yeni mikrosentrifuqa borusuna köçürün. Analitləri etiketləyin və -20°C-də saxlayın.
- Ultrasəs sonotrodu spirtlə, məsələn, 70% etanol ilə dolu bir şüşədə spirt və ya sonikasiya ilə düzgün şəkildə silməklə təmizlənə bilər. Titandan hazırlanmış bütün ultrasəs zondları avtoklavlanır.
E.coli hüceyrələrindən zülal çıxarılması ultrasəs zondu UP200St
- Artıq hemoliz qanını hərtərəfli çıxarmaq üçün toxumanı buz kimi soyuq PBS (0,01M, pH=7,4) ilə yuyun.
- Toxumanı (böyrək, ürək, ağciyər, dalaq və s.) çəkin və PBS-də homogenləşdirilmiş kiçik parçalara ayırın. Tələb olunan PBS həcmi toxumanın çəkisi ilə bağlıdır. Bir qayda olaraq, 1 q toxuma təxminən tələb edir. 9 ml PBS. PBS-ə bəzi proteaz inhibitorlarının əlavə edilməsi tövsiyə olunur. (Alternativ olaraq proteaz və fosfataz inhibitor kokteyli olan RIPA və ya hipotonik lizis tamponu istifadə edilə bilər.)
- Toxumanın ölçüsündən asılı olaraq qısa bir burulğan müalicəsi (15 saniyədə təqribən 1-2 dəqiqə) toxumanın ilkin müalicəsi üçün faydalı ola bilər.
- Ultrasonikatorunuza mikro ucu, məsələn, S26d2 quraşdırın. Nümunə borusunu toxuma ilə birlikdə buz banyosuna qoyun.
- Nümunəni ultrasəs cihazı ilə, məsələn, UP200St (80% amplituda) ilə 1 dəqiqə sonikləşdirin. nəbz rejimində (15 saniyə aktiv, 15 saniyə fasilə). Nümunəni buz banyosunda saxlayın.
- Sonra homogenatlar zülalın analiz üçün zənginləşdirilməsi üçün xüsusi hovuzlar (sitozolik, nüvə, mitoxondrial və ya lizosomal) əldə etmək üçün sentrifuqa edilir. Nümunəni 5 dəqiqə 5000 × q-da sentrifuqa etməklə, supernatant alınır.
MTP-24-8-96 sonotrode mikrotiter plitələrin quyularının sonikasiyası üçün səkkiz ultrasəs zonduna malikdir.
Sonication zamanı Etibarlı Temperatur Nəzarəti
Temperatur bioloji nümunələrin müalicəsi üçün, məsələn, zülalların istilik deqradasiyasının qarşısını almaq üçün xüsusilə vacib olan mühüm prosesə təsir edən amildir. Bütün mexaniki nümunə hazırlama üsulları kimi, sonication istilik yaradır. Bununla belə, Hielscher Ultrasonics cihazlarından istifadə edərkən nümunələrin temperaturu yaxşı idarə oluna bilər. Nümunələrinizin temperaturunu izləmək və nəzarət etmək üçün sizə müxtəlif variantları təqdim edirik, eyni zamanda onları zond tipli ultrasəs cihazı və ya VialTweeter ilə əvvəlcədən analitik olaraq hazırlayırıq.
- Nümunə istiliyinin monitorinqi: Bütün Hielscher rəqəmsal ultrasəs prosessorları ağıllı proqram təminatı və qoşula bilən temperatur sensoru ilə təchiz edilmişdir. Temperatur sensorunu ultrasəs cihazına qoşun (məsələn, UP200Ht, UP200 St, VialTweeter, UIP400MTP) və temperatur sensorunun ucunu nümunə borularından birinə daxil edin. Rəqəmsal rəngli toxunma displey vasitəsilə siz ultrasəs prosessorunun menyusunda nümunə sonikasiyanız üçün xüsusi temperatur diapazonunu təyin edə bilərsiniz. Maksimum temperatura çatdıqda ultrasəs cihazı avtomatik olaraq dayanacaq və nümunənin temperaturu təyin edilmiş temperaturun ∆ aşağı dəyərinə enənə qədər fasilə verəcəkdir. Sonra sonikasiya avtomatik olaraq yenidən başlayır. Bu ağıllı xüsusiyyət istidən qaynaqlanan deqradasiyanın qarşısını alır.
- Ultrasəs çox nümunəli VialTweeter qurğusuna gəldikdə, nümunə borularını saxlayan titan bloku əvvəlcədən soyudula bilər. Titan blokunu əvvəlcədən soyutmaq üçün VialTweeter blokunu (yalnız çeviricisiz sonotrode!) soyuducuya və ya dondurucuya qoyun, nümunədə temperaturun yüksəlməsini təxirə salmağa kömək edir. Mümkünsə, nümunənin özü də əvvəlcədən soyudula bilər.
- Sonikasiya zamanı sərinləmək üçün buz banyosundan və ya quru buzdan istifadə edin. Sonikasiya zamanı nümunə boru(lar)ınızı buz banyosuna qoyun. VialTweeter üçün quru buzla doldurulmuş dayaz nimçədən istifadə edin və VialTweeter-i quru buzun üzərinə qoyun ki, istilik sürətlə dağılsın.
Bütün dünyada müştərilər bioloji, biokimyəvi, tibbi və klinik laboratoriyalarda gündəlik nümunə hazırlama işləri üçün Hielscher zond-ultrasəs aparatlarından, həmçinin çox nümunəli sonikasiya qurğularından VialTweeter və UIP400MTP-dən istifadə edirlər. Hielscher prosessorlarının ağıllı proqram təminatı və temperatur nəzarəti, temperatur etibarlı şəkildə idarə olunur və istiliklə bağlı nümunənin deqradasiyası qarşısını alır. Hielscher ultrasəs həlləri ilə ultrasəs nümunəsinin hazırlanması yüksək etibarlı və təkrarlana bilən nəticələr verir!
Bizimlə əlaqə saxlayın! / Bizdən soruşun!
Hielscher Ultrasonics, laboratoriya, pilot və sənaye miqyasında qarışdırma tətbiqləri, dispersiya, emulsiya və ekstraksiya üçün yüksək performanslı ultrasəs homogenizatorları istehsal edir.
Ədəbiyyat / İstinadlar
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Bilməyə Dəyər Faktlar
ELISA növləri
Fəaliyyət prinsipi ilə seçilən ELISA-nın bir neçə növü var. Onlar birbaşa ELISA, dolayı ELISA, sendviç ELISA, rəqabətli ELISA və əks ELISA kimi tanınır. Aşağıda sizə müxtəlif ELISA növləri və onların əsas xüsusiyyətləri və fərqləri haqqında ümumi məlumat təqdim edirik.
ELISA keyfiyyət və ya kəmiyyət formatında həyata keçirilə bilər. Keyfiyyətli nəticələr sadə müsbət və ya mənfi nəticə verir, halbuki kəmiyyət ELISA-da nümunənin optik sıxlığı (OD) standart əyri ilə müqayisə edilir, bu adətən hədəf molekulun məlum konsentrasiyalı məhlulunun ardıcıl seyreltilməsidir.
Birbaşa ELISA
Birbaşa ELISA, Elisanın ən sadə analiz formasıdır, burada yalnız fermentlə işarələnmiş birincil antikor istifadə olunur və ikincil antikorlar tələb olunmur. Fermentlə işarələnmiş əsas antikor birbaşa hədəfə, yəni antigenə bağlanır. Tamponlanmış antigen məhlulu mikrotitr plitəsinin (adətən 96 quyulu lövhələr, ELISA lövhələri) hər quyusuna əlavə edilir, burada yük qarşılıqlı təsirləri vasitəsilə plastik səthə yapışır. Birincil antikorla əlaqəli ferment onun substratı ilə reaksiya verdikdə, spektrofotometr, flüorometr və ya luminometr vasitəsilə ölçülə bilən görünən bir siqnal istehsal edir.
Dolayı ELISA
Dolayı ELISA testi üçün həm əsas antikor, həm də ikincil antikor tələb olunur. Bununla belə, birbaşa ELISA-dan fərqli olaraq, birincil antikor deyil, ikincil antikor bir fermentlə etiketlənir. Antigen quyu boşqabına immobilizasiya edilir və əsas antikorla bağlanır. Sonradan, fermentlə işarələnmiş ikincil antikor birincil antikora bağlanır. Nəhayət, ikincili antikorla əlaqəli ferment, aşkar edilə bilən görünən bir siqnal yaratmaq üçün substratı ilə reaksiya verir.
sendviç ELISA
Birbaşa və dolayı ELISA testlərində antigen immobilizasiya edilir və quyu boşqabının səthinə örtülür, sendviç ELISA-da antikor ELISA lövhəsinin plastik səthinə immobilizasiya edilir. Sandviç ELISA-da immobilizasiya edilmiş antikorlar tutma antikorları kimi tanınır. Tutma antikorlarına əlavə olaraq sendviç ELISA-da aşkarlama antikorları da tələb olunur. Aşkarlama antikorlarına etiketlənməmiş ilkin aşkarlama antikoru və fermentlə işarələnmiş ikincili aşkarlama antikoru daxildir.
Addım-addım maraq antigeni boşqabda immobilizasiya edilmiş tutma antikoruna bağlanır. Sonra ilkin aşkarlama antikoru antigenə bağlanır. Bundan sonra, ikincil aşkarlama antikoru birincil aşkarlama antikoruna bağlanır. Son reaksiya mərhələsində, ferment optik olaraq aşkar edilə bilən görünən bir siqnal yaratmaq üçün substratı ilə reaksiya verir.
Rəqabətli ELISA
İnhibisyon ELISA kimi də tanınan rəqabətli ELISA, ən mürəkkəb ELISA növüdür, çünki o, inhibitor antigenin istifadəsini nəzərdə tutur. Üç formatın hər biri, birbaşa, dolayı və sendviç ELISA, rəqabətli ELISA formatına uyğunlaşdırıla bilər. Rəqabətli ELISA-da inhibitor antigen və maraq doğuran antigen birincil antikora bağlanmaq üçün rəqabət aparır.
Rəqabətli ELISA üçün etiketlənməmiş antikor onun antigeninin, yəni nümunənin iştirakı ilə inkubasiya edilir. Bu bağlanmış antikor/antigen kompleksləri daha sonra antigenlə örtülmüş quyuya əlavə edilir.
Boşqab yuyulur, beləliklə bağlanmamış antikorlar çıxarılır. Rəqabətli ELISA, nümunədə nə qədər çox antigen olarsa, bir o qədər çox antigen-antikor komplekslərinin əmələ gəlməsi ilə əlaqədardır. Bu o deməkdir ki, quyudakı antigenə bağlanmaq üçün daha az bağlanmamış antikor var və antigenlər mövcud antikor üçün rəqabət aparmalıdır. Birincil antikora uyğun gələn ikincil antikor əlavə edilir. Bu ikinci antikor fermentlə bağlıdır. Substrat əlavə edildikdə, qalan fermentlər xromogen və ya flüoresan siqnal verir.
Bu nöqtədə, siqnalın son doymasından qaçmaq üçün reaksiya dayandırılır.
Bəzi rəqabət qabiliyyətli ELISA dəstlərinə fermentlə əlaqəli antikor əvəzinə fermentlə əlaqəli antigen daxildir. İşarələnmiş antigen nümunə antigenlə (etiketlənməmiş) ilkin antikor bağlama yerləri üçün rəqabət aparır. Nümunədə nə qədər az antigen varsa, daha çox etiketlənmiş antigen quyuda saxlanılır və siqnal daha güclü olur.
Əks ELISA
Əks ELISA quyu boşqablarından istifadə etmir, lakin antigenləri sınaq mayesində asılmış vəziyyətdə qoyur. Əks ELISA testi antigen vasitəsilə bağlanmış antikor miqdarını ölçür. O, Qərbi Nil virusunun zərf zülalını və onun virusa xas anticisimləri necə tapa biləcəyini aşkar etmək və araşdırmaq üçün xüsusi olaraq hazırlanmışdır.
ELISA üçün istifadə olunan enzimatik marker
Aşağıdakı siyahı ELISA analizlərində istifadə edilən ən ümumi fermentativ markerləri verir və bu, analizin nəticələrini başa çatdıqdan sonra ölçməyə imkan verir.
- OPD (o-fenilendiamin dihidroxlorid) tez-tez birləşmiş zülal kimi istifadə edilən HRP-ni (Horseradish Peroxidase) aşkar etmək üçün kəhrəbaya çevrilir.
- TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin) HRP aşkar edərkən mavi olur və sulfat və ya fosfor turşusu əlavə edildikdən sonra sarıya çevrilir.
- ABTS (2,2′-Azinobis [3-etilbenzotiazolin-6-sulfonik turşu]-diammonium duzu) HRP aşkar edərkən yaşıl rəngə çevrilir.
- PNPP (p-Nitrofenil Fosfat, disodium duzu) qələvi fosfatazanı aşkar edərkən sarıya çevrilir.