SARS-CoV-2 koronavirusunun ultrasəslə inaktivasiyası protokolu

Hielscher VialTweeter SARS-COV-2 koronavirusunu inaktivasiya etmək üçün istifadə olunan, çoxsaylı nümunələrin hazırlanması üçün unikal ultrasəs qurğusudur. VialTweeter eyni vaxtda 10-a qədər nümunə flakonunu hazırlamağa imkan verir və buna görə də nümunələrin kütləvi emalı üçün ideal qurğudur.

SARS-CoV-2 koronavirusunun VialTweeter ilə inaktivasiyası

Fiksator kənarlaşdırıldıqdan sonra hüceyrələr qaşınaraq 1mL MEM/5% FBS mühitinə köçürülməzdən əvvəl hüceyrə monotəbəqələri fosfatla buferləşdirilmiş fizioloji məhlulla (PBS) üç dəfə yuyuldu və ultrasəslə işləndi (100% güc və amplitudada 3 × 10 saniyə işləmə, 10 saniyə fasilə). Bunun üçün Hielscher ultrasəs prosessorundan istifadə edildi: VialTweeter ilə UP200St qoşması. Supernatantlar 3000 × g-də 10 dəqiqə sentrifuqalama yolu ilə durulaşdırıldı. Welch və həmmüəlliflərinin (2020) SARS-CoV-2 koronavirusunun inaktivasiyasına dair tam protokolunu aşağıda oxuyun:

Hüceyrələr və virus

Vero E6 hüceyrələri (Vero C1008; ATCC CRL-1586) 10% (v/v) fetal dana serumu (FCS) əlavə edilmiş modifikasiya olunmuş Eagle minimal qidalı mühitində (MEM) kultivasiya edildi. İstifadə olunan virus SARS-CoV-2-nin hCOV-19/England/2/2020 ştammı idi; o, PHE tərəfindən 29/01/2020 tarixində Böyük Britaniyadakı ilk xəstə klasterindən təcrid edilmişdir. Bu virus 1-ci passajda əldə edildi və inaktivasiya tədqiqatlarında 2-ci və ya 3-cü passajda istifadə olundu.
SARS-CoV-2-nin inaktivasiyası, həmçinin reagentin sitotoksikliyinin kənarlaşdırılması üçün istifadə olunan reagentlər və kimyəvi maddələr barədə Welch və həmmüəlliflərinin (2020) elmi hesabatına baxın.

Detergentlərlə virusun inaktivasiyası – Welch və həmmüəlliflərinin SARS-CoV-2 koronavirusunun inaktivasiyası protokolu, 2020

SARS-CoV-2-nin inaktivasiyası


Kommersiya məhsulları üçün virus preparatları (toxuma kulturası mayesi, titr diapazonu: 1 × 10⁶ – 1 × 10⁸ PFU/ml) mövcud olduğu halda istehsalçının istifadə təlimatlarında tövsiyə olunan konsentrasiyalarda və kontakt müddətlərində, yaxud sınaq laboratoriyalarının xüsusi olaraq tələb etdiyi konsentrasiya və müddətlərdə reagentlərlə üç təkrarda işləndi. İstehsalçı tərəfindən konsentrasiya diapazonu göstərildiyi hallarda məhsulun nümunəyə ən aşağı nisbəti sınaqdan keçirildi (yəni sınaq məhsulunun tövsiyə olunan ən aşağı konsentrasiyası). Nümunə daşıma borularının reagentləri, istehsalçı tərəfindən nümunə mayesinin reagentə həcm nisbəti göstərilməyibsə, bir həcm toxuma kulturası mayesinin on həcm reagentə nisbətində sınaqdan keçirildi. Detergentlər, fiksatorlar və həlledicilər göstərilən konsentrasiyalarda, göstərilən müddətlərdə sınaqdan keçirildi. Bütün inaktivasiya mərhələləri otağın ətraf temperaturunda (18 – 25°C) aparıldı. Alternativ nümunə tiplərinin sınağı üçün virus göstərilən nümunə matrisinə 1:9 nisbətində əlavə edildi, sonra yuxarıda təsvir olunduğu kimi sınaq reagentləri ilə işləndi. Bütün eksperimentlərə sınaq reagenti yerinə ekvivalent həcmdə PBS ilə işlənmiş üç təkrarlı şərti (mock) kontrol nümunələri daxil edildi. Tələb olunan kontakt müddəti bitdikdən dərhal sonra işlənmiş nümunənin 1mL-i uyğun seçilmiş filtrasiya matrisindən istifadə edilməklə emal edildi. İnaktivasiya sınağı üçün reagentin kənarlaşdırılması daha böyük spin-kolonka formatında – Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) ilə, yaxud boş Pierce 10mL tutumlu sentrifuqa kolonkalarını (Thermo Fisher) SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR və ya Sephadex LH-20 ilə doldurub 4mL sıxlaşdırılmış qranul/qatran əldə etməklə həyata keçirildi. Amicon filtrlərindən istifadə etməklə təmizləmə üçün 2 × 500μl nümunə əvvəllər təsvir olunmuş metodla iki sentrifuqa filtri vasitəsilə təmizləndi, sonra birləşdirildi. Formaldehidin, həmçinin qlutaraldehidlə birlikdə formaldehidin kənarlaşdırılması üçün 1× 500μl nümunə həcmi ilə bir filtr istifadə olundu; emaldan sonra nümunə 500μl PBS-də yenidən suspenziya edildi və 400ul MEM/5% FBS-ə əlavə edildi. Yoluxmuş monotəbəqələrin inaktivasiyası üçün 12,5 cm² sahəli Vero E6 hüceyrə kolbaları (2,5 × 10⁶ hüceyrə/kolba, 2,5mL MEM/5% FBS mühitində) MOI 0,001 ilə yoluxduruldu və 37°C/5% CO₂ şəraitində 24 saat inkubasiya edildi. Supernatant kənarlaşdırıldı və hüceyrələr otaq temperaturunda 15 və ya 60 dəqiqə ərzində 5mL formaldehid, yaxud formaldehid və qlutaraldehid ilə fiksasiya edildi. Fiksator kənarlaşdırıldı və hüceyrələr qaşınaraq 1mL MEM/5% FBS mühitinə köçürülməzdən əvvəl monotəbəqələr PBS ilə üç dəfə yuyuldu, sonra VialTweeter qoşması olan UP200St (Hielscher Ultrasound Technology) ilə ultrasəslə işləndi (100% güc və amplitudada 3 × 10 saniyə işləmə, 10 saniyə fasilə). Supernatantlar 3000 × g-də 10 dəqiqə sentrifuqalama yolu ilə durulaşdırıldı.


Welch və həmmüəlliflərinin 2020-ci il protokoluna əsasən ultrasəs qurğusu VialTweeter ilə SARS-CoV-2 koronavirusunun inaktivasiyasında istifadə olunan reagent haqqında ətraflı məlumat

Hielscher VialTweeter istifadəsini də əhatə edən tam protokolu burada tapa bilərsiniz:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Təkmil ultrasəs dezintegratorları və hüceyrə parçalayıcıları

Çoxsaylı nümunələr üçün ultrasəs qurğusu VialTweeter bioloji, biokimyəvi və klinik laboratoriyalarda nümunələrin hazırlanması üçün çoxsaylı ultrasəs həllərindən yalnız biridir. Hielscher Ultrasonics tətbiqiniz üçün, məsələn, hüceyrə lizisi, hüceyrələrdən ekstraksiya, toxumaların homogenləşdirilməsi, lizatın həllolma qabiliyyətinin artırılması, həll etmə, nümunələrin qazsızlaşdırılması və s. üçün ideal ultrasəs dezintegratorunu təklif edir.
Saatda və gündə neçə nümunə emal etməli olduğunuzu, birbaşa, yoxsa dolayı ultrasəs emalına üstünlük verdiyinizi və nümunələrin ultrasəslə işlənməsinin məqsədini bizə bildirin. Gündəlik iş rejiminiz üçün ən uyğun ultrasəs qurğusunu sizə tövsiyə edəcəyik!
Hielscher Ultrasonics-in rəqəmsal ultrasəs prosessorları ağıllı proqram təminatı, məlumatların avtomatik qeydə alınması, temperatura nəzarət, ultrasəs emalının müddəti və dövr/impuls rejimi üçün asan ilkin sazlama imkanları, həmçinin nümunənin işıqlandırılması və brauzer vasitəsilə uzaqdan idarəetmə ilə təchiz olunub. Tədqiqatlarınızın və gündəlik işinizin mümkün qədər rahat və uğurlu olması üçün ultrasəs cihazlarımızı mümkün qədər ağıllı etməyə çalışırıq.
VialTweeter ilə nümunələrin ultrasəslə hazırlanması protokolları da daxil olmaqla daha çox tətbiq tapmaq üçün buraya klikləyin!