Sənaye istehsalında biomühəndislik yolu ilə yaradılmış hüceyrələrin ultrasəslə lizisi

E. coli kimi biomühəndislik yolu ilə yaradılmış bakteriya növləri, eləcə də genetik modifikasiya olunmuş məməli və bitki hüceyrə tipləri biotexnologiyada molekulların ekspressiyası üçün geniş istifadə olunur. Sintez edilmiş bu biomolekulları sərbəstləşdirmək üçün etibarlı hüceyrə parçalama üsulu tələb olunur. Yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs emalı səmərəli və etibarlı hüceyrə lizisi üçün təsdiqlənmiş üsuldur – böyük emal həcmlərinə asanlıqla miqyaslandırılır. Hielscher Ultrasonics böyük həcmdə yüksək keyfiyyətli biomolekullar istehsal etmək məqsədilə effektiv hüceyrə lizisi üçün sizə yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs avadanlığı təklif edir.

Hüceyrə fabriklərindən molekulların ekstraksiyası

Geniş çeşiddə biomolekulların istehsalı üçün müxtəlif mühəndislik üsulları ilə dəyişdirilmiş mikroblar və bitki hüceyrələri mikrob hüceyrə fabrikləri kimi istifadə edilə bilər. Bunlara bir çox digərləri ilə yanaşı Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana və yosunlar daxildir. Bu hüceyrə fabrikləri qida kimi və ya sənaye tətbiqləri üçün xammal olaraq istifadə edilən zülallar, lipidlər, biokimyəvi maddələr, polimerlər, bioyanacaqlar və oleokimyəvi maddələr istehsal edə bilər. Hüceyrə fabrikləri kimi istifadə olunan hüceyrələr qapalı bioreaktorlarda yetişdirilir; burada onlar yüksək səmərəliliyə, spesifikliyə və aşağı enerji tələbatına nail ola bilər.
Biomühəndislik yolu ilə yaradılmış hüceyrə kulturlarından hədəf molekulları ayırmaq üçün hüceyrələr parçalanmalıdır ki, hüceyrədaxili material sərbəstləşsin. Ultrasəs hüceyrə parçalayıcıları hüceyrələrin parçalanması və birləşmələrin sərbəstləşdirilməsi üçün yüksək etibarlılığa və səmərəliliyə malik üsul kimi geniş qəbul olunmuşdur.

Mikrob hüceyrə fabrikləri müxtəlif qiymətli birləşmələrin sintezi üçün istifadə olunan, metabolik mühəndislik üsulları ilə dəyişdirilmiş hüceyrələrdir. Hüceyrələrin ultrasəslə parçalanması qiymətli birləşmələri hüceyrənin daxilindən sərbəstləşdirmək üçün səmərəli və etibarlı üsuldur.
tədqiqat və qrafik: ©Villaverde, 2010.

Ultrasəs hüceyrə parçalayıcılarının üstünlükləri

Qeyri-termik, yumşaq, eyni zamanda yüksək səmərəli texnologiya olan ultrasəs parçalayıcıları laboratoriyada və sənayedə hüceyrələrin lizisi və yüksək keyfiyyətli ekstraktların əldə edilməsi üçün, məsələn, hüceyrə fabriklərindən molekulların ayrılması məqsədilə istifadə olunur.

Mikrob hüceyrə fabriklərinin səmərəli parçalanması üçün yüksək güclü ultrasəs

Ultrasəs hüceyrə parçalayıcılarının mexanizmi və təsirləri:
Hüceyrələrin ultrasəslə parçalanması ultrasəs dalğalarının gücündən istifadə edir. Ultrasəs homogenizatoru / hüceyrə parçalayıcısı titan ərintisindən hazırlanmış və təqribən 20 kHz yüksək tezlikdə rəqs edən zondla (sonotrod da adlanır) təchiz olunur. Bu o deməkdir ki, ultrasəs zondu ultrasəslə emal olunan mayeyə saniyədə 20.000 rəqs ötürür. Mayeyə ötürülən ultrasəs dalğaları növbələşən yüksək təzyiq / aşağı təzyiq dövrləri ilə xarakterizə olunur. Aşağı təzyiq dövründə maye genişlənir və çox kiçik vakuum qabarcıqları yaranır. Bu çox kiçik qabarcıqlar bir neçə növbələşən təzyiq dövrü ərzində böyüyür və nəhayət daha çox enerji uda bilmir. Bu anda kavitasiya qabarcıqları şiddətlə içəriyə doğru çökür və lokal olaraq fövqəladə yüksək enerji sıxlığına malik mühit yaradır. Bu hadisə akustik kavitasiya kimi tanınır və lokal olaraq çox yüksək temperaturlar, çox yüksək təzyiqlər və kəsilmə qüvvələri ilə xarakterizə olunur. Bu kəsilmə gərginlikləri hüceyrə divarlarını səmərəli şəkildə parçalayır və hüceyrənin daxili ilə ətrafdakı həlledici arasında kütlə ötürülməsini artırır. Tamamilə mexaniki üsul olaraq ultrasəslə yaradılan kəsilmə qüvvələri geniş istifadə olunur və bakteriya hüceyrələrinin parçalanması, eləcə də zülalların ayrılması üçün tövsiyə olunan prosedurdur. Sadə və sürətli hüceyrə parçalama üsulu olan ultrasəs emalı kiçik, orta və böyük həcmlərdə ayırma üçün idealdır. Hielscher şirkətinin rəqəmsal ultrasəs cihazları ultrasəs emalına dəqiq nəzarət üçün aydın parametrlər menyusu ilə təchiz olunmuşdur. Bütün ultrasəs emalı məlumatları avtomatik olaraq daxili SD karta yazılır və onlara asanlıqla giriş əldə etmək olur. Ultrasəslə parçalanma prosesi zamanı xarici soyutma, impuls rejimində ultrasəs emalı və s. kimi istiliyin uzaqlaşdırılması üçün təkmil imkanlar ideal proses temperaturunun saxlanmasını və bununla da ekstraksiya edilmiş istiliyə həssas birləşmələrin bütövlüyünü təmin edir.

Tədqiqatlar hüceyrələrin ultrasəslə parçalanmasının və ekstraksiyanın üstünlüklərini vurğulayır

Prof. Chemat et al. (2017) öz tədqiqatlarında belə yekunlaşdırırlar: “Ultrasəs dəstəkli ekstraksiya qida və təbii məhsullar üçün ənənəvi üsullara ekoloji və iqtisadi cəhətdən əlverişli alternativdir. Əsas üstünlüklər ekstraksiya və emal müddətinin, istifadə olunan enerji və həlledicilərin miqdarının, texnoloji əməliyyatların sayının və CO₂ emissiyalarının azalmasıdır.”
Gabig-Ciminska et al. (2014) DNT-ni sərbəstləşdirmək məqsədilə sporların lizisi üzrə tədqiqatlarında yüksək təzyiqli homogenizatordan və ultrasəs hüceyrə parçalayıcısından istifadə etmişlər. Hər iki hüceyrə parçalama üsulunu müqayisə edən tədqiqat qrupu spor DNT-si üçün hüceyrə lizisi ilə bağlı belə nəticəyə gəlir: “Təhlil yüksək təzyiqli homogenləşdirmədən alınan hüceyrə lizatlarından istifadə etməklə aparılmışdır. Sonradan biz hüceyrələrin ultrasəslə parçalanmasının bu məqsəd üçün müstəsna üstünlüklərə malik olduğunu anladıq. Bu üsul kifayət qədər sürətlidir və kiçik nümunə həcmləri üçün tətbiq oluna bilər.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Qida istehsalı üçün hüceyrə fabriklərindən biomolekullar

Mikrob hüceyrə fabrikləri bakteriyalar, mayalar, göbələklər və s. kimi mikrob mikroorqanizmlərin metabolik biomühəndisliyi vasitəsilə yüksək çıxımla təbii və qeyri-təbii metabolitlər istehsal etmək üçün mikrob orqanizmlərdən istifadə edən əlverişli və səmərəli istehsal metodologiyasıdır. Məsələn, böyük həcmdə fermentlər Aspergillus oryzae, göbələklər və bakteriyalar kimi mikroorqanizmlərdən istifadə etməklə istehsal olunur. Bu böyük həcmdə istehsal edilən fermentlər qida və içki istehsalında, eləcə də kənd təsərrüfatında, bioenergetikada və məişət təmizliyi və qulluq sahəsində istifadə olunur.
Acetobacter xylinum və Gluconacetobacter xylinus kimi müəyyən bakteriyalar fermentasiya prosesi zamanı sellüloza istehsal edir; bu zaman nanoliflər aşağıdan yuxarıya qurulma prosesi ilə sintez olunur. Bakterial sellüloza (mikrob sellülozası kimi də tanınır) kimyəvi baxımdan bitki sellülozasına ekvivalentdir, lakin yüksək kristallıq dərəcəsinə və yüksək təmizliyə (liqnin, hemisellüloza, pektin və digər biogen komponentlərdən azad) malikdir, həmçinin sellüloza nanoliflərindən toxunmuş üçölçülü (3D) torvari şəbəkədən ibarət unikal quruluşu vardır. (cf. Zhong, 2020) Bitki mənşəli sellüloza ilə müqayisədə bakterial sellüloza ekoloji baxımdan daha dayanıqlıdır və istehsal olunan sellüloza təmiz olduğundan mürəkkəb təmizləmə mərhələləri tələb etmir. Ultrasəs emalı və NaOH və ya SDS (natrium dodesil sulfat) istifadə edilən həlledici ekstraksiyası bakterial sellülozanın bakteriya hüceyrələrindən ayrılması üçün çox effektivdir.

Dərman və vaksin istehsalı üçün hüceyrə fabriklərindən biomolekullar

Hüceyrə fabriklərindən əldə olunan ən mühüm əczaçılıq məhsullarından biri insan insulinidir. Biomühəndislik yolu ilə insulin istehsalı üçün əsasən E. coli və Saccharomyces cerevisiae istifadə olunur. Biosintez edilmiş nanoölçülü molekullar yüksək biouyğunluq təmin etdiyindən ferritin kimi bioloji nanohissəciklər çoxsaylı bioistehsal tətbiqləri üçün üstünlüklərə malikdir. Bundan əlavə, metabolik mühəndislik üsulları ilə dəyişdirilmiş mikroblarda istehsal əldə olunan çıxım baxımından çox vaxt əhəmiyyətli dərəcədə daha effektivdir. Məsələn, artemisinin turşusunun, resveratrolun və likopenin istehsalı on dəfədən bir neçə yüz dəfəyədək artmışdır və sənaye miqyaslı istehsal artıq qurulmuşdur və ya onun qurulması istiqamətində işlər aparılır. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Məsələn, ferritin və virusabənzər hissəciklər kimi öz-özünə yığılma xüsusiyyətlərinə malik zülal əsaslı nanoölçülü biomolekullar vaksinlərin hazırlanması üçün xüsusilə maraqlıdır, çünki onlar patogenlərin həm ölçüsünü, həm də quruluşunu təqlid edir və immun hüceyrələrlə qarşılıqlı təsiri təşviq etmək üçün antigenlərin səthə konyuqasiyasına imkan verir. Belə molekullar müəyyən hədəf molekulu istehsal edən hüceyrə fabrikləri adlanan sistemlərdə (məsələn, mühəndislik üsulları ilə dəyişdirilmiş E. coli ştammlarında) ekspressiya olunur.

Ferritinin sərbəstləşdirilməsi üçün E. coli BL21-in ultrasəslə lizisi protokolu

Ferritin əsas funksiyası dəmirin saxlanması olan zülaldır. Ferritin vaksinlərdə öz-özünə yığılan nanohissəciklər kimi perspektivli imkanlar nümayiş etdirir və burada vaksin komponentlərinin (məsələn, SARS-Cov-2 spayk zülallarının) çatdırılma vasitəsi kimi istifadə olunur. Sun et. al. (2016)-nın elmi tədqiqatı rekombinant ferritinin aşağı NaCl konsentrasiyalarında (≤50 mmol/L) Escherichia coli-dən həll olan formada sərbəstləşdirilə bildiyini göstərir. E. coli BL21-də ferritinin ekspressiyası və ferritinin sərbəstləşdirilməsi üçün aşağıdakı protokol uğurla tətbiq edilmişdir. Rekombinant pET-28a/ferritin plazmidi E coli BL21 (DE3) ştammına transformasiya edilmişdir. Ferritinli E coli BL21 (DE3) hüceyrələri 37°C-də 0,5% kanamisin olan LB qida mühitində yetişdirilmiş və OD600 göstəricisi 0,6 olduqda 0,4% izopropil-β-D-tioqalaktopiranozidlə 37°C-də 3 saat ərzində induksiya edilmişdir. Sonra yekun kultur 4°C-də 10 dəqiqə ərzində 8000g-də sentrifuqalanaraq toplanmış və çöküntü götürülmüşdür. Daha sonra çöküntü müvafiq olaraq LB mühitində (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% maya ekstraktı)/lizis buferində (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) və müxtəlif konsentrasiyalı NaCl məhlullarında (0, 50, 100, 170 və 300 mmol/L) yenidən suspenziya halına gətirilmişdir. Bakteriya hüceyrələrinin lizisi üçün ultrasəs emalı impuls rejimində tətbiq edilmişdir: məsələn, UP400St ultrasəs cihazı ilə 100% amplitudada, 5 saniyə AKTİV, 10 saniyə QEYRİ-AKTİV iş dövrü ilə 40 dövr ərzində) və sonra 4°C-də 15 dəqiqə ərzində 10 000g-də sentrifuqalanmışdır. Supernatant və çöküntü natrium dodesil sulfatlı poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) ilə təhlil edilmişdir. Natrium dodesil sulfatla boyanmış bütün gellər yüksək ayırdetməli skanerlə skan edilmişdir. Gel təsvirləri Magic Chemi 1D proqram təminatı ilə təhlil edilmişdir. Optimal aydınlıq üçün zülal zolaqları parametrlər tənzimlənərək aşkar edilmişdir. Zolaqlara dair məlumatlar üç texniki təkrardan əldə edilmişdir. (cf. Sun et al., 2016)

Hüceyrə fabriklərinin sənaye lizisi üçün ultrasəs hüceyrə parçalayıcıları

Ultrasəslə lizis və ekstraksiya hüceyrə fabriklərindən metabolitləri sərbəstləşdirmək üçün etibarlı və rahat üsuldur və bununla hədəf molekulların effektiv istehsalına kömək edir. Ultrasəs hüceyrə parçalayıcıları laboratoriya ölçüsündən sənaye ölçüsünədək mövcuddur və proseslər tamamilə xətti şəkildə miqyaslandırıla bilər.
Hielscher Ultrasonics yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs parçalayıcıları üzrə sizin səriştəli tərəfdaşınızdır və laboratoriya masası üzərindəki və sənaye qurğularında ultrasəs sistemlərinin quraşdırılması sahəsində uzunmüddətli təcrübəyə malikdir.
Təkmil aparat və proqram təminatına gəldikdə, Hielscher Ultrasonics hüceyrə parçalama sistemləri optimal proses nəzarəti, asan istismar və istifadə rahatlığı üçün bütün tələbləri ödəyir. Hielscher ultrasəs cihazlarının müştəriləri və istifadəçiləri Hielscher ultrasəs hüceyrə parçalayıcılarının və ekstraktorlarının rəqəmsal sensor ekran və brauzer vasitəsilə uzaqdan idarəetmə ilə prosesin dəqiq monitorinqinə və idarə olunmasına imkan verməsini üstünlük kimi qiymətləndirirlər. Bütün mühüm ultrasəs emalı məlumatları (məsələn, xalis enerji, ümumi enerji, amplituda, müddət, temperatur, təzyiq) avtomatik olaraq inteqrasiya edilmiş SD kartda CSV faylı kimi saxlanılır. Bu, yenidən əldə oluna bilən və təkrarlana bilən nəticələr əldə etməyə kömək edir, prosesin standartlaşdırılmasını və Yaxşı İstehsalat Təcrübələri (cGMP) tələblərinin yerinə yetirilməsini asanlaşdırır.
Əlbəttə, Hielscher ultrasəs prosessorları tam yük altında 24/7 işləmək üçün hazırlanmışdır və buna görə sənaye istehsalı şəraitində etibarlı şəkildə istismar edilə bilər. Yüksək davamlılıq və az texniki xidmət tələbatı sayəsində ultrasəs avadanlığının dayanma müddəti çox azdır. CIP (yerində təmizləmə) və SIP (yerində sterilizasiya) funksiyaları zəhmət tələb edən təmizləmə işlərini minimuma endirir, xüsusən də maye ilə təmasda olan bütün hissələr hamar metal səthlərdən ibarət olduğundan (gizli dəliklər və ya ucluqlar yoxdur).

Aşağıdakı cədvəl ultrasəs cihazlarımızın təxmini emal gücü haqqında təsəvvür yaradır: