Ultrasonikasiya plazmid DNT-ni parçalamaq üçün etibarlı bir texnikadır. Dəqiq idarə oluna bilən amplituda, pulsasiya rejimi və temperaturun idarə edilməsi ultrasəs cihazının zərərsiz plazmid parçalanması üçün ən vacib xüsusiyyətləridir. Bundan əlavə, müəyyən agentlərin istifadəsi plazmidin deqradasiyasına qarşı qorunmağa kömək edir. Hielscher Ultrasonics, tək flakonlardan idarə olunan plazmid parçalanması üçün müxtəlif həllər təklif edir, eyni zamanda çoxsaylı nümunələrin sonication, eləcə də çox quyulu lövhələr. Uğurlu ultrasəs plazmid parçalanması haqqında daha çox məlumat əldə edin!

Ultrasonication istifadə plazmid kəsmə

DNT nümunələri ultrasəs dalğalarına məruz qaldıqda, ultrasəslə yaradılan vibrasiyalar mexaniki qüvvələr vasitəsilə yüksək molekulyar çəkili DNT molekullarını kəsən və ya parçalayan mayedə akustik kavitasiya yaradır. Sonication, kiçik fraqment ölçülərinin yüksək qətnamə əldə etmək üçün tamamilə vacib olduğu Xromatin İmmunoprecipitation (ChIP) kimi tətbiqlər də daxil olmaqla, toplu DNT kəsmə təcrübələri üçün ən çox istifadə edilən üsuldur. (müq. Tseng və başqaları, 2012)
Plazmid DNT (pDNA) DNT-nin spesifik formasıdır, halqa forması ilə xarakterizə olunur və bakteriyalarda və bəzi eukariotlarda olur.
Supercoiled pDNA plazmid DNT-nin arzu olunan formasıdır, çünki o, avtomatlaşdırılmış ardıcıllıq və transfeksiya kimi aşağı axın proseslərində ən yaxşı nəticələri göstərir. Ultrasonikasiya pDNA-nı, o cümlədən supercoiled pDNA-nı uğurla parçalamaq üçün uyğundur.
Tompson və başqaları. (2008) nümayiş etdirdi ki, supercoiled DNT-ni parçalamaqla tanınan plazmid sonikasiyası, phred20 ardıcıllığının oxu uzunluqlarını Beckman Coulterin nəzarət şablonundan və ya enzimatik olaraq xəttiləşdirilmiş plazmidlərdən əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənmədiyi nöqtəyə qədər yaxşılaşdırmaq üçün təsirli bir yoldur.

Plazmid vektorlarının istifadəsi

Plazmidlər tez-tez genləri klonlaşdırmaq, köçürmək və manipulyasiya etmək üçün alətlər kimi istifadə olunur. Plazmidlərdən bu məqsədlər üçün eksperimental olaraq istifadə edildikdə, onlara vektorlar deyilir. DNT fraqmentləri və ya genləri plazmid vektoruna daxil edilə bilər və sözdə rekombinant plazmid yaradır. Plazmid vektorları rekombinant DNT-ni ana hüceyrəyə sürmək üçün vasitə kimi istifadə olunur və molekulyar klonlaşdırmanın əsas komponentidir.
“Qeyri-viral vektorlar müxtəlif mürəkkəb xəstəliklərin müalicəsi üçün gen terapiyasında potensial istifadəsi üçün geniş şəkildə öyrənilir. Qeyri-viral vektorlar plazmid DNT-ni fiziki, kimyəvi və enzimatik deqradasiyadan qoruyur və DNT molekulunu hədəf sahəyə çatdırır. Məsələn, kationik liposomlar, xitozan və digər müsbət yüklü nanohissəciklər elektrostatik qarşılıqlı təsir vasitəsilə plazmid DNT ilə komplekslər əmələ gətirirlər. Bununla belə, asanlıqla əmələ gələn katyonik liposomlar/plazmid DNT kompleksləri nisbətən böyükdür (yəni, 300-400 nm) və təbiətcə heterojendir və bu, onların əczaçılıq tətbiqlərində istifadəsini çətinləşdirir. Böyük və heterojen plazmid DNT/liposomlar, plazmid DNT/aerozollar və plazmid DNT/peptid kompleksləri ultrasəsdən istifadə edərək daha kiçik və homojen hissəciklərə endirilə bilər.” (Sarker və başqaları, 2019)
Plazmid vektorlarının istifadəsi üçün görkəmli nümunə CRISPR–Cas9-dur. CRISPR–Cas9 sistemi adətən hüceyrələrə hədəf ardıcıllığını, CRISPR bələdçisini və Cas9-u kodlayan tək böyük plazmid və ya çoxlu kiçik plazmid kimi çatdırılır.

Nanopresipitasiya ilə DNT yüklü PLGA nanohissəciklərinin ultrasəs hazırlanması

Jo və başqaları. (2020) model CRISPR-Cas9 plazmidinin ilkin sümük iliyindən əldə edilən makrofaqlara çatdırılması üçün nanohissəcik daşıyıcısı yaratmaq üçün poli(laktik-ko-qlikolik turşu) (PLGA) istifadə etmişdir. PLGA nanohissəciklərinin nanoçökməsi üçün iki fərqli son qrupu (ester və amin qrupları) olan PLGA istifadə edilmişdir ki, müsbət yüklü amin uc qapaqları onun və mənfi yüklü onurğa sütunu arasındakı yük qarşılıqlı təsirinə görə kapsulyasiyanın səmərəliliyini və yüklənməsini artırır. DNT. 50 mL polipropilen konusvari santrifüj borusunda 100 mq Pluronic F127 20 ml avtoklavlanmış DI suda burulğanla qarışdırıldıqdan sonra ultrasəs vannası istifadə edərək 30 dəqiqə yumşaq sonikasiya ilə həll edildi.bax CupHorn). Avtoklavlanmış maqnit qarışdırma çubuğu əlavə edildi və məhlul 600 rpm-də 30 dəqiqə ərzində qarışdırıldı, digər məhlullar hazırlanır. DNT-nin qeyri-spesifik adsorbsiyasını minimuma endirmək üçün şüşə qablar əvəzinə plastik laboratoriya qabları istifadə edilmişdir. DMF-də həll edilmiş PLGA (44,48 mq/ml) və THF-də (0,667 mq/ml) həll edilmiş TIPS pentasen məhlulları ayrıca hazırlanmışdır. PLGA 30 dəqiqə sonikasiya edilməzdən əvvəl 30 dəqiqə ərzində DMF-də nəmlənmək üçün sakit şəkildə buraxıldı. (tam protokol üçün bax Jo et al., 2020)

Sonikasiya zamanı plazmid DNT-nin qorunması

Plazmidlər və super qıvrılmış plazmidlər də daxil olmaqla DNT yüksək həssas deqradasiyadır. Mövcud olan bütün parçalanma üsulları müəyyən mənfi cəhətləri ilə tanınır. Ultrasəs DNT-nin parçalanması üstünlük verilən üsullardan biridir, çünki qoruyucu tədbirlərlə birlikdə idarə olunan sonikasiya DNT zəncirlərinin kəsilmə və istilik nəticəsində zədələnməsini azaltmağa imkan verir.
Ultrasəs DNT-nin kəsilməsi zamanı aşağı amplituda parametrləri, pulsasiya rejimi və temperatur nəzarəti ilə yanaşı, müəyyən agentlərin istifadəsi DNT deqradasiyasına qarşı əhəmiyyətli qoruyucu təsir göstərmişdir. Məsələn, müxtəlif polimerlər, peptidlər və lipidlər ultrasəs zamanı plazmid DNT-ni qoruyur.

Plazmid DNT və plazmid DNT/IL nanokomplekslərinin ultrasəs kəsmə stresinə qarşı dayanıqlığı agarose gel elektroforez analizindən istifadə edilməklə tədqiq edilmişdir. Həm plazmid DNT, həm də plazmid DNT/IL nanokompleksləri müxtəlif vaxt nöqtələri üçün ultrasəs kəsmə stressinə məruz qalmışdır. Plazmid DNT 0, 10, 20, 30 və 40 dəqiqə ultrasəs kəsmə stressinə məruz qaldı. Bununla belə, plazmid DNT/IL nanokompleksləri 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 və 120 dəqiqə ərzində ultrasəs kəsmə stressinə məruz qalmışdır.
(tədqiqat və şəkil: ©Sarker et al., 2019)

Sarker və başqaları. (2019) plazmid DNT / ion maye (pDNA / IL) nanostrukturlarının 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 və 120 dəqiqə ərzində ultrasəs kəsmə stressinə məruz qaldıqda və kommersiyada mövcud olan katyonik gen ilə kompleksləşdiyini nümayiş etdirdi. çatdırılma agenti lipofektaminlə, flüoresan müsbət hüceyrələrin faizi müvafiq olaraq 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% və 50% təşkil etmişdir (aşağıdakı cədvələ baxın). Nanostrukturlar 10 və 20 dəqiqə ərzində ultrasəs kəsmə stressinə məruz qaldıqda flüoresan müsbət hüceyrələrin faizi artdı və sonra yavaş-yavaş azaldı.

İon mayesinin [Bmim][PF6] plazmid DNT-nin COS7 hüceyrələrinə çatdırılmasına təsiri. Plazmid DNT/IL (ion maye) nanokompleksləri 120 dəqiqəyə qədər ultrasəs kəsmə stressinə məruz qaldı və COS7 hüceyrələrinə çatdırılmadan əvvəl LA ilə kompleksləşdirildi. Məlumatlar 10 müxtəlif mikroskopik sahədə hesablanmış GFP müsbət HeLa hüceyrələrinin orta sayını (%) göstərir və təcrübə üç fərqli gündə bir neçə dəfə həyata keçirilib. (Tədqiqat və qrafik: ©Sarker et al., 2019)

Ultrasonik Lizat Hazırlanması

Ultrasəs Hüceyrə Lizisi Protokolu
Hüceyrə ayırma üsulu ilə hazırlanmış hüceyrələrin zənginləşdirilmiş nümunəsi ilə başlayın (məsələn, immunomaqnit hüceyrə ayrılması, flüoresanla aktivləşdirilmiş hüceyrə çeşidlənməsi (FACS), sıxlıq qradiyenti sentrifuqalanması, immunodenslik hüceyrə izolyasiyası).
Hüceyrə nümunələri eksperimental məqsəd və zond tipli ultrasəs cihazı üçün uyğun olan lizis tamponunun həcmini göstərməlidir.
Hipotonik tamponlara üstünlük verilir, çünki onlar ultrasəs hüceyrə lizisini artırırlar. Əlavələrin və duz konsentrasiyasının uyğun şəkildə istifadə edilməsi vacibdir.
Ultrasəs lizis cihazınızı seçin: flakonların dolayı sonikasiyası üçün VialTweeter və ya CupHorn tövsiyə olunur. Çoxqulu plitələr üçün UIP400MTP ideal ultrasəs cihazıdır. Klassik prob tipli sonikasiya, mikro ucu olan UP100H və ya UP200Ht kimi ultrasəs homogenizatoru ən uyğundur.
Prob tipli sonikasiya üçün protokol: Ultrasonikator zondunu mikrosentrifuqa borusunda nümunə həcminə qoyun və təqribən sonikasiya edin. 10 saniyə. DNT nümunəsindən asılı olaraq, sonikasiya bir və ya iki dəfə təkrarlana bilər. Tələb olunan ultrasəs enerji girişi (Ws/mL) nümunənin özlülüyündən və DNT növündən asılıdır. Buz vannası və ultrasəs cihazının pulsasiya rejimi vasitəsilə soyutma nümunənin termal olaraq parçalanmasının qarşısını almağa kömək edir.
Ultrasəs lizisindən sonra nümunə qranul qalıqlarını (tərkibində parçalanmamış hüceyrələr, nüvələr və parçalanmamış orqanoidlər olan) ayırmaq üçün sentrifuqalanır.
Nümunə dərhal emal olunmazsa, canlılığını qorumaq üçün müvafiq temperaturda saxlanıla bilər.

DNT fraqmentasiyası üçün ultrasəs cihazları

Hielscher Ultrasonics, DNT, RNT və xromatin parçalanması üçün müxtəlif ultrasəs əsaslı platformalar təqdim edir. Bu fərqli platformalara ultrasəs zondları (sonotrodlar), çoxlu borular və ya çox quyulu lövhələr (məsələn, 96 quyulu lövhələr, mikrotiter lövhələr), sonoreaktorlar və ultrasəs qabları eyni vaxtda nümunə hazırlamaq üçün dolayı sonikasiya həlləri daxildir. DNT kəsmə üçün bütün platformalar, dəqiq idarə oluna bilən və təkrarlanan nəticələr verən, tezliyi tənzimlənmiş, yüksək performanslı ultrasəs prosessorları ilə təchiz edilmişdir.

İstənilən Nümunə Sayı və Ölçü üçün Ultrasonik Prosessorlar

Hielscher-in çox nümunəli ultrasəs aparatları VialTweeter (10-a qədər sınaq borusu üçün) və UIP400MTP (mikroplitələr/çoxqulu boşqablar üçün) ilə istənilən DNT fraqment ölçüsü paylanması və məhsuldarlığı əldə edərkən intensiv və dəqiq idarə olunan ultrasəsləmə sayəsində nümunənin emal vaxtını azaltmaq asan olur. . Ultrasonik DNT fraqmentasiyası plazmid hazırlama addımlarını səmərəli, etibarlı və miqyaslana bilən edir. Protokollar daimi ultrasəs parametrlərini tətbiq etməklə birdən çoxsaylı nümunələrə xətti olaraq miqyaslana bilər.
Birdən beş barmağı olan zond ultrasəs cihazları daha kiçik nümunə nömrələrinin hazırlanması üçün idealdır. Hielscher'in laboratoriya ultrasəs aparatları müxtəlif güc səviyyələrində mövcuddur ki, siz DNT ilə əlaqəli tətbiqiniz üçün ideal ultrasəs pozucunu seçə biləsiniz.