Ultrasəs emalı ilə plazmid hazırlanması

Ultrasəs emalı plazmid DNT-sini fraqmentlərə ayırmaq üçün etibarlı üsuldur. Dəqiq idarə olunan amplituda, impuls rejimi və temperaturun idarə olunması plazmidlərin zədələnmədən fraqmentləşdirilməsi üçün ultrasəs cihazının ən vacib xüsusiyyətləridir. Bundan əlavə, müəyyən maddələrin istifadəsi plazmidlərin deqradasiyadan qorunmasına kömək edir. Hielscher Ultrasonics ayrı-ayrı flakonlarda, çoxsaylı nümunələrin eyni vaxtda ultrasəs emalı zamanı, eləcə də çoxyuvalı lövhələrdə plazmidlərin idarə olunan fraqmentləşdirilməsi üçün müxtəlif həllər təklif edir. Plazmidlərin ultrasəslə uğurlu fraqmentləşdirilməsi haqqında daha çox məlumat əldə edin!

Ultrasəs emalı ilə plazmidlərin kəsici qüvvələrlə parçalanması

DNT nümunələri ultrasəs dalğalarına məruz qaldıqda, ultrasəsin yaratdığı titrəyişlər mayedə akustik kavitasiya əmələ gətirir; bu isə mexaniki qüvvələr vasitəsilə yüksək molekulyar kütləli DNT molekullarını kəsir və ya parçalayır. Ultrasəs emalı yüksək ayırdetmə qabiliyyəti əldə etmək üçün kiçik fraqment ölçülərinin tamamilə həlledici olduğu xromatin immunopresipitasiyası (ChIP) kimi tətbiqlər də daxil olmaqla, DNT-nin kütləvi şəkildə kəsici qüvvələrlə parçalanması təcrübələrində ən geniş istifadə olunan üsuldur. (bax: Tseng et al., 2012)
Plazmid DNT-si (pDNA) halqavari forması ilə səciyyələnən və bakteriyalarda, eləcə də bəzi eukariotlarda rast gəlinən xüsusi DNT formasıdır.
Superburulmuş pDNA plazmid DNT-sinin arzu olunan formasıdır, çünki avtomatlaşdırılmış sekvensləmə və transfeksiya kimi sonrakı proseslərdə ən yaxşı nəticələr verir. Ultrasəs emalı superburulmuş pDNA da daxil olmaqla, pDNA-nın uğurla fraqmentləşdirilməsi üçün uyğundur.
Thompson et al. (2008) göstərmişlər ki, superburulmuş DNT-ni fraqmentləşdirdiyi məlum olan plazmid ultrasəs emalı sekvenslərin phred20 oxunuş uzunluqlarını Beckman Coulter-in nəzarət matrisindən və ya fermentativ üsulla xəttiləşdirilmiş plazmidlərdən əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənməyəcək səviyyəyə qədər yaxşılaşdırmağın effektiv yoludur.

Plazmid vektorlarının istifadəsi

Plazmidlər genlərin klonlaşdırılması, köçürülməsi və dəyişdirilməsi üçün vasitə kimi tez-tez istifadə olunur. Plazmidlər təcrübələrdə bu məqsədlərlə istifadə edildikdə vektor adlandırılır. DNT fraqmentləri və ya genlər plazmid vektoruna daxil edilərək rekombinant plazmid adlanan struktur yaradıla bilər. Plazmid vektorları rekombinant DNT-ni sahib hüceyrəyə daxil etmək üçün daşıyıcı kimi istifadə olunur və molekulyar klonlaşdırmanın əsas komponentidir.
“Qeyri-virus vektorlarının müxtəlif mürəkkəb xəstəliklərin müalicəsi üçün gen terapiyasında potensial istifadəsi geniş şəkildə öyrənilir. Qeyri-virus vektorları plazmid DNT-sini fiziki, kimyəvi və fermentativ deqradasiyadan qoruyur və DNT molekulunu hədəf sahəyə çatdırır. Məsələn, kationik liposomlar, xitozan və digər müsbət yüklü nanohissəciklər elektrostatik qarşılıqlı təsirlər vasitəsilə plazmid DNT-si ilə komplekslər əmələ gətirir. Lakin asanlıqla əmələ gələn kationik liposomlar/plazmid DNT-si kompleksləri nisbətən böyükdür (yəni 300–400 nm) və heterogen xarakter daşıyır; bu da onların əczaçılıq tətbiqlərində istifadəsini çətinləşdirir. Böyük və heterogen plazmid DNT-si/liposomlar, plazmid DNT-si/aerozollar və plazmid DNT-si/peptidlər kompleksləri ultrasəs emalı ilə daha kiçik və homogen hissəciklərə çevrilə bilər.” (Sarker et al., 2019)
Plazmid vektorlarının istifadəsinə mühüm nümunə CRISPR–Cas9-dur. CRISPR–Cas9 sistemi adətən hüceyrələrə hədəf ardıcıllığını, CRISPR bələdçisini və Cas9-u kodlaşdıran bir böyük plazmid və ya bir neçə kiçik plazmid şəklində çatdırılır.

DNT yüklü PLGA nanohissəciklərinin nanopresipitasiya yolu ilə ultrasəslə hazırlanması

Jo et al. (2020) model CRISPR–Cas9 plazmidinin sümük iliyindən əldə edilmiş birincili makrofaqlara çatdırılması üçün nanohissəcik daşıyıcısı yaratmaq məqsədilə poli(laktik-ko-qlikolik turşu) (PLGA)-dan istifadə etmişlər. PLGA nanohissəciklərinin nanopresipitasiyası üçün iki müxtəlif son qrupa (ester və amin qrupları) malik PLGA istifadə edilmişdir; məqsəd müsbət yüklü amin son qruplarının DNT-nin mənfi yüklü əsas zənciri ilə yük qarşılıqlı təsirləri hesabına kapsullaşdırma effektivliyini və yüklənməni artırması olmuşdur. 50 mL-lik polipropilen konusvari sentrifuqa sınaq şüşəsində 100 mg Pluronic F127 vorteks qarışdırma ilə 20 mL avtoklavlanmış deionlaşdırılmış suda həll edilmiş, ardınca ultrasəs vannasında 30 min zəif intensivlikli ultrasəs emalı aparılmışdır (bax: CupHorn). Avtoklavlanmış maqnit qarışdırıcı çubuq əlavə edilmiş və digər məhlullar hazırlanarkən məhlul 600 RPM sürətlə 30 min qarışdırılmışdır. DNT-nin qeyri-spesifik adsorbsiyasını minimuma endirmək üçün bütün mərhələlərdə şüşə laboratoriya qabları əvəzinə plastik laboratoriya qablarından istifadə edilmişdir. DMF-də həll edilmiş PLGA (44,48 mg/ ml) və THF-də həll edilmiş TIPS pentasen (0,667 mg/ml) məhlulları ayrıca hazırlanmışdır. PLGA 30 min ultrasəs emalından əvvəl DMF-də islanması üçün 30 min hərəkətsiz saxlanılmışdır. (tam protokol üçün bax: Jo et al., 2020)

Ultrasəs emalı zamanı plazmid DNT-sinin qorunması

Plazmidlər və superburulmuş plazmidlər də daxil olmaqla DNT deqradasiyaya çox həssasdır. Mövcud fraqmentləşdirmə üsullarının hamısı müəyyən çatışmazlıqları ilə tanınır. DNT-nin ultrasəslə fraqmentləşdirilməsi üstünlük verilən üsullardan biridir, çünki idarə olunan ultrasəs emalının qoruyucu tədbirlərlə birləşdirilməsi DNT zəncirlərinin kəsici qüvvələr və istilik nəticəsində zədələnməsini azaltmağa imkan verir.
DNT-nin ultrasəslə kəsici qüvvələr vasitəsilə parçalanması zamanı aşağı amplituda parametrləri, impuls rejimi və temperaturun idarə olunması ilə yanaşı, müəyyən maddələrin istifadəsi DNT deqradasiyasına qarşı əhəmiyyətli qoruyucu təsir göstərmişdir. Məsələn, müxtəlif polimerlər, peptidlər və lipidlər ultrasəs emalı zamanı plazmid DNT-sini qoruyur.

Plazmid DNT-sinin və plazmid DNT-si/IL nanokomplekslərinin ultrasəsin yaratdığı kəsici gərginliyə qarşı dayanıqlığı aqaroza gel elektroforezi analizi ilə tədqiq edilmişdir. Həm plazmid DNT-si, həm də plazmid DNT-si/IL nanokompleksləri müxtəlif müddətlər ərzində ultrasəsin yaratdığı kəsici gərginliyə məruz qoyulmuşdur. Plazmid DNT-si 0, 10, 20, 30 və 40 dəqiqə ərzində ultrasəsin yaratdığı kəsici gərginliyə məruz qoyulmuşdur. Plazmid DNT-si/IL nanokompleksləri isə 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 və 120 dəqiqə ərzində ultrasəsin yaratdığı kəsici gərginliyə məruz qoyulmuşdur.
(tədqiqat və şəkil: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) göstərmişlər ki, plazmid DNT-si / ion mayesi (pDNA/IL) nanostrukturları 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 və 120 min ərzində ultrasəsin yaratdığı kəsici gərginliyə məruz qoyulduqda və kommersiya baxımından mövcud olan kationik gen çatdırılma maddəsi lipofektaminlə kompleksləşdirildikdə, flüoressensiya baxımından müsbət hüceyrələrin faizləri müvafiq olaraq 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% və 50% olmuşdur (aşağıdakı diaqrama baxın). Nanostrukturlar 10 və 20 min ərzində ultrasəsin yaratdığı kəsici gərginliyə məruz qoyulduqda flüoressensiya baxımından müsbət hüceyrələrin faizi artmış, bundan sonra isə tədricən azalmışdır.

İon mayesinin [Bmim][PF6] plazmid DNT-sinin COS7 hüceyrələrinə çatdırılmasına təsiri. Plazmid DNT-si/IL (ion mayesi) nanokompleksləri 120 dəqiqəyədək ultrasəsin yaratdığı kəsici gərginliyə məruz qoyulmuş və COS7 hüceyrələrinə çatdırılmadan əvvəl LA ilə kompleksləşdirilmişdir. Məlumatlar 10 müxtəlif mikroskopik baxış sahəsində sayılmış GFP-müsbət HeLa hüceyrələrinin orta sayını (%) göstərir və təcrübə üç müxtəlif gündə bir neçə dəfə aparılmışdır. (Tədqiqat və diaqram: ©Sarker et al., 2019)

Lizatın ultrasəslə hazırlanması

Ultrasəslə hüceyrə lizisi protokolu
Hüceyrələrin ayrılması üsulu ilə (məsələn, immunomaqnit hüceyrə ayrılması, flüoressensiya ilə aktivləşdirilən hüceyrə çeşidlənməsi (FACS), sıxlıq qradiyenti üzrə sentrifuqalama, immunosıxlıq üsulu ilə hüceyrələrin təcrid edilməsi) hazırlanmış zənginləşdirilmiş hüceyrə nümunəsi ilə başlayın.
Hüceyrə nümunələrində təcrübənin məqsədinə və zond tipli ultrasəs cihazına uyğun həcmdə lizis buferi olmalıdır.
Hipotonik buferlərə üstünlük verilir, çünki onlar ultrasəslə hüceyrə lizisini gücləndirir. Əlavələrin və duz konsentrasiyasının uyğun şəkildə tətbiq olunması vacibdir.
Ultrasəslə lizis cihazınızı seçin: flakonların dolayı ultrasəs emalı üçün VialTweeter və ya CupHorn tövsiyə olunur. Çoxyuvalı lövhələr üçün UIP400MTP ideal ultrasəs cihazıdır. Klassik zond tipli ultrasəs emalı üçün isə mikro ucluğu olan UP100H və ya UP200Ht kimi ultrasəs homogenizatoru ən uyğundur.
Zond tipli ultrasəs emalı üçün protokol: Ultrasəs cihazının zondunu mikrosentrifuqa sınaq şüşəsindəki nümunənin içinə yerləşdirin və təqribən 10 saniyə ultrasəslə emal edin. DNT nümunəsindən asılı olaraq ultrasəs emalı daha bir və ya iki dəfə təkrarlana bilər. Tələb olunan ultrasəs enerjisi girişi (Ws/mL) nümunənin özlülüyündən və DNT növündən asılıdır. Buz vannası ilə soyutma və ultrasəs cihazının impuls rejimi nümunənin istilik təsirindən deqradasiyasının qarşısını almağa kömək edir.
Ultrasəslə lizisdən sonra nümunə çöküntü qalıqlarını (lizisə uğramamış hüceyrələr, nüvələr və lizisə uğramamış orqanoidlər daxil olmaqla) ayırmaq üçün sentrifuqalanır.
Nümunə dərhal sonrakı emala məruz qoyulmazsa, onun həyat qabiliyyətini qorumaq üçün uyğun temperaturda saxlanıla bilər, saxlanıla bilər.

DNT-nin fraqmentləşdirilməsi üçün ultrasəs cihazları

Hielscher Ultrasonics DNT, RNT və xromatinin fraqmentləşdirilməsi üçün ultrasəsə əsaslanan müxtəlif platformalar təklif edir. Bu müxtəlif platformalara ultrasəs zondları (sonotrodlar), çoxsaylı sınaq şüşələrində və ya çoxyuvalı lövhələrdə (məsələn, 96 yuvalı lövhələr, mikrotitr lövhələri) nümunələrin eyni vaxtda hazırlanması üçün dolayı ultrasəs emalı həlləri, sonoreaktorlar və ultrasəs cuphornları daxildir. DNT-nin kəsici qüvvələrlə parçalanması üçün bütün platformalar dəqiq idarə olunan və təkrarlana bilən nəticələr verən, tezliyi tənzimlənmiş yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs prosessorları ilə işləyir.

İstənilən sayda və ölçüdə nümunə üçün ultrasəs prosessorları

Hielscher çoxnümunəli ultrasəs cihazları VialTweeter (10 sınaq şüşəsinədək) və UIP400MTP (mikrolövhələr/ çoxyuvalı lövhələr üçün) ilə intensiv və dəqiq idarə olunan ultrasəs emalı sayəsində nümunələrin emal müddətini azaltmaq, eyni zamanda DNT fraqmentlərinin arzu olunan ölçü paylanmasını və çıxımını əldə etmək asanlıqla mümkün olur. DNT-nin ultrasəslə fraqmentləşdirilməsi plazmid hazırlama mərhələlərini effektiv, etibarlı və miqyaslandırıla bilən edir. Sabit ultrasəs parametrlərini tətbiq etməklə protokollar bir nümunədən çoxsaylı nümunələrə xətti şəkildə miqyaslandırıla bilər.
Bir–beş barmaqlı zond ultrasəs cihazları az sayda nümunənin hazırlanması üçün idealdır. Hielscher laboratoriya ultrasəs cihazları müxtəlif güc səviyyələrində mövcuddur ki, DNT ilə bağlı tətbiqiniz üçün ideal ultrasəs parçalayıcısını seçə biləsiniz.