Ultrasonication istifadə plazmid hazırlanması

Ultrasonikasiya plazmid DNT-ni parçalamaq üçün etibarlı bir texnikadır. Dəqiq idarə oluna bilən amplituda, pulsasiya rejimi və temperaturun idarə edilməsi ultrasəs cihazının zərərsiz plazmid parçalanması üçün ən vacib xüsusiyyətləridir. Bundan əlavə, müəyyən agentlərin istifadəsi plazmidin deqradasiyasına qarşı qorunmağa kömək edir. Hielscher Ultrasonics, tək flakonlardan idarə olunan plazmid parçalanması üçün müxtəlif həllər təklif edir, eyni zamanda çoxsaylı nümunələrin sonication, eləcə də çox quyulu lövhələr. Uğurlu ultrasəs plazmid parçalanması haqqında daha çox məlumat əldə edin!

İnformasiya tələbi




Bizimlə əlaqə saxlayın Gizlilik Siyasəti.


Ultrasonik DNT fraqmentasiyası, Next Generation Sequencing (NGS) prosesində geniş istifadə olunan etibarlı və səmərəli texnikadır.

UIP400MTP çox quyulu plitələrin dəqiq idarə olunan ultrasəslənməsinə imkan verir. UIP400MTP-nin tətbiqlərindən biri xüsusi olaraq hədəflənmiş uzunluqdakı fraqmentləri əldə etmək üçün plazmid DNT-nin parçalanmasıdır.

Ultrasonication istifadə plazmid kəsmə

DNT nümunələri ultrasəs dalğalarına məruz qaldıqda, ultrasəslə yaradılan vibrasiyalar mexaniki qüvvələr vasitəsilə yüksək molekulyar çəkili DNT molekullarını kəsən və ya parçalayan mayedə akustik kavitasiya yaradır. Sonication, kiçik fraqment ölçülərinin yüksək qətnamə əldə etmək üçün tamamilə vacib olduğu Xromatin İmmunoprecipitation (ChIP) kimi tətbiqlər də daxil olmaqla, toplu DNT kəsmə təcrübələri üçün ən çox istifadə edilən üsuldur. (müq. Tseng və başqaları, 2012)
Plazmid DNT (pDNA) DNT-nin spesifik formasıdır, halqa forması ilə xarakterizə olunur və bakteriyalarda və bəzi eukariotlarda olur.
Supercoiled pDNA plazmid DNT-nin arzu olunan formasıdır, çünki o, avtomatlaşdırılmış ardıcıllıq və transfeksiya kimi aşağı axın proseslərində ən yaxşı nəticələri göstərir. Ultrasonikasiya pDNA-nı, o cümlədən supercoiled pDNA-nı uğurla parçalamaq üçün uyğundur.
Tompson və başqaları. (2008) nümayiş etdirdi ki, supercoiled DNT-ni parçalamaqla tanınan plazmid sonikasiyası, phred20 ardıcıllığının oxu uzunluqlarını Beckman Coulterin nəzarət şablonundan və ya enzimatik olaraq xəttiləşdirilmiş plazmidlərdən əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənmədiyi nöqtəyə qədər yaxşılaşdırmaq üçün təsirli bir yoldur.

Ultrasonik DNA parçalanmasının üstünlükləri

  • Həqiqətən nəzarət edilə bilər
  • Təkrarlana bilən nəticələr
  • Hədəf DNT fraqmentinin uzunluqlarına uyğun olaraq tənzimlənir
  • temperatur nəzarət
  • İstənilən nümunə ölçüsünə miqyaslana bilər
Videoda UIP400MTP ultrasəs nümunəsi hazırlama sistemi göstərilir ki, bu da yüksək intensivlikli ultrasəsdən istifadə etməklə istənilən standart çoxquyulu lövhələrdən etibarlı nümunə hazırlamağa imkan verir. UIP400MTP-nin tipik tətbiqlərinə hüceyrə lizisi, DNT, RNT və xromatinin kəsilməsi, həmçinin zülal çıxarılması daxildir.

Çox yaxşı boşqablı sonikasiya üçün UIP400MTP Ultrasonicator

Plazmid vektorlarının istifadəsi

Plazmidlər tez-tez genləri klonlaşdırmaq, köçürmək və manipulyasiya etmək üçün alətlər kimi istifadə olunur. Plazmidlərdən bu məqsədlər üçün eksperimental olaraq istifadə edildikdə, onlara vektorlar deyilir. DNT fraqmentləri və ya genləri plazmid vektoruna daxil edilə bilər və sözdə rekombinant plazmid yaradır. Plazmid vektorları rekombinant DNT-ni ana hüceyrəyə sürmək üçün vasitə kimi istifadə olunur və molekulyar klonlaşdırmanın əsas komponentidir.
“Qeyri-viral vektorlar müxtəlif mürəkkəb xəstəliklərin müalicəsi üçün gen terapiyasında potensial istifadəsi üçün geniş şəkildə öyrənilir. Qeyri-viral vektorlar plazmid DNT-ni fiziki, kimyəvi və enzimatik deqradasiyadan qoruyur və DNT molekulunu hədəf sahəyə çatdırır. Məsələn, kationik liposomlar, xitozan və digər müsbət yüklü nanohissəciklər elektrostatik qarşılıqlı təsir vasitəsilə plazmid DNT ilə komplekslər əmələ gətirirlər. Bununla belə, asanlıqla əmələ gələn katyonik liposomlar/plazmid DNT kompleksləri nisbətən böyükdür (yəni, 300-400 nm) və təbiətcə heterojendir və bu, onların əczaçılıq tətbiqlərində istifadəsini çətinləşdirir. Böyük və heterojen plazmid DNT/liposomlar, plazmid DNT/aerozollar və plazmid DNT/peptid kompleksləri ultrasəsdən istifadə edərək daha kiçik və homojen hissəciklərə endirilə bilər.” (Sarker və başqaları, 2019)
Plazmid vektorlarının istifadəsi üçün görkəmli nümunə CRISPR–Cas9-dur. CRISPR–Cas9 sistemi adətən hüceyrələrə hədəf ardıcıllığını, CRISPR bələdçisini və Cas9-u kodlayan tək böyük plazmid və ya çoxlu kiçik plazmid kimi çatdırılır.

Nanopresipitasiya ilə DNT yüklü PLGA nanohissəciklərinin ultrasəs hazırlanması

Jo və başqaları. (2020) model CRISPR-Cas9 plazmidinin ilkin sümük iliyindən əldə edilən makrofaqlara çatdırılması üçün nanohissəcik daşıyıcısı yaratmaq üçün poli(laktik-ko-qlikolik turşu) (PLGA) istifadə etmişdir. PLGA nanohissəciklərinin nanoçökməsi üçün iki fərqli son qrupu (ester və amin qrupları) olan PLGA istifadə edilmişdir ki, müsbət yüklü amin uc qapaqları onun və mənfi yüklü onurğa sütunu arasındakı yük qarşılıqlı təsirinə görə kapsulyasiyanın səmərəliliyini və yüklənməsini artırır. DNT. 50 mL polipropilen konusvari santrifüj borusunda 100 mq Pluronic F127 20 ml avtoklavlanmış DI suda burulğanla qarışdırıldıqdan sonra ultrasəs vannası istifadə edərək 30 dəqiqə yumşaq sonikasiya ilə həll edildi.bax CupHorn). Avtoklavlanmış maqnit qarışdırma çubuğu əlavə edildi və məhlul 600 rpm-də 30 dəqiqə ərzində qarışdırıldı, digər məhlullar hazırlanır. DNT-nin qeyri-spesifik adsorbsiyasını minimuma endirmək üçün şüşə qablar əvəzinə plastik laboratoriya qabları istifadə edilmişdir. DMF-də həll edilmiş PLGA (44,48 mq/ml) və THF-də (0,667 mq/ml) həll edilmiş TIPS pentasen məhlulları ayrıca hazırlanmışdır. PLGA 30 dəqiqə sonikasiya edilməzdən əvvəl 30 dəqiqə ərzində DMF-də nəmlənmək üçün sakit şəkildə buraxıldı. (tam protokol üçün bax Jo et al., 2020)

Əlaqədar tətbiqlər:

  • DNT-nin çıxarılması
  • DNT-nin inkapsulyasiyası
  • Nanohissəciklərlə örtülmüş DNT-nin dispersiyası
  • Plazmid DNT-nin hüceyrələrə çatdırılması
Nümunələrin dolayı sonikasiyası üçün UP200St TD_CupHorn

Nümunələrin dolayı sonikasiyası üçün UP200St CupHorn, məsələn, DNT çıxarılması və parçalanması üçün.

İnformasiya tələbi




Bizimlə əlaqə saxlayın Gizlilik Siyasəti.


Sonikasiya zamanı plazmid DNT-nin qorunması

Plazmidlər və super qıvrılmış plazmidlər də daxil olmaqla DNT yüksək həssas deqradasiyadır. Mövcud olan bütün parçalanma üsulları müəyyən mənfi cəhətləri ilə tanınır. Ultrasəs DNT-nin parçalanması üstünlük verilən üsullardan biridir, çünki qoruyucu tədbirlərlə birlikdə idarə olunan sonikasiya DNT zəncirlərinin kəsilmə və istilik nəticəsində zədələnməsini azaltmağa imkan verir.
Ultrasəs DNT-nin kəsilməsi zamanı aşağı amplituda parametrləri, pulsasiya rejimi və temperatur nəzarəti ilə yanaşı, müəyyən agentlərin istifadəsi DNT deqradasiyasına qarşı əhəmiyyətli qoruyucu təsir göstərmişdir. Məsələn, müxtəlif polimerlər, peptidlər və lipidlər ultrasəs zamanı plazmid DNT-ni qoruyur.

İon mayeləri plazmid DNT-ni sonikasiya zamanı zərərlərdən qoruya bilər.

Plazmid DNT və plazmid DNT/IL nanokomplekslərinin ultrasəs kəsmə stresinə qarşı dayanıqlığı agarose gel elektroforez analizindən istifadə edilməklə tədqiq edilmişdir. Həm plazmid DNT, həm də plazmid DNT/IL nanokompleksləri müxtəlif vaxt nöqtələri üçün ultrasəs kəsmə stressinə məruz qalmışdır. Plazmid DNT 0, 10, 20, 30 və 40 dəqiqə ultrasəs kəsmə stressinə məruz qaldı. Bununla belə, plazmid DNT/IL nanokompleksləri 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 və 120 dəqiqə ərzində ultrasəs kəsmə stressinə məruz qalmışdır.
(tədqiqat və şəkil: ©Sarker et al., 2019)

Sarker və başqaları. (2019) plazmid DNT / ion maye (pDNA / IL) nanostrukturlarının 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 və 120 dəqiqə ərzində ultrasəs kəsmə stressinə məruz qaldıqda və kommersiyada mövcud olan katyonik gen ilə kompleksləşdiyini nümayiş etdirdi. çatdırılma agenti lipofektaminlə, flüoresan müsbət hüceyrələrin faizi müvafiq olaraq 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% və 50% təşkil etmişdir (aşağıdakı cədvələ baxın). Nanostrukturlar 10 və 20 dəqiqə ərzində ultrasəs kəsmə stressinə məruz qaldıqda flüoresan müsbət hüceyrələrin faizi artdı və sonra yavaş-yavaş azaldı.

Plazmid DNT-nin ultrasəs parçalanması

İon mayesinin [Bmim][PF6] plazmid DNT-nin COS7 hüceyrələrinə çatdırılmasına təsiri. Plazmid DNT/IL (ion maye) nanokompleksləri 120 dəqiqəyə qədər ultrasəs kəsmə stressinə məruz qaldı və COS7 hüceyrələrinə çatdırılmadan əvvəl LA ilə kompleksləşdirildi. Məlumatlar 10 müxtəlif mikroskopik sahədə hesablanmış GFP müsbət HeLa hüceyrələrinin orta sayını (%) göstərir və təcrübə üç fərqli gündə bir neçə dəfə həyata keçirilib. (Tədqiqat və qrafik: ©Sarker et al., 2019)

Plazmid DNT-ni ultrasəs parçalanmadan əvvəl bir agent əlavə etməklə qorumaq olar.

Plazmid DNT ultrasəs parçalanmadan əvvəl bir agent əlavə edilməklə qoruna bilər: çılpaq pDNT (A) və 1,5 mM CaCl2 və 20 % (h/v) t-butanol (B) ilə formalaşmış pDNT-nin sonikasiya nəticəsində deqradasiyası.
Nümunələr, hər bir zolağın yuxarı hissəsində göstərildiyi kimi, 120 saniyəyə qədər 20 Vt zond ilə sonikasiya edilmişdir. H zolağı Hyperladder I ™️ markerinə uyğundur. OC və SC plazmid zolaqları göstərilmişdir.
(tədqiqat və şəkillər: ©Wu et al., 2009)

Ultrasonik Lizat Hazırlanması

Ultrasəs Hüceyrə Lizisi Protokolu
Bioloji nümunələrin ultrasəs lizisi üçün mikrotipli S26d2 ilə Ultrasonicator UP200HtHüceyrə ayırma üsulu ilə hazırlanmış hüceyrələrin zənginləşdirilmiş nümunəsi ilə başlayın (məsələn, immunomaqnit hüceyrə ayrılması, flüoresanla aktivləşdirilmiş hüceyrə çeşidlənməsi (FACS), sıxlıq qradiyenti sentrifuqalanması, immunodenslik hüceyrə izolyasiyası).
Hüceyrə nümunələri eksperimental məqsəd və zond tipli ultrasəs cihazı üçün uyğun olan lizis tamponunun həcmini göstərməlidir.
Hipotonik tamponlara üstünlük verilir, çünki onlar ultrasəs hüceyrə lizisini artırırlar. Əlavələrin və duz konsentrasiyasının uyğun şəkildə istifadə edilməsi vacibdir.
Ultrasəs lizis cihazınızı seçin: flakonların dolayı sonikasiyası üçün VialTweeter və ya CupHorn tövsiyə olunur. Çoxqulu plitələr üçün UIP400MTP ideal ultrasəs cihazıdır. Klassik prob tipli sonikasiya, mikro ucu olan UP100H və ya UP200Ht kimi ultrasəs homogenizatoru ən uyğundur.
Prob tipli sonikasiya üçün protokol: Ultrasonikator zondunu mikrosentrifuqa borusunda nümunə həcminə qoyun və təqribən sonikasiya edin. 10 saniyə. DNT nümunəsindən asılı olaraq, sonikasiya bir və ya iki dəfə təkrarlana bilər. Tələb olunan ultrasəs enerji girişi (Ws/mL) nümunənin özlülüyündən və DNT növündən asılıdır. Buz vannası və ultrasəs cihazının pulsasiya rejimi vasitəsilə soyutma nümunənin termal olaraq parçalanmasının qarşısını almağa kömək edir.
Ultrasəs lizisindən sonra nümunə qranul qalıqlarını (tərkibində parçalanmamış hüceyrələr, nüvələr və parçalanmamış orqanoidlər olan) ayırmaq üçün sentrifuqalanır.
Nümunə dərhal emal olunmazsa, canlılığını qorumaq üçün müvafiq temperaturda saxlanıla bilər.

DNT fraqmentasiyası üçün ultrasəs cihazları

Hielscher Ultrasonics, DNT, RNT və xromatin parçalanması üçün müxtəlif ultrasəs əsaslı platformalar təqdim edir. Bu fərqli platformalara ultrasəs zondları (sonotrodlar), çoxlu borular və ya çox quyulu lövhələr (məsələn, 96 quyulu lövhələr, mikrotiter lövhələr), sonoreaktorlar və ultrasəs qabları eyni vaxtda nümunə hazırlamaq üçün dolayı sonikasiya həlləri daxildir. DNT kəsmə üçün bütün platformalar, dəqiq idarə oluna bilən və təkrarlanan nəticələr verən, tezliyi tənzimlənmiş, yüksək performanslı ultrasəs prosessorları ilə təchiz edilmişdir.

İstənilən Nümunə Sayı və Ölçü üçün Ultrasonik Prosessorlar

Hielscher-in çox nümunəli ultrasəs aparatları VialTweeter (10-a qədər sınaq borusu üçün) və UIP400MTP (mikroplitələr/çoxqulu boşqablar üçün) ilə istənilən DNT fraqment ölçüsü paylanması və məhsuldarlığı əldə edərkən intensiv və dəqiq idarə olunan ultrasəsləmə sayəsində nümunənin emal vaxtını azaltmaq asan olur. . Ultrasonik DNT fraqmentasiyası plazmid hazırlama addımlarını səmərəli, etibarlı və miqyaslana bilən edir. Protokollar daimi ultrasəs parametrlərini tətbiq etməklə birdən çoxsaylı nümunələrə xətti olaraq miqyaslana bilər.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.

The VialTweeter is a MultiSample Ultrasonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

Ultrasəs çox nümunəli hazırlama vahidi VialTweeter eyni vaxtda 10 flakonun sonikasiyasına imkan verir. Kelepçe quraşdırılmış VialPress cihazı ilə sıx sonikasiya üçün ön tərəfə 4-ə qədər əlavə boruya basmaq olar.

dəqiq proses nəzarət

Hielscher ultrasəs cihazları brauzer nəzarəti vasitəsilə uzaqdan idarə oluna bilər. Sonication parametrləri izlənilə və proses tələblərinə dəqiq uyğunlaşdırıla bilər.Tam sonifikasiya DNT, RNT və xromatini məhv edə biləcəyi üçün dəqiq nəzarət edilə bilən sonication parametrləri çox vacibdir, lakin qeyri -kafi ultrasəs kəsmə çox uzun DNT və xromatin parçaları ilə nəticələnir. Hielscher -in rəqəmsal ultrasonicators asanlıqla dəqiq sonication parametr üçün təyin edilə bilər. Xüsusi sonication parametrləri eyni prosedurun sürətli təkrarlanması üçün proqramlaşdırılmış bir ayar olaraq da saxlanıla bilər.
Bütün sonication avtomatik olaraq protokollaşdırılır və daxili bir SD kartda CSV faylı olaraq saxlanılır. Bu, yerinə yetirilən sınaqların dəqiq sənədləşdirilməsinə imkan verir və sonication işlərinin asanlıqla nəzərdən keçirilməsini mümkün edir.
Uzaqdan idarəetmə vasitəsi ilə bütün rəqəmsal ultrasəs cihazları istənilən standart brauzer vasitəsilə idarə oluna və izlənilə bilər. Əlavə proqramın quraşdırılması tələb olunmur, çünki LAN bağlantısı çox sadə bir plug-n-play quruluşudur.

Ultrasonik DNT Hazırlanması zamanı Ən Yüksək İstifadəçi Dostluğu

Bütün Hielscher ultrasonicators yüksək performanslı ultrasəs çatdırmaq üçün nəzərdə tutulmuşdur, eyni zamanda həmişə çox istifadəçi dostu və istifadəsi asandır. Bütün parametrlər rəngli toxunma ekranı və ya brauzerin uzaqdan idarəetmə vasitəsi ilə asanlıqla əldə edilə bilən aydın bir menyuda yaxşı qurulmuşdur. Proqramlaşdırıla bilən parametrlərə və avtomatik məlumat qeydinə malik ağıllı proqram təminatı, etibarlı və təkrarlanan nəticələr üçün optimal sonication parametrlərini təmin edir. Təmiz və istifadəsi asan menyu interfeysi Hielscher ultrasonicatorlarını istifadəçi dostu və səmərəli cihazlara çevirir.
Aşağıdakı cədvəl hüceyrə lizisi və DNT parçalanması üçün laboratoriya ultrasəs aparatlarımızın təxmini emal qabiliyyətinin göstəricisini verir:

Partiyanın həcmi Axın tövsiyə Cihazlar
çox quyulu lövhələr yox UIP400MTP
flakonlar, kiçik şüşə yox Ultrasonik cuphorn
10 flakona qədər yox VialTweeter
1 500ml 10 200ml / dəq UP100H
10 2000ml üçün 20 400ml / dəq Uf200 ः t, UP400St

Bizimlə əlaqə saxlayın! Bizdən soruşun!

Daha ətraflı məlumat üçün müraciət edin

DNT hasilatı və parçalanması üçün ultrasəs homogenizatorları, tətbiq protokolları və qiymətlər haqqında əlavə məlumat tələb etmək üçün aşağıdakı formadan istifadə edin. Prosesinizi sizinlə müzakirə etməkdən və tələblərinizə cavab verən ultrasəs sistemi təklif etməkdən şad olarıq!









Xahiş edirik unutmayın Gizlilik Siyasəti.




Ədəbiyyat / İstinadlar

Bilmək lazımdır

Plazmidlər nədir?
Plazmid xromosom DNT-dən fiziki olaraq ayrı olan və müstəqil şəkildə təkrarlanan kiçik dairəvi DNT molekuludur. Plazmidlər çox vaxt orqanizmin sağ qalmasına töhfə verən və spesifik üstünlüklər verən genlərlə əlaqələndirilir, məsələn, antibiotiklərə qarşı müqavimət. Plazmidlər ən çox bakteriyalarda kiçik dairəvi, ikiqat zəncirli DNT molekulları şəklində tapılır; lakin plazmidlər bəzən arxeya və eukaryotik orqanizmlərdə olur. Plazmidlər molekulyar biologiya, genetika, biokimya və həyat elmində mühüm alətlərdir. Gen mühəndisliyində vektor kimi tanınan plazmidlər müəyyən genləri təkrarlamaq və ya ifadə etmək üçün istifadə olunur. Vektorun məqsədyönlü dəyişdirilməsi vektor dizaynı adlanır.

Hüceyrə Tədqiqatında GFP Analizi
Yaşıl Floresan Zülal (GFP) fizioloji proseslərin monitorinqi, zülalların lokalizasiyasının vizuallaşdırılması və in vivo transgen ifadəsinin aşkarlanması üçün çox yönlü bioloji markerdir. GFP 488 nm lazer xətti ilə həyəcanlana bilər və 510 nm-də optimal şəkildə aşkar edilir.


Yüksək performanslı ultrasəs! Hielscher-in məhsul çeşidi kompakt laboratoriya ultrasəs cihazından tutmuş tam sənaye ultrasəs sistemlərinə qədər tam spektri əhatə edir.

Hielscher Ultrasonics, yüksək performanslı ultrasəs homogenizatorları istehsal edir Laboratoriya qədər sənaye ölçüsü.