Yüksək intensivlikli sonikasiya ilə mikroplaketlərdə maya hüceyrələrinin lizisi

Mikrobioloqlar və həyat elmləri üzrə tədqiqatçılar Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii və digər maya sistemləri ilə işləyərkən bu çətinliyi yaxşı bilirlər: maya hüceyrələri davamlıdır, təkrarlana bilən lizisə nail olmaq çətin ola bilər və çoxsaylı ştamların, klonların, kultivasiya şəraitlərinin və ya ekspressiya konstruksiyalarının skrininqi tələb olunduqda nümunələrin əl ilə parçalanması tezliklə işi ləngidən amilə çevrilir.

Mikrobiologiya, molekulyar biologiya və zülal analitikası üçün çoxsaylı nümunələrin yüksək məhsuldarlıqla maya lizisi

UIP400MTP (400 W) və UIP550MTP (550 W) kimi Hielscher mikroplaket sonikatorları maya hüceyrələrinin birbaşa mikroplaketlərdə mexaniki lizisi üçün çoxsaylı nümunələri yüksək məhsuldarlıqla emal etməyə imkan verən həll təqdim edir. Nümunələri zondla bir-bir emal etmək əvəzinə, bütöv mikroplaketlər eyni şəraitdə sonikasiya edilə bilər. Bu, ultrasəslə maya lizisini daha sürətli, daha təkrarlana bilən və müasir mikrobiologiya, zülal ekspressiyası, ferment skrininqi və omika iş proseslərinə inteqrasiyası daha asan edir.
P. pastoris hüceyrələrindən rekombinant zülalları azad etmək, ferment analizləri üçün maya lizatları hazırlamaq, zülal analizi üçün S. cerevisiae hüceyrələrini parçalamaq və ya onlarla maya klonunun paralel skrininqini aparmaq lazım gəldikdə, Hielscher mikroplaket sonikatorları prosesə dəqiq nəzarətlə kavitasiyaya əsaslanan güclü hüceyrə parçalanmasını təmin edir.

Maya hüceyrələri nə üçün səmərəli mexaniki lizis tələb edir

Maya hüceyrələrini lizis etmək bir çox bakteriya və ya məməli hüceyrəsinə nisbətən daha çətindir, çünki onları əsasən polisaxaridlərdən, qlükanlardan, mannoproteinlərdən və xitindən ibarət sərt hüceyrə divarı qoruyur. Bu hüceyrə divarı mexaniki sabitlik təmin edir, lakin hüceyrədaxili zülalların, nuklein turşularının, metabolitlərin və fermentlərin azad olunmasını da məhdudlaşdırır.
Ənənəvi maya lizisi üsullarına muncuqlarla mexaniki parçalama, fermentativ həzm, dondurma–ərimə dövrləri, kimyəvi lizis və zond tipli sonikasiya daxildir. Bu üsullar effektiv ola bilər, lakin onların məhdudiyyətləri də var. Muncuqlarla mexaniki parçalama qalıq hissəciklərin daxil olmasına və qızmaya səbəb ola bilər, fermentativ həzm xərcləri və dəyişkənliyi artıra bilər, çoxlu sayda nümunə emal edilməli olduqda isə tək nümunənin zondla sonikasiyası çox vaxt aparır.
Yüksək intensivlikli, fokuslanmış ultrasəs kavitasiyası maya suspenziyasına güclü mexaniki kəsilmə qüvvələri, təzyiq dəyişmələri və mikroaxınlar tətbiq etməklə bu məhdudiyyətləri aradan qaldırır. Nəticədə hüceyrə divarları və membranları sürətlə parçalanır, hüceyrədaxili komponentlərin azad olunması yaxşılaşır və plaket formatında yüksək dərəcədə təkrarlana bilən nümunə hazırlanması təmin edilir.

Maya nümunələrinin paralel hazırlanması üçün mikroplaket sonikasiyası

Hielscher UIP400MTP və UIP550MTP mikroplaketlərin, çoxyuvalı plaketlərin, PCR plaketlərinin və uyğun nümunə ştativlərinin bərabər sonikasiyası üçün nəzərdə tutulub. Zondla sonikasiyadan fərqli olaraq, nümunələrin ayrı-ayrılıqda emal edilməsi tələb olunmur. Bütöv plaket nəzarət olunan ultrasəs enerjisinə məruz qalır və bu, iş prosesini nümunələrin paralel emalı üçün olduqca uyğun edir.

Bu, xüsusilə aşağıdakılar üçün faydalıdır:

• Skrininq: S. cerevisiae mutantları və ya ekspressiya ştamları
• Lizis: P. pastoris / K. phaffii klonları rekombinant zülal ekspressiyasından sonra
• Ferment analizləri üçün maya lizatlarının hazırlanması
• SDS-PAGE, Western blot, ELISA, LC-MS/MS və ya aktivlik sınaqları üçün zülal ekstraksiyası
• Metabolomika üçün hüceyrədaxili metabolitlərin azad olunması
• Sonrakı uyğun təmizləmədən sonra DNT və RNT nümunələrinin hazırlanması
• Lizis buferlərinin, əlavələrin və ekstraksiya şəraitlərinin çoxsaylı nümunələr üzrə yüksək məhsuldarlıqla optimallaşdırılması

Ultrasəs kavitasiyası maya hüceyrələrini necə parçalayır

Sonikasiya zamanı fokuslanmış yüksək güclü ultrasəs maye nümunədə növbələşən sıxılma və seyrəkləşmə dövrləri yaradır. Kifayət qədər yüksək intensivlikdə bu təzyiq dəyişmələri akustik kavitasiya yaradır. Kavitasiya qabarcıqları əmələ gəlir, rəqs edir və çökərək yerli kəsilmə qüvvələri, mikroşırnaqlar, turbulentlik və güclü təzyiq qradiyentləri yaradır.
Maya suspenziyalarında bu mexaniki təsirlər hüceyrə divarını və hüceyrə membranını zəiflədir və parçalayır. Hüceyrədaxili zülallar, fermentlər, nuklein turşuları və metabolitlər lizis buferinə buraxılır. Proses mexaniki olduğundan, bir çox müxtəlif bufer sistemi ilə istifadə edilə bilər və proteaza inhibitorları, reduksiyaedici maddələr, detergentlər, duzlar və ya yumşaq fermentativ ilkin emalla birləşdirilə bilər.

Ümumi protokol: mikroplaketlərdə maya hüceyrələrinin lizisi

Aşağıdakı protokol Hielscher UIP400MTP və ya UIP550MTP mikroplaket sonikatorundan istifadə etməklə maya lizisi üçün praktik başlanğıc nöqtəsi təqdim edir. Parametrlər maya ştamına, hüceyrə sıxlığına, hədəf molekula, bufer tərkibinə, plaket növünə və sonrakı analizə uyğun optimallaşdırılmalıdır.

1. Maya hüceyrələrini toplayın və yuyun

Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces və ya başqa bir maya ştamını istədiyiniz kultivasiya şəraitində yetişdirin. Hüceyrələri sentrifuqalama ilə toplayın və qida mühitini uzaqlaşdırın. Sonrakı analizə mane ola biləcək qalıq mühit komponentlərini uzaqlaşdırmaq üçün çöküntünü soyuq distillə edilmiş su, PBS və ya seçilmiş lizis buferi ilə yuyun.
Zülal ekstraksiyası üçün nümunələri soyuq saxlayın və sürətlə işləyin. Proteazalar problem yarada bilərsə, bütün buferləri və sərf materiallarını əvvəlcədən soyudun.

2. Hüceyrə çöküntüsünü yenidən suspenziyalaşdırın

Maya çöküntüsünü uyğun soyuq lizis buferində yenidən suspenziyalaşdırın. Zülalların səmərəli azad olunması üçün yüksək hüceyrə sıxlığı çox vaxt faydalıdır. Başlanğıc olaraq analizdən asılı olaraq təxminən 10–20% w/v yaş hüceyrə çöküntüsündən və ya OD₆₀₀ > 10 göstəricisinə uyğun sıx suspenziyadan istifadə edin.

Tipik maya zülalı lizis buferində aşağıdakılar ola bilər:

• Tris-HCl, fosfat buferi və ya HEPES kimi bufer sistemi
• NaCl və ya KCl kimi duz
• proteaza inhibitorları qarışığı
• istəyə bağlı olaraq DTT və ya β-merkaptoetanol kimi reduksiyaedici maddə
• sonrakı proseslərlə uyğunluqdan asılı olaraq istəyə bağlı Triton X-100, NP-40, SDS və ya CHAPS kimi detergent
• fosforlaşma tədqiqatları üçün istəyə bağlı fosfataza inhibitorları

Çətin lizis olunan maya ştamları və ya çox yumşaq zülal ekstraksiyası üçün sonikasiyadan əvvəl Zymolyase, Lyticase və ya hüceyrə divarını həzm edən başqa bir fermentlə qısamüddətli ilkin emal tətbiq edilə bilər. Bu fermentativ ilkin emal məcburi deyil, lakin lizisin səmərəliliyini artıra və ya tələb olunan ultrasəs intensivliyini azalda bilər.

3. Nümunələri uyğun mikroplaketə köçürün

Maya suspenziyasını sonikasiyaya uyğun mikroplaketə paylayın. Dibi yumru plaketlər çox vaxt üstün tutulur, çünki onlar nümunələrin toplanmasını yaxşılaşdırır və durğun zonaları azaldır. Təkrarlana bilməni yaxşılaşdırmaq üçün bütün yuvalarda bərabər nümunə həcmlərindən istifadə edin.
Buxarlanmanın, aerozol əmələ gəlməsinin və çarpaz çirklənmənin qarşısını almaq üçün plaketi uyğun hermetikləşdirici örtük və ya plyonka ilə bağlayın. Örtüyün seçilmiş temperatur və sonikasiya şəraitinə uyğun olduğuna əmin olun.
Tipik iş həcmləri plaket formatından və tətbiqdən asılıdır. Geniş yayılmış formatlara 96 yuvalı plaketlər, dərin yuvalı plaketlər, PCR plaketləri və ya uyğun sınaq borusu ştativləri daxildir.

4. Soyutmanı təşkil edin

Maya lizisi yüksək ultrasəs intensivliyi tələb edir və mexaniki parçalanma istilik yaradır. Buna görə temperatur nəzarəti, xüsusilə zülal, ferment, RNT və ya fosforlaşma analizi üçün həlledici əhəmiyyət daşıyır.

Aşağıdakılar kimi uyğun soyutma üsulundan istifadə edin:

• əvvəlcədən soyudulmuş lizis buferi
• əvvəlcədən soyudulmuş mikroplaketlər
• sonikasiya intervalları arasında soyutma fasilələri
• tətbiq oluna bildiyi hallarda sonikasiya platformasının xaricdən soyudulması

Məqsəd zülal denaturasiyasının, ferment inaktivasiyasının, RNT deqradasiyasının və istiliyin yaratdığı nümunə dəyişkənliyinin qarşısını almaq üçün nümunəni kifayət qədər soyuq saxlamaqdır.

5. Maya suspenziyasını sonikasiya edin

Hermetik bağlanmış plaketi Hielscher UIP400MTP və ya UIP550MTP mikroplaket sonikatoruna yerləşdirin və impuls rejimli sonikasiya proqramını seçin. İmpuls rejimi tövsiyə olunur, çünki ON fazalarında mexaniki parçalanmaya, OFF fazalarında isə istiliyin yayılmasına imkan verir.
Maya hüceyrələrinin lizisi üçün başlanğıc olaraq:

Çox davamlı maya suspenziyaları, sıx P. pastoris biokütləsi və ya çətin rekombinant zülal ekstraksiyası üçün ümumi ON müddətini mərhələli şəkildə artırın. İstiliyə həssas zülallar və ya ferment analizləri üçün daha qısa impulslardan, daha uzun soyutma fasilələrindən və daha aşağı başlanğıc amplitudadan istifadə edin.

UIP400MTP ilə çoxyuvalı plaketlərdə çoxsaylı maya nümunələrinin yüksək məhsuldarlıqla lizisi

6. Lizatı durulaşdırın

Sonikasiyadan sonra mikroplaketi sentrifuqalayın və ya nümunələri sentrifuqalama üçün sınaq borularına köçürün. Uyğun sürət və temperaturda sentrifuqalama ilə hüceyrə qalıqlarını uzaqlaşdırın. Sonrakı analiz üçün supernatantı toplayın.

Tətbiqdən asılı olaraq lizat aşağıdakılar üçün istifadə edilə bilər:

• zülalların miqdarının təyini
• ferment aktivliyi analizləri
• SDS-PAGE və Western blot analizi
• ELISA və immunoloji analizlər
• LC-MS/MS proteomikası
• metabolit analizi
• DNT və ya RNT-nin təmizlənməsi

7. Metodu optimallaşdırın və sənədləşdirin

Təkrarlana bilən maya lizisi üçün bütün müvafiq parametrləri sənədləşdirin: ştam, kultivasiya şəraiti, OD₆₀₀, yaş hüceyrə kütləsi, bufer tərkibi, plaket növü, nümunə həcmi, amplituda, impuls dövrü, ümumi ON müddəti, soyutma üsulu və nümunənin son temperaturu.
Hielscher sonikatoru avtomatik məlumat qeydi ilə təchiz olunubsa, proses məlumatları sənədləşdirmə, metodun işlənib hazırlanması, miqyasın böyüdülməsi və keyfiyyətə nəzarət üçün istifadə edilə bilər.

Maya lizisinin optimallaşdırılması üçün məsləhətlər

Zülalların maksimum azad olunması üçün sıx maya suspenziyalarından, yüksək ultrasəs intensivliyindən və kifayət qədər ümumi ON müddətindən istifadə edin. Həssas zülallar üçün amplitudanı azaldın, soyutma fasilələrini uzadın və bütün emal müddətində plaketi soyuq saxlayın.
Lizis tam deyilsə, sonikasiya müddətini mərhələli şəkildə artırın, fermentativ ilkin emalı sınaqdan keçirin, nümunənin özlülüyünü azaldın və ya buferi optimallaşdırın. Zülallar parçalanırsa və ya aktivliyini itirirsə, soyutmanı yaxşılaşdırın, ON intervallarını qısaldın, inhibitorlar əlavə edin və detergent sisteminin hədəf zülalla uyğun olduğunu yoxlayın.
Maya ştamları hüceyrə divarının quruluşuna, böyümə fazasına, ekspressiya sisteminə və biokütlə sıxlığına görə əhəmiyyətli dərəcədə fərqləndiyindən, kiçik optimallaşdırma matrisi tövsiyə olunur. Məsələn, üç amplitudanı, iki impuls dövrünü və iki ümumi ON müddətini sınaqdan keçirin, sonra lizisin səmərəliliyini və zülalın bütövlüyünü qiymətləndirin.

Maya lizisi üçün Hielscher mikroplaket sonikatorlarının üstünlükləri

Hielscher mikroplaket sonikatorları çoxsaylı nümunələrdə təkrarlana bilən lizisə ehtiyacı olan laboratoriyalar üçün idealdır. Onlar zondla sonikasiya zamanı nümunələrin bir-bir ləng emal edilməsini aradan qaldırır və zondun əl ilə yerləşdirilməsi, batırılma dərinliyi və nümunələr arasında işləmə fərqlərinin yaratdığı dəyişkənliyi azaldır.

Əsas üstünlüklərə aşağıdakılar daxildir:

• Çoxsaylı nümunələrin yüksək məhsuldarlıqla emalı: Çoxsaylı maya nümunələrini mikroplaketlərdə və ya uyğun nümunə ştativlərində paralel sonikasiya edin.
• Təkrarlana bilən şərait: Bərabər və müqayisə edilə bilən lizis nəticələri üçün bütün yuvalarda eyni sonikasiya şəraiti.
• Zonddan qaynaqlanan çarpaz çirklənmə yoxdur: Sonikasiya zamanı nümunələr hermetik bağlı qalır və bu, nümunələrarası daşınmanı və təmizləmə mərhələlərini azaldır.
• Davamlı hüceyrələr üçün uyğundur: Yüksək intensivlikli ultrasəs maya hüceyrə divarlarının parçalanmasını təmin etməyə kömək edir.
• Səmərəli iş prosesi: Ştamların, klonların, ekspressiya şəraitlərinin və lizis buferlərinin skrininqi üçün idealdır.
• Səmərəli iş prosesi: Proqramlaşdırıla bilən parametrlər, avtomatlaşdırılmış məlumat qeydi və laboratoriya avtomatlaşdırılmasına uyğunluq.

Maya biotexnologiyasında və həyat elmləri tədqiqatlarında tətbiqlər

Mikroplaketlərdə ultrasəslə maya lizisi bir çox tədqiqat və skrininq iş prosesini dəstəkləyir. Rekombinant zülal ekspressiyasında ekspressiya səviyyələrini və ya ferment aktivliyini müqayisə etmək üçün P. pastoris və S. cerevisiae klonları paralel lizis edilə bilər. Sistem biologiyasında və omikada standartlaşdırılmış lizis müxtəlif şəraitlər üzrə müqayisə edilə bilməni yaxşılaşdırır. Mikrobiologiyada sonikasiya müxtəlif ştamlardan, qida mühiti şəraitlərindən və ya stress təsirlərindən alınmış lizatların sürətlə hazırlanmasını təmin etməyə kömək edir.
Tipik tətbiq sahələrinə aşağıdakılar daxildir:

• mayadan zülal ekstraksiyası
• rekombinant zülal skrininqi
• ferment aktivliyinin skrininqi
• transformasiyadan sonra klon seçimi
• fermentasiyanın optimallaşdırılması
• proteomika üçün nümunə hazırlanması
• metabolomika üçün nümunə hazırlanması
• hüceyrə divarının parçalanması üzrə tədqiqatlar
• çoxsaylı nümunələrin yüksək məhsuldarlıqla mikrobioloji analizləri

Etibarlı maya lizisi nəzarət olunan sonikasiya ilə başlayır

Nümunələrin sayı artdıqda maya lizisi çətin ola bilər, lakin Hielscher mikroplaket sonikatorları prosesi daha sürətli, daha təmiz və daha təkrarlana bilən edir. UIP400MTP və UIP550MTP tədqiqatçılara bütöv plaketləri müəyyən edilmiş ultrasəs şəraitində emal etməyə imkan verir, əl ilə işləməni azaldaraq nümunə emal məhsuldarlığını artırır.
Mikrobioloqlar, molekulyar bioloqlar, zülal tədqiqatçıları və biotexnologiya laboratoriyaları üçün mikroplaket sonikasiyası mayanın hüceyrədaxili komponentlərini səmərəli və təkrarlana bilən şəkildə azad etmək üçün güclü vasitədir.

Ədəbiyyat / İstinadlar

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics 2024.