Mikroplata Sonikasiyası Shotgun Proteomikasında – Tətbiq Qeydi

Shotgun proteomikası mürəkkəb bioloji materialı LC-MS/MS-hazır peptidlərə çevirmək üçün effektiv, təkrarlana bilən nümunə hazırlanmasına əsaslanır. UIP400MTP mikroplitə sonikatoru bu prosesi dəstəkləyir, kiçik həcmli nümunələrin standartlaşdırılmış, paralel sonikasiyasını mümkün edir və laboratoriyalara mikroplitə əsaslı iş axınlarında pozulma, çıxarma və həll olunmasını yaxşılaşdırmağa kömək edir. Bu müraciət qeydi UIP400MTP-nin proteomik nümunə hazırlanmasına necə inteqrasiya oluna biləcəyini izah edir, PLA2G12A/Th17 tədqiqatlarından dərc olunmuş ekstrasellular-vezikül iş axınından laboratoriyada sınaqdan keçirilən nümunə kimi istifadə olunur.

Daha Təkrarlanan Pompalı Tüfəng Proteomikası üçün Mikroplaka Sonikasiyası

Proteomika tədqiqatçıları üçün yüksək keyfiyyətli LC-MS/MS məlumatları üçün təkrar istehsal olunan nümunə hazırlığı çox vacibdir. UIP400MTP mikrotəxmini sonikator plaka əsaslı və kiçik həcimli/yüksək keçiricilik iş axınlarında standartlaşdırılmış, paralel sonikasiyanı dəstəkləyir.

Bu xüsusilə aşağıdakı laboratoriyalar üçün faydalıdır:

• Çoxlu quyular üzrə ardıcıl işləmə tələb edən böyük nümunə dəstləri
• Nümunə itkisi və dəyişkənliyin minimuma endirilməli olduğu məhdud giriş materialı
• Xarici veziküllər kimi lipidlə zəngin nümunələr
• Səmərəli parçalanma, çıxarılma və ya yenidən həll edilmə tələb edən mürəkkəb bioloji hazırlıqlar
• Şərtlər və təkrarlar üzrə təkrar istehsal olunan müqayisəli şotqan proteomikasında vacibdir

Həzm prosesinə başlamazdan əvvəl mikrotəxmini sonikasiyanı inteqrasiya etməklə tədqiqatçılar nümunənin hazırlanmasını yaxşılaşdıra bilərlər:

• Zülal çıxarılması və yenidən həll edilmə
• Tripsin/Lys-C həzmi
• Nano-LC/MS/MS əldə etmə
• Kəmiyyət aşağı axın proteomika analizi

 

Proteomika nümunə hazırlığını inamla miqyaslayın!
Mikroplitə sonikasiyasının əl ilə dəyişkənliyi azaltmaq, nümunə pozulmasını yaxşılaşdırmaq və etibarlı LC-MS/MS analizinə mürəkkəb bioloji nümunələr hazırlamaq üçün necə kömək etdiyini öyrənin.

İnformasiya tələbi


E-poçt ünvanı (tələb olunur)


Məhsul və ya maraq sahəsi



Mən Məxfilik Siyasəti ilə razıyam









Məlumat tələb edin

Mikroplaka sonikasiyası fayda verə bilər:

• Proteomika əsas imkanları
• EV tədqiqat laboratoriyaları
• İmmunologiya və hüceyrə biologiyası laboratoriyaları
• Translasiya tədqiqat qrupları
• Həyat elmləri komandaları tək nümunə hazırlığından daha yüksək məhsuldarlıqlı iş axınlarına keçər

Ekstrasellulyar Vezikul Proteom Analizi üçün Yüksək Sürətli Nümunə Hazırlığı

Shotgun Proteomika Nədir?

Shotgun proteomics has become a central analytical strategy for characterizing complex biological samples, from whole-cell lysates and tissue extracts to purified organelles, extracellular vesicles, and low-input clinical specimens. Its core strength lies in the coupling of protein digestion, high-resolution liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and computational peptide-to-protein inference. However, the quality of the final proteome dataset is determined long before the sample reaches the mass spectrometer. Efficient sample disruption, protein solubilization, removal of interfering substances, reproducible enzymatic digestion, and robust peptide recovery are all decisive for depth of coverage and quantitative reliability.
Məhdud və ya qiymətli nümunələrlə işləyən proteomika tədqiqatçıları və həyat elmləri laboratoriyaları üçün nümunə hazırlığı tez-tez dar boğazdır.

Proteomikada Hüceyrəxarici Vezikulların Çətinliyi

Extracellular vesicles (EVs), for example, represent a particularly demanding sample class. They are membrane-bound, lipid-rich, nanoscale particles with relatively low protein yield and a high potential for carry-over of lipids, salts, detergents, serum proteins, and other matrix components. These features can interfere with digestion efficiency, chromatographic performance, electrospray stability, and peptide identification. A preparation workflow for EV proteomics must therefore be strong enough to disrupt vesicle structures and solubilize protein cargo, while remaining compatible with downstream enzymatic digestion and LC-MS/MS analysis.
Bu kontekstdə, mikroplitə uyğun ultrasəs nümunələrinin təkrarlana bilən, paralel emalı üçün praktik yanaşma təklif edir. Hielscher mikroplitə sonikator modelləri UIP400MTP (400 Vt) və UIP550MTP (550 Vt) çoxquyulu lövhələrdə və kiçik həcmli qablarda nümunələrin sonikasiyası üçün nəzərdə tutulub və ənənəvi tək zondlu sonikatorlardan daha yüksək məhsuldarlıq iş axınlarını dəstəkləyir. Proteomika laboratoriyaları üçün bu format cəlbedicidir, çünki əl ilə dəyişkənliyi azalda, bir neçə nümunənin paralel işlənməsini yaxşılaşdıra və lövhə əsaslı nümunə hazırlama boru xətlərinə daha təbii şəkildə inteqrasiya edə bilər.

Nümunəvi İş Axını

PLA2G12A əsaslı Th17-hüceyrə biologiyasında son zamanlar aparılan ekstrasellulyar vezikül proteomikası iş axını, mikroplitə sonikatorunun UIP400MTP tüfəng proteomika nümunələrinin hazırlanmasına necə daxil edilə biləcəyinə dair faydalı, laboratoriyada sınaqdan keçirilmiş nümunə təqdim edir. Həmin tədqiqat seriyasında EV nümunələri metanol müalicəsi, UIP400MTP sonikasiya, sentrifuqasiya, qurutma, tripsin/Lys-C həzm və nano-axın LC-yüksək ayırdetməli tandem MS ilə proteom analizi üçün emal edildi. Eyni bioloji iş ilk dəfə bioRxiv preprint kimi təqdim olunub və sonradan Cell Reports-da dərc olunub, burada proteomika analizi PLA2G12A patogen T-hüceyrə cavabları kontekstində EV yük zülallarını necə dəyişdirdiyini xarakterizə etməyə kömək edib.

Çox quyulu boşqab sonikatoru UIP400MTP

Niyə mikroplitə sonikasiyası?
The UIP400MTP enables standardized, parallel sonication of small-volume samples. This is useful when reproducibility, low sample input, and multi-sample throughput are important.


Keyfiyyət Nəzarət Siyahısı

• Bütün nümunələrdə bərabər EV protein-ekvivalent girişini təsdiqləyin.
• Təsadüfi və ya balanslaşdırılmış nümunə işləmə sxemlərindən istifadə edin.
• Metanol həcmi, sonikasiya vaxtı, quruma vaxtı və həzm həcmini eyni saxlayın.
• Peptid hasilatı və ümumi protein identifikasiyalarını izləyin.
• Qaçırılmış-klivaj sürətini və peptid uzunluğu paylanmasını yoxlayın.
• Xromatoqrafik pik formasını və saxlanma vaxtının təkrarlana bilməsini yoxlayın.
• Köçürməni izləmək üçün boşluqlar əlavə edin.
• Böyük tədqiqatlar üçün birləşdirilmiş QC nümunələrindən istifadə edin.
• Təkrarlanan variasiya əmsalını qiymətləndirin.
• Partiya təsirləri və ya aykırı nümunələri müəyyən etmək üçün PCA və ya əlaqəli metodlardan istifadə edin.

Protokol Tövsiyələri

Bu iş axınını dərc edərkən və ya sənədləşdirərkən, EV giriş miqdarı, plitə formatı, metanol həcmi, UIP400MTP-nin amplituda və sonikasiyaya sərf olunan vaxtı, sentrifuqasiya şərtləri, quruma üsulu, enzim həlli, enzim konsentrasiyası, həzm müddəti, turşulama şərtləri, LC-MS/MS platforması, əldəetmə rejimi, proqram təminatı versiyası, verilənlər bazası, FDR həddi, normallaşdırma metodu və statistik iş axını barədə məlumat verin.
Bütün Hielscher mikroplaka sonikatorları amplituda, sonikasiyanın müddəti və temperatur kimi vacib proses parametrlərini tarix və vaxt möhürü ilə birgə inteqrasiya olunmuş SD-kart üzərində CSV faylı kimi avtomatik qeyd edir. Təkrar istehsal və keyfiyyətə nəzarət üçün məlumatların protokollaşdırılması heç vaxt bu qədər asan olmayıb!

Tədqiqatın təfərrüatları: PLA2G12A Tədqiqatında EV Shotgun Proteomikası

The PLA2G12A study provides a concrete example of UIP400MTP use in a shotgun proteomics workflow. The biological question was how the secreted phospholipase PLA2G12A modifies Th17-cell-derived extracellular vesicles and thereby influences pathogenic T-cell differentiation. The authors showed that PLA2G12A acts on EV membranes to produce lysophospholipids, including 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine, and that downstream lysophosphatidic acid signaling via LPA2 contributes to Th17 differentiation. Beyond lipid signaling, the studies also examined EV cargo, including RNA and protein content, making shotgun proteomics an important component of the characterization strategy.
In the EV preparation workflow, Th17 cells were cultured in medium containing exosome-depleted fetal bovine serum. Culture supernatants were first centrifuged to remove cells, filtered through a 0.22 µm filter, concentrated by ultrafiltration/ultracentrifugation, washed, resuspended in PBS, and quantified by BCA protein assay. This upstream EV preparation ensured that a defined protein-equivalent amount of EV material could be carried into the proteomics workflow.
For shotgun proteomic analysis, the authors used EV samples corresponding to 5 µg protein equivalents. These samples were dried in PCR tubes, and 25 µL methanol was added. The samples were then sonicated for 3 minutes using the UIP400MTP microplate sonicator. Following sonication, the samples were centrifuged at 4°C for 20 minutes at 19,000 × g. After removal of 20 µL supernatant, the samples were centrifuged to dryness. Proteins were then dissolved by sonication in 4 µL trypsin/Lys-C solution at 100 ng/µL in 50 mM ammonium bicarbonate. Digestion was performed for 2 hours at 37°C with shaking at 300 rpm. The digest was acidified with 1 µL of 1.25% trifluoroacetic acid and submitted to nano-flow LC-high-resolution tandem mass spectrometry.
This workflow highlights several useful principles for low-input EV proteomics. First, the input was normalized by protein equivalent, which is important when comparing EVs from different genotypes or treatments. Second, methanol was used before sonication, supporting disruption and extraction while avoiding detergent systems that may complicate LC-MS/MS. Third, the sonication step was short and standardized, which is compatible with parallel sample processing. Fourth, trypsin/Lys-C digestion was performed in a very small volume, reducing dilution and supporting low-input peptide recovery. Finally, direct transition from digestion to acidification and LC-MS/MS minimized unnecessary handling steps.
Aşağı axın LC-MS/MS metodu nano-axınlı tərs faza ayrılmasını Q-Exactive HF Orbitrap kütlə spektrometri ilə birləşdirirdi. Nümunələr C18 ön sütununda tutulur, sonra 50 μm daxili diametrli analitik sütunda 200 nL/dəq və 40°C temperaturda ayrılırdı. Qradient 60 dəqiqə ərzində aşağı üzvi həlledici maddədən 35% həll edici B-yə qədər dəyişirdi, ardınca yüksək üzvi yuma və yenidən tarazlaşdırma baş verirdi. MS-in əldə edilməsi müsbət ion rejimində, daha yüksək enerjili toqquşma dissosiasiyası ilə məlumatdan asılı olmayan qəbuldan istifadə edilərək həyata keçirildi. DIA xam faylları DIA-NN 1.8 və in silico proqnozlaşdırılmış spektral kitabxana ilə analiz edildi.