Shotgun proteomikasında mikroplakaların ultrasəslə işlənməsi – Tətbiq qeydi
Shotgun proteomikası mürəkkəb bioloji materialı LC-MS/MS üçün hazır peptidlərə çevirmək üçün səmərəli və təkrarlana bilən nümunə hazırlığından asılıdır. UIP400MTP mikroplaka ultrasəs cihazı kiçik həcmli nümunələrin standartlaşdırılmış, paralel ultrasəslə işlənməsini təmin etməklə bu prosesi dəstəkləyir və laboratoriyalara mikroplaka əsaslı iş axınlarında parçalama, ekstraksiya və yenidən həll etməni yaxşılaşdırmağa kömək edir. Bu tətbiq qeydi PLA2G12A/Th17 tədqiqatlarından dərc olunmuş hüceyrəxarici vezikul iş axınını laboratoriyada sınaqdan keçirilmiş nümunə kimi istifadə edərək UIP400MTP cihazının proteomik nümunə hazırlığına necə inteqrasiya edilə biləcəyini təsvir edir.
Daha təkrarlana bilən shotgun proteomikası üçün mikroplakaların ultrasəslə işlənməsi
Proteomika tədqiqatçıları üçün təkrarlana bilən nümunə hazırlığı yüksək keyfiyyətli LC-MS/MS məlumatlarının əldə edilməsində həlledici əhəmiyyət daşıyır. UIP400MTP mikroplaka ultrasəs cihazı plaka əsaslı və kiçik həcmli/yüksək nümunə emalı məhsuldarlığına malik iş axınlarında standartlaşdırılmış, paralel ultrasəslə işləməni dəstəkləyir.
O, xüsusilə aşağıdakılarla işləyən laboratoriyalar üçün faydalıdır:
- Çoxsaylı yuvalarda eyni qaydada işlənmə tələb edən böyük nümunə dəstləri
- Nümunə itkisinin və dəyişkənliyin minimuma endirilməli olduğu məhdud miqdarda başlanğıc material
- Hüceyrəxarici vezikullar kimi lipidlərlə zəngin nümunələr
- Səmərəli parçalama, ekstraksiya və ya yenidən həll etmə tələb edən mürəkkəb bioloji preparatlar
- Müxtəlif şəraitlər və təkrarlar arasında təkrarlanabilirliyin vacib olduğu müqayisəli shotgun proteomikası
Proteolitik parçalanmadan əvvəl mikroplakaların ultrasəslə işlənməsini inteqrasiya etməklə tədqiqatçılar nümunələrin aşağıdakılara hazırlığını yaxşılaşdıra bilərlər:
- Zülal ekstraksiyası və yenidən həll etmə
- Tripsin/Lys-C ilə proteolitik parçalanma
- Nano-LC/MS/MS məlumatlarının toplanması
- Sonrakı kəmiyyət proteomik analizi
Mikroplakaların ultrasəslə işlənməsinin əl əməliyyatlarından yaranan dəyişkənliyi azaltmağa, nümunələrin parçalanmasını yaxşılaşdırmağa və mürəkkəb bioloji nümunələri etibarlı LC-MS/MS analizinə hazırlamağa necə kömək etdiyini öyrənin.
Mikroplakaların ultrasəslə işlənməsi aşağıdakılar üçün faydalı ola bilər:
- Proteomika üzrə mərkəzi xidmət laboratoriyaları
- EV tədqiqat laboratoriyaları
- İmmunologiya və hüceyrə biologiyası laboratoriyaları
- Translyasion tədqiqat qrupları
- Tək nümunə hazırlığından daha yüksək nümunə emalı məhsuldarlığına malik iş axınlarına keçən həyat elmləri üzrə komandalar
Hüceyrəxarici vezikulların proteom analizinə yüksək nümunə emalı məhsuldarlığı ilə nümunə hazırlığı
Shotgun proteomikası nədir?
Shotgun proteomikası bütöv hüceyrə lizatlarından və toxuma ekstraktlarından tutmuş təmizlənmiş orqanellərə, hüceyrəxarici vezikullara və az miqdarlı klinik nümunələrə qədər mürəkkəb bioloji nümunələrin xarakterizə edilməsi üçün əsas analitik strategiyaya çevrilmişdir. Onun əsas üstünlüyü zülalların proteolitik parçalanmasının, yüksək ayırdetməli maye xromatoqrafiyası–tandem kütlə spektrometriyasının və peptidlər əsasında zülalların hesablama yolu ilə müəyyənləşdirilməsinin birləşdirilməsindədir. Lakin yekun proteom məlumat dəstinin keyfiyyəti nümunə kütlə spektrometrinə çatmazdan xeyli əvvəl müəyyən olunur. Nümunənin səmərəli parçalanması, zülalların həll edilməsi, maneə yaradan maddələrin uzaqlaşdırılması, təkrarlana bilən fermentativ parçalanma və peptidlərin etibarlı bərpası əhatə dərinliyi və kəmiyyət nəticələrinin etibarlılığı üçün həlledicidir.
Məhdud və ya qiymətli nümunələrlə işləyən proteomika tədqiqatçıları və həyat elmləri laboratoriyaları üçün nümunə hazırlığı çox vaxt prosesi məhdudlaşdıran mərhələdir.
UIP400MTP etibarlı nümunə hazırlığını və mövcud laboratoriya iş axınlarına asan inteqrasiyanı təmin edir
Proteomikada hüceyrəxarici vezikullarla bağlı çətinliklər
Məsələn, hüceyrəxarici vezikullar (EV-lər) xüsusilə çətin işlənən nümunə sinfini təşkil edir. Bunlar membranla əhatə olunmuş, lipidlərlə zəngin, nanoölçülü hissəciklərdir; zülal çıxımı nisbətən aşağıdır və lipidlərin, duzların, detergentlərin, serum zülallarının və digər matriks komponentlərinin sonrakı mərhələlərə daşınma ehtimalı yüksəkdir. Bu xüsusiyyətlər proteolitik parçalanmanın səmərəliliyinə, xromatoqrafik göstəricilərə, elektrosprey sabitliyinə və peptidlərin identifikasiyasına mane ola bilər. Buna görə EV proteomikası üçün hazırlıq iş axını vezikul strukturlarını parçalamaq və onların daşıdığı zülalları həll etmək üçün kifayət qədər güclü olmalı, eyni zamanda sonrakı fermentativ parçalanma və LC-MS/MS analizi ilə uyğunluğunu saxlamalıdır.
Bu kontekstdə mikroplakalarla uyğun ultrasəslə işləmə nümunələrin təkrarlana bilən, paralel emalı üçün praktik yanaşma təqdim edir. Hielscher mikroplaka ultrasəs cihazlarının UIP400MTP (400 W) və UIP550MTP (550 W) modelləri çoxyuvalı plakalarda və kiçik həcmli qablarda nümunələrin ultrasəslə işlənməsi üçün nəzərdə tutulmuşdur və ənənəvi təkzondlu ultrasəs cihazları ilə müqayisədə daha yüksək nümunə emalı məhsuldarlığına malik iş axınlarını dəstəkləyir. Proteomika laboratoriyaları üçün bu format cəlbedicidir, çünki əl əməliyyatlarından yaranan dəyişkənliyi azalda, çoxsaylı nümunələrin paralel işlənməsini yaxşılaşdıra və plaka əsaslı nümunə hazırlığı ardıcıllıqlarına daha təbii şəkildə inteqrasiya oluna bilər.
Nümunə iş axını
PLA2G12A-nın yönləndirdiyi Th17 hüceyrə biologiyasına dair son hüceyrəxarici vezikul proteomikası iş axını UIP400MTP mikroplaka ultrasəs cihazının shotgun proteomikası üçün nümunə hazırlığına necə daxil edilə biləcəyinə dair faydalı, laboratoriyada sınaqdan keçirilmiş nümunə təqdim edir. Həmin tədqiqatlar silsiləsində EV nümunələri metanolla işləmə, UIP400MTP ilə ultrasəslə işləmə, sentrifuqalama, qurutma, tripsin/Lys-C ilə proteolitik parçalanma və nanoaxınlı LC–yüksək ayırdetməli tandem MS vasitəsilə proteom analizinə hazırlanmışdır. Bioloji tədqiqat 2026-cı ildə Mochizuki-Ono və həmkarları tərəfindən dərc edilmişdir; burada proteomik analiz patogen T-hüceyrə cavabları kontekstində PLA2G12A-nın EV-lərin daşıdığı zülalları necə dəyişdirdiyini xarakterizə etməyə kömək etmişdir.
Yüksək nümunə emalı məhsuldarlığı ilə zülal ekstraksiyası üçün 96 yuvalı plaka ultrasəs cihazı UIP400MTP
Ultrasəs cihazı: UIP400MTP mikroplaka ultrasəs cihazı
Başlanğıc material: 5 µg EV zülal ekvivalenti
Proteolitik parçalanma: Tripsin/Lys-C
Analitik nəticə: Nano-LC-MS/MS / DIA proteomikası
Addım-addım təlimat: UIP400MTP köməyi ilə shotgun proteomikası üçün EV nümunələrinin hazırlanması
Bu iş axını UIP400MTP mikroplaka ultrasəs cihazından istifadə etməklə az miqdarda başlanğıc material əsasında hüceyrəxarici vezikulların (EV) shotgun proteomikası üçün nümunə hazırlığı metodunu təsvir edir. O, EV nümunələrinin normallaşdırıldığı, qurudulduğu, metanolla işləndiyi, ultrasəslə işləndiyi, tripsin/Lys-C ilə proteolitik parçalandığı, turşulaşdırıldığı və nano-LC-MS/MS vasitəsilə analiz edildiyi dərc olunmuş EV proteomikası iş axınına əsaslanır.
Bu prosedur EV-ləri və ya digər kiçik həcmli, lipidlərlə zəngin bioloji nümunələri aşağıdan yuxarıya shotgun proteomikası üçün hazırlayan proteomika tədqiqatçıları və həyat elmləri laboratoriyaları üçün nəzərdə tutulmuşdur.
İş axınına ümumi baxış
| Mərhələ | Məqsəd | Əsas nəticə |
|---|---|---|
| EV hazırlığı | EV nümunələrini təcrid edin, yuyun və miqdarını müəyyənləşdirin | Normallaşdırılmış EV başlanğıc materialı |
| Nümunənin qurudulması | Həlledici köməyi ilə emaldan əvvəl mayeni uzaqlaşdırın | Qurudulmuş EV materialı |
| Metanolla işləmə | Lipidlərlə zəngin EV materialının parçalanmasını dəstəkləyin | Metanolla isladılmış nümunə |
| UIP400MTP ilə ultrasəslə işləmə | Parçalama, ekstraksiya və homogenləşməni təşviq edin | İşlənmiş EV nümunəsi |
| Proteolitik parçalanma | EV zülallarından peptidlər əldə edin | Tripsin/Lys-C ilə parçalanmadan alınan peptid qarışığı |
| LC-MS/MS analizi | Peptidləri ayırın, aşkar edin və miqdarını müəyyənləşdirin | Proteomika məlumat dəsti |
| Məlumatların analizi | Peptidləri və zülalları identifikasiya edin və miqdarını müəyyənləşdirin | Zülal səviyyəsində nəticələr |
Addım-addım protokol
| Addım | Təlimat | Kritik parametrlər |
|---|---|---|
| 1 | Laboratoriyanın qəbul edilmiş təcridetmə iş axınından istifadə edərək təmizlənmiş EV nümunələri hazırlayın. | Proteomika üçün hazırlıqdan əvvəl hüceyrələri, qalıqları və əsas çirkləndiriciləri uzaqlaşdırın. |
| 2 | EV-lərin zülal miqdarını, məsələn, BCA analizi ilə müəyyənləşdirin. | Bütün nümunələri bərabər zülal-ekvivalentli başlanğıc material miqdarına normallaşdırın. |
| 3 | 5 µg EV zülal ekvivalentini təmiz PCR sınaq borularına və ya uyğun kiçik həcmli sınaq borularına köçürün. | Nümunə itkisi narahatlıq doğurduqda aşağı adsorbsiyalı sınaq borularından istifadə edin. |
| 4 | EV nümunələrini tamamilə qurudun. | Həddindən artıq qızdırmadan çəkinin; görünən maye qalmadığını təsdiqləyin. |
| 5 | Hər qurudulmuş EV nümunəsinə 25 µL metanol əlavə edin. | Qurudulmuş materialın tam islanmasını təmin edin. |
| 6 | UIP400MTP mikroplaka ultrasəs cihazından istifadə edərək nümunələri 3 dəqiqə ultrasəslə işləyin. | Bütün nümunələr üçün eyni ultrasəslə işləmə parametrlərindən və yerləşdirmə məntiqindən istifadə edin. |
| 7 | Ultrasəslə işlənmiş nümunələri 19.000 × g-də 20 dəqiqə ərzində 4°C-də sentrifuqalayın. | Sentrifuqalamadan sonra hər hansı çöküntünü və ya həll olmayan materialı tərpətməkdən çəkinin. |
| 8 | Supernatantın 20 µL hissəsini ehtiyatla uzaqlaşdırın. | Bütün nümunələr üçün eyni pipetləmə texnikasından istifadə edin. |
| 9 | Qalan nümunə materialını tamamilə qurudun. | Birbaşa proteolitik parçalanmaya keçin və ya yalnız təsdiqlənmiş şəraitdə saxlayın. |
| 10 | 50 mM ammonium bikarbonatda 100 ng/µL konsentrasiyalı tripsin/Lys-C məhlulundan 4 µL əlavə edin. | Ferment məhlulunu təzə hazırlayın və ya düzgün saxlanmış alikvotlardan istifadə edin. |
| 11 | Qurudulmuş zülal materialını proteolitik parçalanma məhlulunda həll etmək üçün qısa müddət ultrasəslə işləyin. | Ultrasəslə işləmədən sonra bütün mayeni sınaq borusunun dibində toplayın. |
| 12 | 300 rpm-də çalxalama ilə 37°C-də 2 saat ərzində proteolitik parçalanma aparın. | Buxarlanmanın qarşısını almaq üçün qapaqları möhkəm bağlı saxlayın. |
| 13 | Parçalanma qarışığını turşulaşdırmaq üçün 1,25% TFA-dan 1 µL əlavə edin. | Turşulaşdırma proteolitik parçalanmanı dayandırır və peptidləri LC-MS/MS üçün hazırlayır. |
| 14 | Parçalanma qarışığını LC-MS ilə uyğun flakonlara və ya plakalara köçürün. | Həll olmayan qalıqları köçürməkdən çəkinin. |
| 15 | Nano-LC-MS/MS vasitəsilə analiz edin. | Eyni inyeksiya həcmindən, LC qradiyentindən və MS məlumat toplama parametrlərindən istifadə edin. |
| 16 | İlkin məlumatları uyğun olaraq DIA, DDA və ya hədəfli proteomika proqram təminatı ilə emal edin. | Uyğun məlumat bazası, ferment spesifikliyi, modifikasiya parametrləri və FDR hədləri tətbiq edin. |
(bax: Mochizuki-Ono və b., 2026)
Çoxyuvalı plaka ultrasəs cihazı UIP400MTP
Niyə mikroplakaları ultrasəslə işləmək lazımdır?
UIP400MTP kiçik həcmli nümunələrin standartlaşdırılmış, paralel ultrasəslə işlənməsini təmin edir. Bu, təkrarlanabilirlik, az miqdarda başlanğıc nümunə və çoxsaylı nümunələrin emal məhsuldarlığı vacib olduqda faydalıdır.
İstənilən standart mikroplakadan istifadə edin! UIP400MTP ilə yüksək nümunə emalı məhsuldarlığına malik nümunə hazırlığı
İstinad edilən EV proteomikası iş axınında 5 µg zülal-ekvivalentli EV başlanğıc materialı, 25 µL metanol, UIP400MTP ilə 3 dəqiqə ultrasəslə işləmə, tripsin/Lys-C ilə proteolitik parçalanma, TFA ilə turşulaşdırma və nano-LC-MS/MS analizi istifadə edilmişdir.
Tövsiyə olunan LC-MS/MS və məlumat analizi mərhələləri
Proteolitik parçalanma və turşulaşdırmadan sonra nümunələr yüksək ayırdetməli tandem kütlə spektrometriyası ilə birləşdirilmiş nanoaxınlı tərs fazalı LC vasitəsilə analiz edilə bilər. Dərc olunmuş iş axınında peptidlər nano-LC sistemində ayrılmış və Orbitrap kütlə spektrometrində məlumatdan asılı olmayan toplama rejimi ilə analiz edilmişdir.
| Mərhələ | Tövsiyə | Məqsəd |
|---|---|---|
| Nümunənin yüklənməsi | C18 tutucu kolondan və ya ekvivalent peptid yükləmə qurğusundan istifadə edin. | Peptidləri qatılaşdırır və yüksək polyarlı çirkləndiriciləri uzaqlaşdırır. |
| Peptidlərin ayrılması | Nanoaxınlı tərs fazalı LC-dən istifadə edin. | Peptidlərin ayrılmasını və MS həssaslığını yaxşılaşdırır. |
| MS məlumatlarının toplanması | Tədqiqatın quruluşundan asılı olaraq DIA, DDA və ya hədəfli MS üsulundan istifadə edin. | Peptid səviyyəsində spektral məlumatlar yaradır. |
| Məlumat bazasında axtarış | Bioloji növə uyğun istinad məlumat bazasından istifadə edin. | Peptidlərin və zülalların identifikasiyasını dəstəkləyir. |
| FDR nəzarəti | Peptid və zülal səviyyəsində yanlış aşkarlanma nisbəti hədləri tətbiq edin. | İdentifikasiyanın etibarlılıq səviyyəsinə nəzarət edir. |
| Miqdarın müəyyənləşdirilməsi | Peptid, prekursor və zülal bolluğu cədvəllərini ixrac edin. | Qruplar arasında statistik müqayisəyə imkan verir. |
Keyfiyyətə nəzarət üçün yoxlama siyahısı
- Bütün nümunələrdə EV zülal-ekvivalentli başlanğıc material miqdarının bərabər olduğunu təsdiqləyin.
- Nümunələrin işlənməsi üçün təsadüfiləşdirilmiş və ya balanslaşdırılmış yerləşdirmə sxemlərindən istifadə edin.
- Metanol həcmini, ultrasəslə işləmə müddətini, qurutma müddətini və proteolitik parçalanma həcmini eyni saxlayın.
- Peptid çıxımını və identifikasiya edilmiş zülalların ümumi sayını izləyin.
- Baş verməmiş kəsilmələrin nisbətini və peptid uzunluğunun paylanmasını yoxlayın.
- Xromatoqrafik pik formasını və tutulma vaxtının təkrarlanabilirliyini yoxlayın.
- Daşınmanı izləmək üçün boş nəzarət nümunələri daxil edin.
- Daha böyük tədqiqatlar üçün birləşdirilmiş QC nümunələrindən istifadə edin.
- Təkrarların variasiya əmsalını qiymətləndirin.
- Partiya təsirlərini və ya kənarlaşan nümunələri müəyyən etmək üçün PCA və ya əlaqəli metodlardan istifadə edin.
Məlumatların qeydə alınması üzrə tövsiyələr
Bu iş axınını dərc edərkən və ya sənədləşdirərkən EV başlanğıc materialının miqdarını, plaka formatını, metanol həcmini, UIP400MTP cihazının amplitudasını və ultrasəslə işləmə müddətini, sentrifuqalama şəraitini, qurutma metodunu, proteolitik parçalanma buferini, ferment konsentrasiyasını, proteolitik parçalanma müddətini, turşulaşdırma şəraitini, LC-MS/MS platformasını, məlumat toplama rejimini, proqram təminatının versiyasını, məlumat bazasını, FDR həddini, normallaşdırma metodunu və statistik iş axınını bildirin.
Bütün Hielscher mikroplaka ultrasəs cihazları amplituda, ultrasəslə işləmə müddəti və temperatur kimi mühüm proses parametrlərini tarix və vaxt möhürü ilə birlikdə inteqrasiya edilmiş SD-kartda CVS faylı şəklində avtomatik qeydə alır. Təkrarlanabilirlik və keyfiyyətə nəzarət üçün məlumatların qeydə alınması heç vaxt bu qədər asan olmamışdı!
DIA proteomikası üçün bütün nümunələrdə eyni məlumat toplama parametrlərindən istifadə edin və mümkün olduqda birləşdirilmiş QC nümunələri daxil edin. Prekursor sayını, tutulma vaxtının sabitliyini və təkrarlar arasındakı dəyişkənliyi izləyin.
Bu iş axını EV proteomikası üçün laboratoriyada sınaqdan keçirilmiş nümunədir. Digər nümunə növləri üçün tam tədqiqat miqyasına keçməzdən əvvəl başlanğıc materialın miqdarını, həlledici şəraitini, ultrasəslə işləmə müddətini, proteolitik parçalanma həcmini və LC-MS/MS inyeksiya strategiyasını optimallaşdırın.
Tədqiqatın təfərrüatları: PLA2G12A tədqiqatında EV shotgun proteomikası
PLA2G12A tədqiqatı UIP400MTP cihazının shotgun proteomikası iş axınında istifadəsinə konkret nümunə təqdim edir. Bioloji sual sekresiya olunan PLA2G12A fosfolipazasının Th17 hüceyrələrindən yaranan hüceyrəxarici vezikulları necə dəyişdirməsi və bununla patogen T-hüceyrə diferensiasiyasına necə təsir göstərməsi idi. Müəlliflər PLA2G12A fermentinin EV membranlarına təsir edərək 1-oleoil-lizofosfatidiletanolamin də daxil olmaqla lizofosfolipidlər əmələ gətirdiyini və sonrakı mərhələdə LPA2 vasitəsilə lizofosfatid turşusunun siqnal ötürülməsinin Th17 diferensiasiyasına töhfə verdiyini göstərmişlər. Lipid siqnallarından əlavə, tədqiqatlarda EV vezikullarının daşıdığı komponentlər, o cümlədən RNA və zülal tərkibi də araşdırılmışdır; bu isə shotgun proteomikasını xarakterizəetmə strategiyasının mühüm tərkib hissəsinə çevirmişdir.
EV hazırlığı iş axınında Th17 hüceyrələri ekzosomlardan təmizlənmiş fetal iribuynuzlu heyvan serumu olan mühitdə kultivasiya edilmişdir. Kultura supernatantları əvvəlcə hüceyrələri uzaqlaşdırmaq üçün sentrifuqalanmış, 0,22 µm filtrdən keçirilmiş, ultrafiltrasiya/ultrasentrifuqalama ilə qatılaşdırılmış, yuyulmuş, PBS məhlulunda yenidən suspenziya halına gətirilmiş və BCA zülal analizi ilə miqdarı müəyyənləşdirilmişdir. Bu ilkin EV hazırlığı EV materialının müəyyən edilmiş zülal-ekvivalentli miqdarının proteomika iş axınına daxil edilməsini təmin etmişdir.
Shotgun proteomik analizi üçün müəlliflər 5 µg zülal ekvivalentinə uyğun EV nümunələrindən istifadə etmişlər. Bu nümunələr PCR sınaq borularında qurudulmuş və 25 µL metanol əlavə edilmişdir. Sonra nümunələr UIP400MTP mikroplaka ultrasəs cihazı ilə 3 dəqiqə ultrasəslə işlənmişdir. Ultrasəslə işləmədən sonra nümunələr 4°C-də 20 dəqiqə ərzində 19.000 × g-də sentrifuqalanmışdır. Supernatantın 20 µL hissəsi uzaqlaşdırıldıqdan sonra nümunələr quruyanadək sentrifuqalanmışdır. Daha sonra zülallar 50 mM ammonium bikarbonatda 100 ng/µL konsentrasiyalı tripsin/Lys-C məhlulunun 4 µL həcmində ultrasəslə işləmə yolu ilə həll edilmişdir. Proteolitik parçalanma 300 rpm-də çalxalama ilə 37°C-də 2 saat ərzində aparılmışdır. Parçalanma qarışığı 1,25% triflüorasetik turşunun 1 µL həcmi ilə turşulaşdırılmış və nanoaxınlı LC–yüksək ayırdetməli tandem kütlə spektrometriyası ilə analizə təqdim edilmişdir.
Bu iş axını az miqdarda başlanğıc materialla EV proteomikası üçün bir neçə faydalı prinsipi önə çıxarır. Birincisi, başlanğıc material zülal ekvivalenti üzrə normallaşdırılmışdır; bu, müxtəlif genotiplərdən və ya təsir şəraitlərindən alınmış EV vezikullarının müqayisəsi zamanı vacibdir. İkincisi, ultrasəslə işləmədən əvvəl metanoldan istifadə edilmişdir; bu, parçalama və ekstraksiyanı dəstəkləməklə yanaşı, LC-MS/MS analizini mürəkkəbləşdirə bilən detergent sistemlərindən yayınmağa imkan vermişdir. Üçüncüsü, ultrasəslə işləmə mərhələsi qısa və standartlaşdırılmış olmuşdur ki, bu da nümunələrin paralel emalı ilə uyğundur. Dördüncüsü, tripsin/Lys-C ilə proteolitik parçalanma çox kiçik həcmdə aparılmış, durulaşmanı azaltmış və az miqdarda başlanğıc materialdan peptidlərin bərpasını dəstəkləmişdir. Nəhayət, proteolitik parçalanmadan birbaşa turşulaşdırmaya və LC-MS/MS analizinə keçid lazımsız işləmə addımlarını minimuma endirmişdir.
Sonrakı LC-MS/MS metodunda Q-Exactive HF Orbitrap kütlə spektrometri ilə birləşdirilmiş nanoaxınlı tərs fazalı ayırmadan istifadə edilmişdir. Nümunələr C18 ön kolonunda tutulmuş, sonra daxili diametri 50 µm olan analitik kolonda 200 nL/min axın sürətində və 40°C-də ayrılmışdır. Qradiyent 60 dəqiqə ərzində aşağı üzvi həlledici tərkibindən 35% B həlledicisinə qədər dəyişmiş, ardınca yüksək üzvi həlledici tərkibi ilə yuma və yenidən tarazlaşdırma aparılmışdır. MS məlumatlarının toplanması müsbət ion rejimində, daha yüksək enerjili toqquşma dissosiasiyası ilə məlumatdan asılı olmayan toplama üsulundan istifadə edilərək aparılmışdır. İlkin DIA faylları in silico proqnozlaşdırılmış spektral kitabxana ilə DIA-NN 1.8 istifadə edilərək analiz edilmişdir.
Yüksək nümunə emalı məhsuldarlığı ilə zülal ekstraksiyası 96 yuvalı plaka ultrasəs cihazı UIP400MTP vasitəsilə
Tez-tez verilən suallar
Shotgun proteomikasında mikroplakaların ultrasəslə işlənməsindən ən çox kim faydalanır?
Mikroplakaların ultrasəslə işlənməsi çoxsaylı nümunələri paralel emal edən proteomika laboratoriyaları, o cümlədən mərkəzi xidmət laboratoriyaları, proteom tədqiqat qrupları, immunologiya laboratoriyaları, translyasion tədqiqat komandaları və daha yüksək nümunə emalı məhsuldarlığına malik LC-MS/MS iş axınlarına keçən həyat elmləri laboratoriyaları üçün xüsusilə faydalıdır. Bu, nümunələr arasında təkrarlanabilirlik həlledici olduqda xüsusilə aktualdır.
Niyə ənənəvi zondlu ultrasəs cihazı əvəzinə UIP400MTP istifadə edilməlidir?
Ənənəvi zondlu ultrasəs cihazı adətən nümunələri bir-bir işləyir və nümunələr arasında daşınmanı azaltmaq üçün diqqətlə təmizlənmə tələb edir. Mikroplaka ultrasəs cihazlarının UIP400MTP və UIP550MTP modelləri plaka əsaslı və ya kiçik həcmli formatda paralel ultrasəslə işləməni dəstəkləyərək əl əməliyyatlarını azaltmağa, emalın eyniliyini yaxşılaşdırmağa və çoxsaylı nümunələrin hazırlanmasını sadələşdirməyə kömək edir. Onlar həmçinin avtomatlaşdırılmış iş axınlarına asan inteqrasiyaya imkan verir.
Shotgun proteomikası iş axınında ultrasəslə işləmə hansı mərhələdə tətbiq olunur?
Ultrasəslə işləmə adətən proteolitik parçalanmadan əvvəlki nümunə hazırlığı mərhələsində tətbiq edilir. O, tripsin, Lys-C və ya tripsin/Lys-C qarışığı ilə fermentativ parçalanmadan əvvəl parçalama, ekstraksiya, homogenləşmə və yenidən həll etməni dəstəkləyə bilər.
Bundan əlavə, zülalların fermentativ parçalanmasını əhəmiyyətli dərəcədə sürətləndirmək üçün ultrasəslə işləmə parçalanma zamanı da tətbiq edilə bilər. Sürətli proteomik iş axını üçün ultrasəslə işləmə vasitəsilə yüksək nümunə emalı məhsuldarlığı ilə zülal parçalanmasının potensialını kəşf edin!
Mikroplakaların ultrasəslə işlənməsi hüceyrəxarici vezikul proteomikası üçün faydalıdırmı?
Bəli. Hüceyrəxarici vezikullar lipidlərlə zəngin, membranla əhatə olunmuş hissəciklərdir və onları təkrarlana bilən şəkildə işləmək çətin ola bilər. İstinad edilən PLA2G12A tədqiqatlarında EV nümunələri metanolla işlənmiş, UIP400MTP ilə ultrasəslə işlənmiş, qurudulmuş, tripsin/Lys-C ilə proteolitik parçalanmış və nano-LC/MS/MS vasitəsilə analiz edilmişdir.
Hansı nümunə növləri mikroplakaların ultrasəslə işlənməsindən faydalana bilər?
Mikroplakaların ultrasəslə işlənməsi hüceyrə lizatları, orqanel fraksiyaları, immunopresipitatlar, zülal aqreqatları, membranlarla zəngin nümunələr, hüceyrəxarici vezikullar və digər kiçik həcmli bioloji preparatlar üçün faydalı ola bilər. Hər nümunə növü üçün ultrasəslə işləmənin intensivliyi və müddəti, həlledici şəraiti, başlanğıc materialın miqdarı və proteolitik parçalanma strategiyası optimallaşdırılmalıdır.
Ultrasəslə işləmə fermentativ parçalanmanı əvəz edirmi?
Xeyr. Ultrasəslə işləmə parçalama, ekstraksiya və ya yenidən həll etməni yaxşılaşdırmaqla nümunəni proteolitik parçalanmaya hazırlamağa kömək edir. Aşağıdan yuxarıya shotgun proteomikası üçün peptidlərin əldə edilməsində proteolitik parçalanma yenə də tələb olunur.
Proteomik iş axınlarında ultrasəslə sürətləndirilən zülal parçalanması haqqında daha ətraflı oxuyun!
UIP400MTP az miqdarda başlanğıc materialla proteomika üçün uyğundurmu?
Bəli, mikroplaka formatı nümunənin qorunmasının və eyni qaydada işlənməsinin vacib olduğu kiçik həcmli iş axınları üçün çox uyğundur. Dərc olunmuş EV iş axınında proteomika üçün hazırlıq 5 µg zülal-ekvivalentli EV başlanğıc materialı ilə aparılmışdır.
Mikroplakaların ultrasəslə işlənməsi təkrarlanabilirliyi yaxşılaşdıra bilərmi?
Hielscher ultrasəs cihazları çoxsaylı nümunələrə standartlaşdırılmış ultrasəslə işləmə şəraiti tətbiq etməklə təkrarlanabilirliyi dəstəkləyir. Lakin hüceyrələrin və ya EV-lərin təcrid edilməsi, başlanğıc materialın normallaşdırılması, proteolitik parçalanmanın səmərəliliyi, LC-MS/MS sabitliyi, məlumatların emalı və statistik analiz kimi digər amillər də proteomikanın ümumi təkrarlanabilirliyinə töhfə verir.
Mikroplakaların ultrasəslə işlənməsi zülal identifikasiyasının dərinliyini artırırmı?
Nümunənin parçalanması və ya yenidən həll edilməsi məhdudlaşdırıcı amil olduqda, bu üsul identifikasiya dərinliyinin yaxşılaşmasına töhfə verə bilər. Təsir nümunə növündən, zülal kimyasından, təmizləmə strategiyasından, proteolitik parçalanma şəraitindən və LC-MS/MS metodunun göstəricilərindən asılıdır.
İş axınını rutin şəkildə istifadə etməzdən əvvəl nə optimallaşdırılmalıdır?
Əsas parametrlərə başlanğıc nümunənin miqdarı, bufer və ya həlledici tərkibi, plaka formatı, ultrasəs amplitudası və müddəti, qurutma şəraiti, proteolitik parçalanma həcmi, ferment konsentrasiyası, inkubasiya müddəti və LC-MS/MS inyeksiya miqdarı daxildir. İş axınını tam eksperimental dəstə tətbiq etməzdən əvvəl ilkin sınaqların aparılması tövsiyə olunur.
Bu iş axını DIA proteomikası ilə istifadə edilə bilərmi?
Bəli. İstinad edilən EV iş axınında məlumatdan asılı olmayan toplama və ardınca DIA-NN analizi istifadə edilmişdir. Mikroplakaların ultrasəslə işlənməsi ilkin nümunə hazırlığı prosesinin bir hissəsidir və DIA, DDA və ya hədəfli proteomika metodları ilə inteqrasiya edilə bilər.
Hansı keyfiyyətə nəzarət göstəriciləri izlənməlidir?
Tövsiyə olunan QC göstəricilərinə peptid çıxımı, identifikasiya edilmiş peptidlərin və zülal qruplarının sayı, baş verməmiş kəsilmələrin nisbəti, peptid uzunluğunun paylanması, xromatoqrafik pik forması, tutulma vaxtının sabitliyi, təkrarların variasiya əmsalı, daşınma və bioloji qrupların PCA və ya əlaqəli metodlarla ayrılması daxildir.
Mikroplaka ultrasəs cihazlarının UIP400MTP və ya UIP550MTP modellərinin proteomik nümunə hazırlığına inteqrasiyasının əsas üstünlüyü nədir?
Əsas üstünlük kiçik həcmli nümunələrin standartlaşdırılmış, paralel emalıdır. Bu, laboratoriyalara əl əməliyyatlarından yaranan dəyişkənliyi azaltmağa və mürəkkəb bioloji nümunələri proteolitik parçalanma, LC-MS/MS məlumatlarının toplanması və kəmiyyət proteomik analizi üçün daha eyni qaydada hazırlamağa kömək edir.
Hielscher mikroplaka ultrasəs cihazları avtomatlaşdırılmış iş axınlarına problemsiz inteqrasiya edilə bilər.
Ədəbiyyat / İstinadlar
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for “Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles”. Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Hielscher Ultrasonics yüksək performanslı ultrasəs homogenizatorlarını laboratoriya ölçülərindən başlayaraq sənaye ölçülərinədək istehsal edir.