Şiş toxumasından sonikasiya ilə zülal çıxarılması – protokol
Bu protokol, toxuma parçalanması zamanı nəzarətli zond-sonikasiya addımı əlavə etməklə standart CPTAC sidik cövhəri lizisi iş axınını inkişaf etdirən şiş toxuması üçün ultrasəslə dəstəklənən zülal ekstraksiyası metodunu təsvir edir. Qurulmuş dərin miqyaslı CPTAC proteom və fosfoproteom hazırlama strategiyasına əsaslanaraq, bu modifikasiya hüceyrə və subhüceyrə strukturunun pozulmasını yaxşılaşdırır, nümunənin özlülüyünü azaldır və adətən yalnız sidik cövhəri lizisi ilə bərpası daha çətin olan zülalların, xüsusən də membranla əlaqəli və DNT-yə bağlanan və ya nüvə ilə əlaqəli zülalların sərbəst buraxılmasını artırır. Əsas tədqiqatda, ultrasəslə dəstəklənən iş axını, aşağı axın CPTAC tipli həzm, TMT etiketləmə, fraksiyalaşdırma, fosfopeptid zənginləşdirmə və LC-MS/MS analiz boru kəməri ilə uyğunluğu qoruyarkən həm zülalların, həm də fosfopeptidlərin aşkarlanmasını artırdı.
Dərin Proteomik və Fosfoproteomik Analiz üçün Şiş Toxumasından Sonication ilə Zülal Ekstraksiyası
The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.
ultrasəs zondu UP200St proteomikada zülal çıxarılması üçün
Protokolun Tətbiq Sahəsi
Bu proseduru aşağıdakılar üçün istifadə edin:
- təzə dondurulmuş, kriopulverizasiya olunmuş şiş toxuması
- karbamid əsaslı ekstraksiyanın artıq müəyyən edildiyi hüceyrə qranulları və ya digər bioloji nümunələr
- Triptik həzm və isteğe bağlı TMT etiketləməsindən istifadə edərək qlobal proteomika və fosfoproteomika iş axınları
Li və digərlərinin (2025) tədqiqatında iş axınının hüceyrə xətləri, qan və sidik kimi digər nümunə növlərinə də tətbiq olunduğu bildirilir, lakin nümunə növünə görə optimallaşdırma tələb oluna bilər.
Tətbiq edilmiş sonication addımı ilə optimallaşdırılmış nümunə hazırlama iş axını. Optimallaşdırılmış iş axını və eksperimental dizayn qlobal proteomik və fosfoproteomik analiz üçün CPTAC nümunə hazırlama protokoluna əsaslanır.
Tədqiqat və sxem: ©Li və digərləri, 2025
İş prinsipi
Orijinal tədqiqat standart CPTAC karbamid lizisi iş axınına sonikasiya əlavə etdi və membranlar və nüvələrlə əlaqəli zülalların daha yaxşı aşkarlanmasını aşkar etdi. Müəlliflər bildirirlər ki, sonikasiya parametrləri nümunə ölçüsü/konsentrasiyası ilə bağlı dəqiq tənzimlənməlidir. – sonotrode ölçüsünü, enerji girişini və impuls vaxtını seçməklə.
Nümunə olaraq, Hielscher UP200Ht və UP200St üçün bu o deməkdir:
- əsas idarəetmə dəyişənləri kimi amplituda və impuls rejimindən istifadə edin
- nümunələri soyuqda (yəni buz üzərində) saxlayın
- mühafizəkar şəraitdən başlayın
- nümunənin şəffaflığına, temperaturuna, zülal məhsuldarlığına və sonrakı peptid keyfiyyətinə qarşı optimallaşdırın
Hər iki Hielscher 200 vattlıq sonikator modelləri UP200Ht və UP200St tənzimlənən amplituda və impuls parametrləri ilə kiçik və orta nümunə həcmləri üçün nəzərdə tutulmuşdur; hər iki ultrasəs homogenizatoru dəqiq parametr tənzimlənməsi, avtomatlaşdırılmış məlumatların qeyd edilməsi, qoşula bilən temperatur sensoru, uzaqdan idarəetmə, nümunə işıqlandırması üçün rəqəmsal sensor ekran idarəetməsini təmin edir.
Sonikasiya ilə Yardımlı Zülal Ekstraksiyası üçün Reagentlər
Karbamid lizisi buferi
İstifadədən dərhal əvvəl təzə hazırlayın:
- 8 M karbamid
- 75 mM NaCl
- 50 mM Tris, pH 8.0
- 1 mM EDTA
- 2 µq/ml aprotinin
- 10 µq/ml leupeptin
- 1 mM PMSF
- 10 mM NaF
- 20 µM PUGNAc
- Fosfataza İnhibitor Kokteyli 2, 1:100 (v/v)
- Fosfataza İnhibitor Kokteyli 3, 1:100 (v/v)
Karbamid qatqılar əlavə etməzdən əvvəl tamamilə həll olunmalıdır; inhibitorlar istifadədən dərhal əvvəl əlavə edilməlidir; bufer buz üzərində saxlanılmalıdır; və qatqılar əlavə etdikdən sonra güclü vorteksləmə əvəzinə burulma tövsiyə olunur.
Əlavə reagentlər:
- BCA protein analiz reagentləri
- 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
- DTT
- Yodoasetamid
- LysC
- tripsin
- Qarışqa turşusu
- Əgər multipleksləşdirilmiş kəmiyyət proteomikasından istifadə olunursa, TMT reagentləri
- IMAC reagentləri, əgər fosfopeptid zənginləşdirməsi aparılırsa
Mikrotipli S26d2 ultrasəs cihazı UP200Ht nümunə hazırlanması üçün
Sonication ilə Zülal Ekstraktı üçün Avadanlıq
Tələb olunur
Tövsiyə olunan zond seçimi
200–1000 µL ətrafındakı nümunələr üçün kiçik həcmlərin birbaşa yüksək intensivlikli emalı üçün uyğun kiçik diametrli sonotroddan istifadə edin. Hielscher birdən çox sonotrod diametri təklif edir və daha kiçik uc diametrləri ucunda daha yüksək intensivlik təmin edir.
Praktik qeyd: Həddindən artıq köpüklənmə və ya damar divarına toxunmadan səmərəli qarışdırma təmin edən ən kiçik zonddan istifadə edin.
Eyni anda birdən çox nümunə ilə işləsəniz, nəzərə ala bilərsiniz Çoxborulu Sonicator VialTweeter və ya Mikroplitə Sonicator UIP400MTP!
Addım-addım təlimatlar: Sonication ilə Zülalın Ekstraksiyası Proseduru
A. Əvvəlcədən soyudun və hazırlayın
- Santrifüjü 4°C-yə qədər soyudun.
- Təzə sidik cövhəri lizisi buferini hazırlayın və buzun üzərində saxlayın.
- UP200Ht və ya UP200St-i səs korpusunun içərisindəki stendə quraşdırın.
- Nümunə borularını dik və sabit saxlamaq üçün kifayət qədər böyük bir buz vannası hazırlayın.
Təzə buferin hazırlanması və soyuq saxlanması vacibdir.
B. İlkin Karbamid Ekstraktı
- Dondurulmuş toxumanı buzun üzərində saxlayın.
- Hər 50 mq yaş toxumaya 200 µL soyudulmuş karbamid lizisi buferi əlavə edin.
- Yüksək sürətlə 5–10 saniyə burulğan.
- 4°C-də 15 dəqiqə inkubasiya edin.
- Burulğan-üstəgəl-inkubasiya addımını bir daha təkrarlayın.
- 20000 q-da 4°C-də 10 dəqiqə ərzində santrifüj edin.
- Lizat/supernatanı təmiz, aşağı bağlayıcılı boruya köçürün.
C. UP200Ht və ya UP200St istifadə edərək sonikasiya
Sonication üçün başlanğıc şərtləri
- Amplituda: 20–30%-dən başlayır
- İmpuls uzunluğu: 5 saniyə aktivdir
- Soyutma: Zərbələr arasında buz üzərində 2 dəqiqə
- Dövrlərin sayı: 4 dövr
- Ümumi aktiv sonikasiya müddəti: 20 s
- Soyutma daxil olmaqla ümumi proses müddəti: təxminən 8-10 dəqiqə
Sonication addımları
- Lizatı ultrasəs müayinəsi üçün uyğun bir boruya köçürün. Yaxşı istilik mübadiləsinə və təhlükəsiz zond batırılmasına imkan verən dar, nazik divarlı bir borudan istifadə edin.
- Borunu buzlu vannaya qoyun. Məqalədə ultrasəslə soyutmanın istilik zədələnməsinin qarşısını almaq üçün vacib olduğu müəyyən edilmişdir.
- Zond ucunu nümunəyə batırın. Sabit kavitasiya üçün ucunu kifayət qədər suya batırın, lakin borunun divarına və ya dibinə toxunmasına icazə verməyin.
- Başlanğıc amplitudasında 5 saniyəlik bir impuls işə salın.
- Nümunəni dərhal 2 dəqiqə ərzində tamamilə buzun içinə qaytarın.
- 4 dövr tamamlanana qədər təkrarlayın.
- Lizatı dövrədən sonra yoxlayın.
- Yalnız lazım olduqda, hər dəfə əlavə 5 saniyəlik bir impuls istifadə edərək davam edin və həmişə tam soyumağa davam edin.
- Lizat daha vahid və daha az lifli/özlü olduqda dayandırın.
Son nöqtə, davamlı özlülük axını əvəzinə damcılar əmələ gətirən daha şəffaf bir lizatdır. - Təxminən 16000 q-da 4°C-də 15 dəqiqə ərzində santrifüj edin.
- Şəffaflaşdırılmış supernatantı təzə bir boruya köçürün və zülal konsentrasiyasını ölçün.
Sonikasiya edilmiş və qeyri-sonikasiya edilmiş nümunələr arasında qlobal proteomika və fosfoproteomikanın müqayisəsi.
a. Sonication ilə və ya onsuz bütün PDX şiş toxumalarında müəyyən edilmiş zülalların sayı (qlobal proteomika). b. Sonication ilə və ya onsuz bütün PDX şiş toxumalarında müəyyən edilmiş fosfopeptidlərin sayı (IMAC zənginləşdirilməsi). Yalnız bolluq nisbəti 25-ci persentildən çox və ya bərabər olan zülallar və fosfopeptidlər sayıldı. Bolluq nisbəti eyni növ nümunələr arasında hesablandı.
Tədqiqat və qrafiklər: ©Li və digərləri, 2025
Aşağı axın həzmi və təhlili
Sonication və aydınlaşdırmadan sonra, orijinal CPTAC stilində iş axınında təsvir edildiyi kimi davam edin:
- Karbamidi azaltmaq üçün lizatı 1:3 (h/h) nisbətində 50 mM Tris-HCl pH 8.0 ilə durulaşdırın <2 M.
- 50 µq zülala 1 mAU nisbətində LysC əlavə edin və 25°C-də 2 saat inkubasiya edin.
- 1:49 nisbətində tripsin ferment substratını (ç/ç) əlavə edin və 25°C-də bir gecə həzm edin.
- Qarışqa turşusu ilə 1%-ə qədər soyudun.
- Lazım olduqda duzsuzlaşdırma, TMT etiketləmə, fraksiyalaşdırma, fosfopeptid zənginləşdirmə və LC-MS/MS-ə davam edin.
TMT ilə işarələnmiş MS-dən fosfopeptidlərin diferensial ifadəsi.
a. Bəzi insan fosfopeptidlərini (zülal ardıcıllığının başlanğıcı və sonu) səssiz nümunələrlə müqayisədə artıran bazal alt tip. b. Bəzi insan fosfopeptidlərini (zülal ardıcıllığının başlanğıcı və sonu) səssiz nümunələrlə müqayisədə artıran lüminal alt tip. c. Şişlərin ultrasəslə bazal alt tipində artırılmış fosfopeptidlərin zülallarına əsaslanan zənginləşdirilmiş KEGG yolları. d. Şişlərin ultrasəslə lüminal alt tipində artırılmış fosfopeptidlərin zülallarına əsaslanan zənginləşdirilmiş KEGG yolları.
Tədqiqat və qrafiklər: ©Li və digərləri, 2025
Dizayn, İstehsalat və Konsaltinq – Keyfiyyətli Almaniya istehsalı
Hielscher ultrasəs cihazları ən yüksək keyfiyyət və dizayn standartları ilə tanınır. Sağlamlıq və asan əməliyyat ultrasəs aparatlarımızın sənaye obyektlərinə rahat inteqrasiyasına imkan verir. Kobud şərtlər və tələbkar mühitlər Hielscher ultrasəs cihazları tərəfindən asanlıqla idarə olunur.
Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikatlı bir şirkətdir və ən müasir texnologiya və istifadəçi dostu olan yüksək performanslı ultrasəs cihazlarına xüsusi diqqət yetirir. Əlbəttə ki, Hielscher ultrasəs cihazları CE-yə uyğundur və UL, CSA və RoHs tələblərinə cavab verir.
Çox quyulu boşqab sonikatoru UIP400MTP nümunələrdən yüksək məhsuldarlıqlı zülal çıxarılması üçün
Ədəbiyyat / İstinadlar
- Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
- Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
- Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.
Tez-tez soruşulan suallar
Bitki toxumasından zülal çıxarılması ilə məməli toxuması arasındakı fərq nədir?
Bitki toxumasından zülal çıxarılması, adətən, məməli toxumasından daha çətindir, çünki bitki hüceyrələrində sellüloza ilə zəngin sərt hüceyrə divarı, bol polisaxaridlər, fenolik birləşmələr, piqmentlər və zülalın həll olunmasına mane ola bilən, ekstraktları çirkləndirə bilən və ya zülalın parçalanmasını təşviq edə bilən aktiv endogen fermentlər var. Bunun əksinə olaraq, məməli toxumasında hüceyrə divarı yoxdur və ümumiyyətlə kimyəvi cəhətdən parçalanması daha asandır, baxmayaraq ki, tərkibində tez-tez daha çox lipid, hüceyrədənkənar matris və ekstraktı çətinləşdirə bilən proteazlar olur. Nəticədə, bitki protokolları adətən daha güclü mexaniki parçalanma, aşağı temperaturda üyüdülmə və PVPP, reduksiyaedici maddələr və ya fenol əsaslı təmizləmə kimi əlavələr tələb edir, məməli toxuması isə daha çox RIPA və ya karbamid əsaslı lizis sistemləri kimi yuyucu əsaslı buferlərlə uğurla işlənir. Həm bitki, həm də məməli toxuması ultrasəslə səmərəli şəkildə lizis edilə bilər!
RIPA Buferindən istifadə edərək toxumadan zülal çıxarılmasını necə yaxşılaşdırmaq olar?
RIPA buferi ilə toxumadan zülalın çıxarılması həm parçalanmanı, həm də nümunənin qorunmasını optimallaşdırmaqla yaxşılaşdırıla bilər. Ən vacib tədbirlər toxumanı və buferi soyuq saxlamaq, təzə hazırlanmış proteaza və fosfataza inhibitorlarından istifadə etmək, lizisdən əvvəl toxumanı yaxşıca üyütmək və ya əzmək, müvafiq bufer-toxuma nisbətini qorumaq və sıx toxumanı parçalamaq və özlülüyü azaltmaq üçün homogenizasiya və ya qısa zond sonikasiyası kimi mexaniki parçalanma addımı əlavə etməkdir. Lizatlar fasiləli qarışdırma ilə buz üzərində inkubasiya edildikdə və ardınca həll olunmayan qalıqları təmizləmək üçün yüksək sürətli soyuducu santrifüqasiya edildikdə ekstraksiya səmərəliliyi də artır. Lifli, lipidlə zəngin və ya yüksək strukturlu toxumalar üçün ekstraksiyanı bir dəfə təkrarlamaq və ya yuyucu vasitənin təsir müddətini artırmaq bərpanı yaxşılaşdıra bilər, lakin həddindən artıq sonikasiya və ya otaq temperaturunda uzun müddətli istifadədən çəkinmək lazımdır, çünki onlar zülalları denaturasiya edə və ya proteolizi artıra bilər.
Ultrasonik Zülal Ekstraksiyası zamanı hansı təhlükəsizlik tələblərinə riayət edilməlidir?
Zond sonikasiyasını səs qoruyucu qutuda və ya uyğun eşitmə qoruyucusu ilə həyata keçirin. Mənbə protokolu, sonikasiya zamanı yaranan zərərli səs-küy barədə xüsusi xəbərdarlıq edir.
Göz qoruyucusu, laboratoriya xalat və əlcək geyin.
Zondu dəridən uzaq tutun və sıçramadan qorunma olmadan açıq bir qabı ultrasəslə cilalamayın.
PMSF və digər inhibitorlarla yerli kimyəvi təhlükəsizlik qaydalarına uyğun olaraq davranın.
İstilikdən qaynaqlanan zülal zərərini azaltmaq üçün nümunələri buz üzərində saxlayın; məqalədə temperatur nəzarətinin vacib olduğu dəfələrlə qeyd olunur.
VialTweeter Sonicatoru proteomikada zülal çıxarılmasını sürətləndirir və yaxşılaşdırır
Hielscher Ultrasonics yüksək performanslı ultrasəs homogenizatorları istehsal edir laboratoriya üçün sənaye ölçüsü.