Şiş toxumasından sonikasiya ilə dəstəklənən zülal ekstraksiyası – Protokol

Bu protokol toxumanın parçalanması zamanı nəzarət olunan zondla sonikasiya mərhələsi əlavə etməklə standart CPTAC karbamidlə lizis iş axınını təkmilləşdirən, şiş toxumasından sonikasiya ilə dəstəklənən zülal ekstraksiyası üsulunu təsvir edir. Formalaşmış geniş əhatəli CPTAC proteom və fosfoproteom hazırlama strategiyasına əsaslanan bu dəyişiklik hüceyrələrin və subhüceyrə strukturlarının parçalanmasını yaxşılaşdırır, nümunənin özlülüyünü azaldır və adətən yalnız karbamidlə lizis vasitəsilə əldə edilməsi daha çətin olan zülalların, xüsusilə membrana bağlı və DNT-yə bağlanan və ya nüvə ilə əlaqəli zülalların ayrılmasını artırır. Əsas götürülən tədqiqatda sonikasiya ilə dəstəklənən iş axını həm zülalların, həm də fosfopeptidlərin aşkarlanmasını artırmış, eyni zamanda sonrakı CPTAC tipli həzm, TMT ilə nişanlama, fraksiyalaşdırma, fosfopeptidlərin zənginləşdirilməsi və LC-MS/MS analiz ardıcıllığı ilə uyğunluğu qorumuşdur.

Dərin proteomik və fosfoproteomik analiz üçün şiş toxumasından sonikasiya ilə dəstəklənən zülal ekstraksiyası

Aşağıdakı protokol kriogen şəraitdə toz halına salınmış şiş toxumasından 8 M karbamidli lizis buferində zülalların ekstraksiyası üçün optimallaşdırılmışdır: əlavə edilən zond tipli sonikasiya mərhələsi həzmdən və sonrakı LC-MS/MS analizindən əvvəl çətin əldə edilən zülal siniflərinin, xüsusilə membranla və DNT/nüvə ilə əlaqəli zülalların əldə edilməsini yaxşılaşdırır. Li et al. (2025) tərəfindən aparılmış əsas tədqiqatda sonikasiyanın əlavə edilməsi membran və nüvə ilə əlaqəli zülalların aşkarlanmasını artırmış və onların iş axınında >12.000 zülal və >25.000 fosfopeptidin geniş əhatəli təhlilini dəstəkləmişdir.

Protokolun tətbiq sahəsi

Bu proseduru aşağıdakılar üçün istifadə edin:

• təzə halda dondurulmuş, kriogen şəraitdə toz halına salınmış şiş toxuması
• karbamid əsaslı ekstraksiyanın artıq tətbiq olunduğu hüceyrə çöküntüləri və ya digər bioloji nümunələr
• tripsinlə həzm və istəyə bağlı TMT ilə nişanlama tətbiq olunan qlobal proteomika və fosfoproteomika iş axınları

Li et al. (2025) tərəfindən aparılmış tədqiqatda bu iş axınının hüceyrə xətləri, qan və sidik kimi digər nümunə növlərinə də tətbiq oluna bildiyi bildirilir, lakin nümunə növündən asılı olaraq optimallaşdırma tələb oluna bilər.

Sonikasiya mərhələsi daxil edilmiş optimallaşdırılmış nümunə hazırlama iş axını. Optimallaşdırılmış iş axını və eksperimental dizayn qlobal proteomik və fosfoproteomik analiz üçün CPTAC nümunə hazırlama protokoluna əsaslanır.
Tədqiqat və sxem: ©Li et al., 2025

İş prinsipi

İlkin tədqiqatda standart CPTAC karbamidlə lizis iş axınına sonikasiya əlavə edilmiş və membranlar və nüvələrlə əlaqəli zülalların aşkarlanmasının yaxşılaşdığı müəyyən olunmuşdur. Müəlliflər bildirirlər ki, sonikasiya parametrləri nümunənin ölçüsünə/konsentrasiyasına uyğun olaraq dəqiq tənzimlənməlidir – bunun üçün sonotrodun ölçüsü, verilən enerji və impulsların vaxt parametrləri seçilməlidir.

Məsələn, Hielscher UP200Ht və UP200St üçün bu, aşağıdakıları nəzərdə tutur:

• əsas idarəetmə dəyişənləri kimi amplituddan və impuls rejimindən istifadə edin
• nümunələri bütün müddət ərzində soyuq saxlayın (yəni buz üzərində)
• ehtiyatlı başlanğıc parametrləri ilə başlayın
• nümunənin şəffaflığına, temperaturuna, zülal çıxımına və sonrakı mərhələdə peptidlərin keyfiyyətinə görə optimallaşdırın

 
Hielscher şirkətinin 200 vatt gücündə olan hər iki sonikator modeli, UP200Ht və UP200St, tənzimlənən amplitud və impuls parametrləri ilə kiçik və orta həcmli nümunələr üçün nəzərdə tutulmuşdur; hər iki ultrasəs homogenizatoru parametrlərin dəqiq tənzimlənməsi üçün rəqəmsal sensor ekranlı idarəetmə, avtomatik məlumat qeydi, qoşula bilən temperatur sensoru, uzaqdan idarəetmə və nümunənin işıqlandırılması imkanlarını təmin edir.
 

Sonikasiya ilə dəstəklənən zülal ekstraksiyası üçün reagentlər

Karbamidli lizis buferi

İstifadədən dərhal əvvəl təzə hazırlayın:

• 8 M karbamid
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinin
• 10 µg/mL leupeptin
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Fosfataza inhibitorları kokteyli 2, 1:100 (v/v)
• Fosfataza inhibitorları kokteyli 3, 1:100 (v/v)

Əlavələr daxil edilməzdən əvvəl karbamid tam həll edilməlidir; inhibitorlar istifadədən dərhal əvvəl əlavə olunmalıdır; bufer buz üzərində saxlanmalıdır; əlavələr daxil edildikdən sonra isə güclü vorteks qarışdırılması əvəzinə dairəvi hərəkətlərlə yüngül qarışdırma tövsiyə olunur.
 

Əlavə reagentlər:

• BCA zülal təyini reagentləri
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Yodoasetamid
• LysC
• Tripsin
• Qarışqa turşusu
• Multipleks kəmiyyət proteomikası istifadə olunursa, TMT reagentləri
• Fosfopeptidlərin zənginləşdirilməsi aparılırsa, IMAC reagentləri

Sonikasiya ilə dəstəklənən zülal ekstraksiyası üçün avadanlıq

Tələb olunanlar

Tövsiyə olunan zond seçimi

Təxminən 200–1000 µL həcmli nümunələr üçün kiçik həcmlərin birbaşa yüksək intensivliklə emalına uyğun kiçik diametrli sonotroddan istifadə edin. Hielscher müxtəlif diametrli sonotrodlar təklif edir və daha kiçik ucluq diametrləri ucluqda daha yüksək intensivlik təmin edir.

Praktik qeyd: həddindən artıq köpüklənmə və ya qabın divarına toxunma olmadan səmərəli qarışdırma təmin edən ən kiçik zonddan istifadə edin.

Eyni vaxtda bir neçə nümunə ilə işləyirsinizsə, aşağıdakı cihazları nəzərdən keçirə bilərsiniz: çoxborulu VialTweeter sonikatoru və ya mikroplitə sonikatoru UIP400MTP!

Addım-addım təlimatlar: sonikasiya ilə dəstəklənən zülal ekstraksiyası proseduru

A. Əvvəlcədən soyutma və hazırlama

1. Sentrifuqanı 4°C-yə qədər soyudun.
2. Təzə karbamidli lizis buferi hazırlayın və onu buz üzərində saxlayın.
3. UP200Ht və ya UP200St cihazını səsizolyasiya örtüyünün daxilində ştativ üzərində quraşdırın.
4. Nümunə borularını şaquli və sabit vəziyyətdə saxlamaq üçün kifayət qədər böyük buz vannası hazırlayın.

Buferin təzə hazırlanması və nümunələrlə soyuq şəraitdə işlənməsi kritik əhəmiyyət daşıyır.

B. Karbamidlə ilkin ekstraksiya

1. Kriogen şəraitdə toz halına salınmış toxumanı buz üzərində saxlayın.
2. Hər 50 mg yaş toxumaya 200 µL soyudulmuş karbamidli lizis buferi əlavə edin.
3. Yüksək sürətlə 5–10 s vortekslə qarışdırın.
4. 4°C-də 15 min inkubasiya edin.
5. Vortekslə qarışdırma və inkubasiya mərhələsini bir dəfə də təkrarlayın.
6. 4°C-də 20.000g ilə 10 min sentrifuqalayın.
7. Lizatı/supernatantı təmiz, zülalları az adsorbsiya edən boruya köçürün.

C. UP200Ht və ya UP200St istifadə etməklə sonikasiya

Sonikasiya üçün başlanğıc şərtləri

• Amplitud: 20–30% ilə başlayın
• İmpulsun müddəti: 5 s aktiv
• Soyutma: impulslar arasında buz üzərində 2 min
• Dövrlərin sayı: 4 dövr
• Ümumi aktiv sonikasiya müddəti: 20 s
• Soyutma daxil olmaqla ümumi proses müddəti: təxminən 8–10 min

Sonikasiya mərhələləri

1. Lizatı sonikasiya üçün uyğun boruya köçürün. Yaxşı istilik mübadiləsini və zondun təhlükəsiz daldırılmasını təmin edən dar, nazik divarlı borudan istifadə edin.
2. Borunu buz vannasına yerləşdirin. Məqalədə istilik zədələnməsinin qarşısını almaq üçün sonikasiya zamanı soyutmanın kritik əhəmiyyət daşıdığı qeyd olunur.
3. Zondun ucluğunu nümunəyə daldırın. Sabit kavitasiya üçün ucluğu kifayət qədər dərinlikdə maye daxilində saxlayın, lakin onun borunun divarına və ya dibinə toxunmasına imkan verməyin.
4. Başlanğıc amplitudda bir 5 s impuls tətbiq edin.
5. Dərhal nümunəni tam şəkildə yenidən buz üzərinə qoyun və 2 min saxlayın.
6. 4 dövr tamamlanana qədər təkrarlayın.
7. Dövrdən sonra lizatı yoxlayın.
8. Yalnız ehtiyac olduqda davam edin, hər dəfə bir əlavə 5 s impuls tətbiq edin və hər impulsdan sonra mütləq tam soyutma aparın.
9. Lizat daha bircins olduqda və sapvari uzanması/özlülüyü azaldıqda dayandırın.
   Son nöqtə fasiləsiz özlü axın əvəzinə damcılar əmələ gətirən, daha yarımşəffaf lizatdır.
10. 4°C-də təxminən 16.000g ilə 15 min sentrifuqalayın.
11. Durulaşdırılmış supernatantı yeni boruya köçürün və zülal konsentrasiyasını ölçün.

Sonikasiya edilmiş və sonikasiya edilməmiş nümunələr arasında qlobal proteomika və fosfoproteomikanın müqayisəsi.
a. Sonikasiya tətbiq edilmiş və ya edilməmiş bütün PDX şiş toxumalarında müəyyən edilmiş zülalların sayı (qlobal proteomika). b. Sonikasiya tətbiq edilmiş və ya edilməmiş bütün PDX şiş toxumalarında müəyyən edilmiş fosfopeptidlərin sayı (IMAC ilə zənginləşdirmə). Yalnız bolluq nisbəti 25-ci persentilə bərabər və ya ondan böyük olan zülallar və fosfopeptidlər sayılmışdır. Bolluq nisbəti eyni növ nümunələr arasında hesablanmışdır.
Tədqiqat və qrafiklər: ©Li et al., 2025

Sonrakı həzm və analiz

Sonikasiya və durulaşdırmadan sonra ilkin CPTAC tipli iş axınında təsvir edildiyi kimi davam edin:

1. Karbamid konsentrasiyasını <2 M səviyyəsinə endirmək üçün lizatı 50 mM Tris-HCl pH 8,0 ilə 1:3 (v/v) nisbətində durulaşdırın.
2. Hər 50 µg zülala 1 mAU LysC əlavə edin və 25°C-də 2 h inkubasiya edin.
3. Tripsini 1:49 ferment:substrat (w/w) nisbətində əlavə edin və 25°C-də gecə boyu həzm edin.
4. Son konsentrasiya 1% olacaq şəkildə qarışqa turşusu əlavə edərək reaksiyanı dayandırın.
5. Tələb olunduğu kimi duzsuzlaşdırma, TMT ilə nişanlama, fraksiyalaşdırma, fosfopeptidlərin zənginləşdirilməsi və LC-MS/MS mərhələlərinə davam edin.

TMT ilə nişanlanmış MS analizində fosfopeptidlərin diferensial ekspressiyası.
a. Bazal alt tip: sonikasiya edilməmiş nümunələrlə müqayisədə sonikasiya edilmiş nümunələrdə ekspressiyası artmış bəzi insan fosfopeptidləri (protein-sequence başlanğıcı və sonu) göstərilir. b. Luminal alt tip: sonikasiya edilməmiş nümunələrlə müqayisədə sonikasiya edilmiş nümunələrdə ekspressiyası artmış bəzi insan fosfopeptidləri (protein_sequence başlanğıcı və sonu) göstərilir. c. Şişlərin sonikasiya edilmiş bazal alt tipində ekspressiyası artmış fosfopeptidlərin aid olduğu zülallar əsasında zənginləşmiş KEGG yolları. d. Şişlərin sonikasiya edilmiş luminal alt tipində ekspressiyası artmış fosfopeptidlərin aid olduğu zülallar əsasında zənginləşmiş KEGG yolları.
Tədqiqat və qrafiklər: ©Li et al., 2025

Layihələndirmə, istehsal və məsləhət xidmətləri – Almaniya istehsalı keyfiyyət

Hielscher ultrasəs cihazları ən yüksək keyfiyyət və dizayn standartları ilə tanınır. Möhkəmlik və asan istifadə ultrasəs cihazlarımızın sənaye müəssisələrinə rahat inteqrasiyasına imkan verir. Hielscher ultrasəs cihazları sərt şəraitdə və yüksək tələblər qoyan mühitlərdə asanlıqla işləyir.

Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatlı şirkətdir və ən müasir texnologiya və istifadə rahatlığı ilə seçilən yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs cihazlarına xüsusi diqqət yetirir. Əlbəttə, Hielscher ultrasəs cihazları CE tələblərinə uyğundur və UL, CSA və RoHs tələblərini qarşılayır.

Ədəbiyyat / İstinadlar

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.