Sonikasiya ilə xromatinin parçalanması

Xromatinin parçalanması bir çox epigenetika və molekulyar biologiya iş prosesində, xüsusilə xromatin immunopresipitasiyasında (ChIP), ChIP-seq və əlaqəli analizlərdə mühüm mərhələdir. Məqsəd epitopların bütövlüyünü qorumaq və nümunə itkisini minimuma endirməklə xromatini təkrarlana bilən DNT–zülal komplekslərinə parçalamaqdır. Mövcud üsullar arasında xromatinin ultrasəslə fraqmentasiyası geniş istifadə olunan yanaşmaya çevrilmişdir, çünki o, əla təkrarlanma qabiliyyəti ilə etibarlı, reagentsiz fraqmentasiya təmin edir.

Xromatini parçalayarkən nələri nəzərə almalıyam?

Xromatinin səmərəli parçalanması eksperimental parametrlərə diqqətlə nəzarət etməyi tələb edir. Düzgün aparılmayan fraqmentasiya həddindən artıq böyük, həddindən artıq deqradasiyaya uğramış və ya nümunələr arasında qeyri-bərabər fraqmentlər yaradaraq sonrakı ChIP təcrübələrinin nəticələrini poza bilər.
Ən mühüm amillərdən biri fraqment ölçülərinin arzu olunan paylanmasıdır. Əksər ChIP və ChIP-seq tətbiqləri üçün ölçüsü 100 ilə 600 əsas cütü arasında olan xromatin fraqmentləri optimaldır. Bu ölçü diapazonu genomun xəritələnməsi üçün kifayət qədər ayırdetmə qabiliyyəti təmin etməklə səmərəli immunopresipitasiyaya imkan verir.

Digər əsas amil sonikasiyadan əvvəl çarpaz bağlanmanın səmərəliliyidir. Əksər ChIP iş prosesləri zülal–DNT qarşılıqlı təsirlərini sabitləşdirmək üçün formaldehidlə fiksasiyanı əhatə edir. Lakin həddindən artıq çarpaz bağlanma xromatini fraqmentasiyaya qarşı daha davamlı edə bilər; bu isə daha uzun sonikasiya müddəti tələb edir və istiliyə məruzqalmanı potensial olaraq artırır.
Temperatura nəzarət də olduqca vacibdir. Sonikasiya nümunənin temperaturunu yüksəldə bilən lokal enerji yaradır. Yüksək temperaturlar DNT-ni zədələyə və ya zülalları denaturasiya edə bilər ki, bu da ChIP zamanı anticisimlərin tanımasına təsir göstərir. Buna görə bir çox tədqiqatçı nümunənin sabitliyini qorumaq üçün soyutma fasilələri ilə birləşdirilmiş impuls rejimli sonikasiya dövrləri tətbiq edir.
Nümunənin konsentrasiyası və həcmi də fraqmentasiyanın səmərəliliyinə təsir göstərir. Yüksək konsentrasiyalı xromatin suspenziyaları daha uzun sonikasiya müddəti tələb edə bilər, kiçik nümunə həcmləri isə həddindən artıq emalın qarşısını almaq üçün enerjinin dəqiq ötürülməsini tələb edir.
Nəhayət, sonikasiya cihazının seçimi təcrübələrin təkrarlanma qabiliyyətinə güclü təsir göstərir. Xromatinin parçalanması üçün nəzərdə tutulmuş cihazlar adətən nəzarət olunan ultrasəs enerjisi və standartlaşdırılmış nümunə emalı təmin edərək çoxsaylı nümunələrdə eyni cür fraqmentasiyaya imkan verir.

Xromatinin parçalanması üçün hansı sonikatoru seçməliyəm?

Müxtəlif laboratoriya iş prosesləri fərqli sonikasiya konfiqurasiyaları tələb edir. Optimal sistem əsasən nümunələrin emal məhsuldarlığından, həcmdən və eksperimental formatdan asılıdır.

Zond tipli sonikator

Zond tipli sonikator ultrasəs enerjisini titan zond vasitəsilə birbaşa nümunəyə ötürür. Bu konfiqurasiya çox yüksək enerji sıxlığı təmin edir və buna görə ayrı-ayrı nümunələrdə xromatinin güclü parçalanması üçün uyğundur.

Zondlu sonikatorlar xüsusilə aşağıdakılar üçün faydalıdır:

• Az və ya orta sayda nümunələr
• Fraqmentasiyası çətin olan xromatin
• Çevik eksperimental protokollar

Çoxsınaq şüşəli sonikator – VialTweeter

Eyni vaxtda çoxsaylı nümunələri emal edən laboratoriyalar üçün VialTweeter çoxsınaq şüşəli sonikator yüksək təkrarlanma qabiliyyətinə malik həll təmin edir. Sistem ultrasəs enerjisini flakon tutacağı vasitəsilə dolayı yolla ötürərək bir neçə qapalı sınaq şüşəsində fraqmentasiyanın eyni şəraitdə aparılmasına imkan verir.

Bu konfiqurasiya mühüm üstünlüklər təklif edir:

• Çoxsaylı nümunələrdə xromatinin paralel parçalanması
• Zondun çirklənməsinin aradan qaldırılması
• Sınaq şüşələri arasında yüksək təkrarlanma qabiliyyəti
• ChIP nümunələrinin hazırlanması üçün sadələşdirilmiş iş prosesi

Belə çoxsınaq şüşəli sistemlər rutin ChIP təcrübələri və orta emal məhsuldarlığı olan tədqiqatlar üçün çox uyğundur.
 

Mikrolövhə sonikatoru – UIP400MTP

Yüksək emal məhsuldarlığı olan epigenetika tədqiqatları getdikcə daha çox nümunələrin mikrolövhələrdə emalına əsaslanır. UIP400MTP mikrolövhə sonikatoru nümunələri köçürmədən xromatini birbaşa standart mikrolövhələrdə fraqmentləşdirmək üçün nəzərdə tutulmuşdur.

Bu yanaşma aşağıdakılara imkan verir:

• Onlarla və ya yüzlərlə nümunənin eyni vaxtda emalı
• Avtomatlaşdırma üçün əlverişli iş prosesləri
• Ultrasəs enerjisinin oyuqlar arasında bərabər paylanması
• Nümunələrlə işləmə mərhələlərinin sayının əhəmiyyətli dərəcədə azaldılması

Böyük ChIP-seq skrininq layihələri və ya yüksək emal məhsuldarlığı olan epigenetik tədqiqatlar üçün mikrolövhə sonikasiyası müstəsna miqyaslandırılma imkanı və səmərəlilik təmin edir. UIP400MTP çoxoyuqlu lövhə sonikatoru aşağıdakı tətbiq üçün çox uyğundur: maye ilə işləmə sistemlərinə və avtomatlaşdırılmış laboratoriya iş proseslərinə inteqrasiya.
 

Niyə xromatinin digər parçalanma üsulları əvəzinə sonikasiyanı seçmək lazımdır?

Fermentativ yanaşmalarla müqayisədə ChIP üçün sonikasiya qərəzsiz fraqmentasiya təmin edir, çünki proses ardıcıllığa spesifik ferment aktivliyindən asılı deyil. Bu, bərabər əhatələnmənin vacib olduğu genom miqyaslı epigenetik tədqiqatlar üçün xüsusilə mühümdür.
Digər mühüm üstünlük miqyaslandırılma imkanıdır. Ultrasəs sistemləri tək nümunələri, çoxsaylı sınaq şüşələrini və ya bütöv mikrolövhələri emal edə bilər və laboratoriyalara təcrübələrinin emal məhsuldarlığı üçün ən uyğun konfiqurasiyanı seçməyə imkan verir.
Nəhayət, sonikasiya fraqmentasiya parametrlərinə əla nəzarət təmin edir. İmpuls dövrlərini, müddəti və güc səviyyələrini tənzimləməklə tədqiqatçılar fraqment ölçülərinin arzu olunan paylanmasına etibarlı şəkildə nail ola bilərlər.

Ultrasəs fraqmentasiyasından sonra xromatin çıxımının miqdarını və keyfiyyətini necə qiymətləndirməliyəm?

ChIP üçün sonikasiyadan sonra tədqiqatçılar fraqmentləşdirilmiş xromatinin həm miqdarını, həm də keyfiyyətini qiymətləndirməlidirlər. Bu yoxlama mərhələsi xromatin fraqmentasiyasının ChIP-qPCR və ya ChIP-seq kimi sonrakı tətbiqlərin tələblərinə cavab verməsini təmin edir.
Miqdarın təyini adətən DNT konsentrasiyasının ölçülməsi ilə başlayır. Nanodrop analizi kimi spektrofotometrik üsullar və ya Qubit ilə DNT miqdarının təyini kimi flüorometrik analizlər çarpaz bağların açılmasından və təmizləmədən sonra xromatin çıxımının etibarlı qiymətləndirilməsini təmin edir.
Lakin təkcə DNT konsentrasiyası fraqmentasiyanın uğurlu olub-olmadığını göstərmir. Buna görə tədqiqatçılar elektroforetik üsullardan istifadə edərək fraqment ölçülərinin paylanmasını qiymətləndirirlər. Aqaroza gel elektroforezi DNT fraqmentlərinin vizuallaşdırılması və onların əksəriyyətinin hədəf ölçü diapazonuna düşdüyünün yoxlanılması üçün geniş istifadə olunan yanaşma olaraq qalır.
Daha qabaqcıl laboratoriyalar çox vaxt Agilent Bioanalyzer və ya TapeStation kimi kapilyar elektroforez sistemlərindən istifadə edirlər. Bu platformalar dəqiq ölçü paylanması profilləri təqdim edir və tədqiqatçılara həddindən artıq fraqmentasiyanı və ya natamam parçalanmanı aşkar etməyə imkan verir.

Ultrasəs fraqmentasiyasından sonra xromatinin keyfiyyətini qiymətləndirərkən tədqiqatçılar adətən aşağıdakıları təsdiqləyirlər:

• DNT fraqmentlərinin əksəriyyəti 100–600 bp diapazonuna düşür
• Təkrar nümunələrdə fraqmentlərin paylanması eynidir
• DNT deqradasiyası minimaldır
• Ümumi xromatin çıxımı planlaşdırılan ChIP analizi üçün kifayətdir

Düzgün keyfiyyət nəzarəti xromatinin ultrasəslə parçalanması mərhələsinin təkrarlana bilən və bioloji baxımdan mənalı nəticələr verməsini təmin edir.

Nəticə: etibarlı tədqiqat üçün xromatinin ultrasəslə parçalanması

Xromatinin etibarlı parçalanması uğurlu ChIP və epigenetika tədqiqatları üçün əsasdır. Ultrasəs fraqmentasiyası güclü həll təklif edir, çünki geniş çeşidli eksperimental formatlarda xromatinin dəqiq, təkrarlana bilən və reagentsiz parçalanmasına imkan verir.
Sonikasiya parametrlərini diqqətlə optimallaşdırmaqla, fraqment ölçülərinin paylanmasını yoxlamaqla və uyğun sonikasiya sistemini – istər zond tipli sonikator, istər çoxsınaq şüşəli VialTweeter, istərsə də yüksək emal məhsuldarlığı olan UIP400MTP mikrolövhə sonikatoru – seçməklə tədqiqatçılar yüksək keyfiyyətli ChIP və ChIP-seq nəticələrini dəstəkləyən ardıcıl xromatin fraqmentasiyasına nail ola bilərlər.
Epigenetika tədqiqatları daha yüksək emal məhsuldarlığına və təcrübələrin daha yüksək təkrarlanma qabiliyyətinə doğru genişlənməyə davam etdikcə, xromatinin ultrasəslə parçalanması müasir molekulyar biologiya laboratoriyaları üçün mövcud olan ən çoxməqsədli və etibarlı üsullardan biri olaraq qalır.

Layihələndirmə, istehsal və məsləhət xidmətləri – Almaniya istehsalı keyfiyyət

Hielscher ultrasəs cihazları ən yüksək keyfiyyət və dizayn standartları ilə tanınır. Möhkəmlik və asan istismar ultrasəs cihazlarımızın sənaye müəssisələrinə rahat inteqrasiyasına imkan verir. Hielscher ultrasəs cihazları sərt şəraitə və çətin iş mühitlərinə asanlıqla tab gətirir.

Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatına malik şirkətdir və ən müasir texnologiya ilə istifadə rahatlığını birləşdirən yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs cihazlarına xüsusi önəm verir. Əlbəttə, Hielscher ultrasəs cihazları CE tələblərinə uyğundur və UL, CSA və RoHs tələblərinə cavab verir.

Ədəbiyyat / İstinadlar

• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
• Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
• José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
• Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)