Fosfoproteomika üçün ultrasəslə işləmənin köməyi ilə zülal ekstraksiyası

Müasir həyat elmlərində fosfoproteomika hüceyrə siqnal ötürmə yollarının deşifrə edilməsi və xəstəlik mexanizmlərinin sistem səviyyəsində başa düşülməsi üçün təməl texnologiyaya çevrilmişdir. Fosforlaşma ferment aktivliyindən zülal–zülal qarşılıqlı təsirlərinə qədər mühüm bioloji funksiyaları idarə etdiyindən, onun dəqiq ölçülməsi həm fundamental tədqiqatlar, həm də translyasiya təbabəti üçün vacibdir. Kütlə spektrometriyasındakı son nailiyyətlər bir təcrübədə on minlərlə fosforlaşma hadisəsinin müəyyən edilməsinə imkan vermişdir ki, bu da etibarlı, miqyaslana bilən və təkrarlana bilən nümunə hazırlama iş axınlarına ehtiyacı vurğulayır.
Bu sahədə ən böyük təsirə malik yeniliklərdən biri ultrasəslə işləmənin köməyi ilə zülal ekstraksiyasının tətbiqidir; bu üsul nümunələrin keyfiyyətini, emal məhsuldarlığını və nəticələrin təkrarlana bilməsini əhəmiyyətli dərəcədə artırır. VialTweeter və UIP400MTP kimi ultrasəs texnologiyaları hazırda laboratoriyaların böyük nümunə qrupları ilə işləmə üsullarını, xüsusilə yüksək nümunə emalı məhsuldarlığına malik fosfoproteomikada, yenidən formalaşdırır.

Fosfoproteomikada səmərəli nümunə hazırlığının elmi əhəmiyyəti

Zülalların fosforlaşması insan hüceyrələrindəki zülalların əksəriyyətinə təsir edən, yüksək dərəcədə dinamik və geri dönən posttranslyasiya modifikasiyasıdır. O, zülalların quruluşunu, lokalizasiyasını və qarşılıqlı təsir şəbəkələrini tənzimləyir; bu tənzimlənmənin pozulması xərçəng və neyrodegenerasiya kimi xəstəliklərlə əlaqələndirilir.
Lakin fosfoproteomik analiz özünəməxsus texniki çətinliklər yaradır. Fosforlaşmış peptidlərin miqdarı çox vaxt az olur və onlar diqqətli zənginləşdirmə və analizdən əvvəl yüksək səmərəli nümunə hazırlığı tələb edir. Zülal ekstraksiyası və ya həzmi zamanı hər hansı səmərəsizlik siqnal itkisinə, nəticələrin zəif təkrarlana bilməsinə və fosforlaşma sahələrinin natamam əhatəsinə səbəb ola bilər.
Məhz burada ultrasəslə işləmə həlledici əhəmiyyət qazanır.

Ultrasəslə işləmə zülal ekstraksiyasını niyə dəyişdirir

Ultrasəslə işləmə hüceyrə və toxumaları mexaniki olaraq parçalamaq üçün yüksək intensivlikli ultrasəs dalğalarından istifadə edir və hüceyrələrdən, toxumalardan, bioloji mayelərdən və hüceyrəxarici vezikullardan zülalların səmərəli ayrılmasına imkan verir. Ənənəvi lizis üsulları ilə müqayisədə ultrasəslə işləmə bir sıra aydın üstünlüklər təklif edir:

• Birincisi, o, hüceyrələrin sürətli və bərabər parçalanmasını təmin edir ki, bu da keçici fosforlaşma vəziyyətlərinin qorunması üçün xüsusilə vacibdir. Fosfoproteomikada hətta cüzi gecikmələr və ya natamam lizis siqnal ötürmə profillərini dəyişə bilər; buna görə sürətli və təkrarlana bilən ekstraksiya vacibdir.
• İkincisi, ultrasəslə işləmə, xüsusilə sıx toxumalar və ya membranlarla zəngin hüceyrələr kimi lizisi çətin olan nümunələrdə, zülal çıxımını və həllolmanı yaxşılaşdırır. Bu, birbaşa sonrakı həzmin yaxşılaşmasına və fosfopeptidlərin daha yaxşı əldə edilməsinə gətirib çıxarır.
• Üçüncüsü, ultrasəslə emal öz təbiətinə görə miqyaslana bilir. VialTweeter kimi cihazlar bir neçə hermetik bağlanmış sınaq borusunun eyni vaxtda ultrasəslə işlənməsinə imkan verərək bütün nümunələr üçün eyni emal şəraitini təmin edir. Bu, əl ilə işləmə nəticəsində yaranan dəyişkənliyi aradan qaldırır.
• Daha yüksək nümunə emalı məhsuldarlığı tələbləri üçün UIP400MTP böyük texnoloji sıçrayışdır. O, avtonümunəgötürücü flakonları da daxil olmaqla bütöv mikroplitələrin və ya sınaq borusu ştativlərinin birbaşa ultrasəslə işlənməsinə imkan verir və buna görə yüzlərlə nümunənin paralel emalı üçün idealdır. Bu imkan böyük nümunə qruplarının standart olduğu sistem biologiyasında və klinik tədqiqatlarda xüsusilə qiymətlidir.

Yüksək nümunə emalı məhsuldarlığı ilə ultrasəslə işləmə: diqqət mərkəzində VialTweeter və UIP400MTP

Qabaqcıl ultrasəs cihazlarının fosfoproteomik iş axınlarına inteqrasiyası sadəcə rahatlıq deyil – metodoloji təkmilləşdirmədir.
VialTweeter bir neçə bağlı flakonun sinxron ultrasəs emalı üçün nəzərdə tutulmuşdur; o, çarpaz çirklənməni minimuma endirir və nəticələrin təkrarlana bilməsini təmin edir. O, xüsusilə orta nümunə emalı məhsuldarlığı tələb edən tətbiqlər və standartlaşdırılmış iş axınları üçün uyğundur.
 

Bunun əksinə olaraq, UIP400MTP yüksək nümunə emalı məhsuldarlığı tələb edən mühitlər üçün optimallaşdırılmışdır və aşağıdakılara imkan verir:

• Bütöv standart mikroplitələrdə, məsələn, 96 və ya 384 yuvalı plitələrdə bərabər ultrasəs emalı
• Sınaq borusu ştativlərinin və avtonümunəgötürücü flakonlarının birbaşa emalı
• Əl ilə işə sərf olunan vaxtın əhəmiyyətli dərəcədə azalması
• Böyük məlumat dəstlərində nəticələrin təkrarlana bilməsinin artması

Bu miqyaslana bilmə xüsusiyyəti iş axınlarında müntəzəm olaraq onlarla, hətta yüzlərlə nümunənin paralel emal edildiyi müasir fosfoproteomika yanaşmaları ilə mükəmməl uyğunlaşır.

Ultrasəslə işləmənin köməyi ilə fosfoproteomik nümunə hazırlığı üçün ümumi protokol

Etibarlı fosfoproteomik iş axını səmərəli zülal ekstraksiyasını, fermentativ həzmi və fosfopeptidlərin zənginləşdirilməsini birləşdirir. Aşağıdakı sxem ultrasəs əsaslı hazırlığa uyğunlaşdırılmış, qəbul olunmuş ən yaxşı təcrübələri əks etdirir:

1. Nümunələrdə reaksiyaların sürətlə dayandırılması və nümunələrin toplanması
   Fosforlaşma vəziyyətlərini qorumaq üçün hüceyrə və ya toxumalarda reaksiyalar sürətlə – adətən ani dondurma vasitəsilə – dayandırılır. Fosforlaşma hadisələrinin keçici xarakterinə görə bu mərhələ həlledici əhəmiyyət daşıyır.
2. Ultrasəslə hüceyrə lizisi və zülal ekstraksiyası
   Nümunələrin donu açılır və onlar adətən qısa dövrlərlə ultrasəslə işlənir. Ultrasəs enerjisi hüceyrə membranlarını parçalayır və zülalları səmərəli şəkildə ayırır. Validasiya edilmiş iş axınlarında tam lizisi təmin etmək üçün ultrasəslə işləmə bir neçə dövrdə aparılır.
   Nümunə: Nümunələrin donu buz üzərində açıldıqdan sonra hüceyrə lizisi ultrasəslə işləmə ilə, məsələn, Vialtweeter cihazından istifadə etməklə, hər biri 1 min olan 2 dövr ərzində əldə edilmişdir.
3. Durulaşdırma və zülalların miqdarının təyini
   Lizisdən sonra qalıqları ayırmaq üçün nümunələr sentrifuqalanır. Həll olan zülalları ehtiva edən supernatant toplanır və bütün nümunələr üçün eyni miqdarda başlanğıc materialı təmin etmək məqsədilə onun zülal miqdarı təyin edilir.
4. Reduksiya və alkilləşdirmə
   Zülalları sabitləşdirmək və həzmin səmərəliliyini artırmaq üçün disulfid rabitələri reduksiya olunur (məsələn, DTT istifadə etməklə) və alkilləşdirilir (məsələn, IAA istifadə etməklə).
5. Proteolitik həzm
   Zülallar adətən tripsinlə fermentativ həzm olunur və kütlə spektrometriyası analizi üçün uyğun peptidlər yaranır. Ultrasəslə sürətləndirilmiş zülal həzmi haqqında daha ətraflı oxuyun!
6. Peptidlərin təmizlənməsi və duzlardan azad edilməsi
   LC-MS analizinə mane ola biləcək çirkləndiriciləri aradan qaldırmaq üçün peptidlər C18 əsaslı üsullarla təmizlənir.
7. Fosfopeptidlərin zənginləşdirilməsi
   Fosforlaşmış peptidlərin miqdarı az olduğundan, fosfopeptidləri seçici şəkildə ayırmaq üçün Fe-NTA və ya TiO₂ affinlik üsulları kimi zənginləşdirmə texnikaları tətbiq edilir.
8. LC-MS/MS analizi və məlumatların emalı
   Zənginləşdirilmiş nümunələr yüksək ayırdetmə qabiliyyətli kütlə spektrometriyası ilə analiz edilir; miqdar təyinini və nəticələrin təkrarlana bilməsini yaxşılaşdırmaq üçün çox vaxt məlumatdan asılı olmayan məlumat toplama (DIA) tətbiq olunur.

Qeyd etmək lazımdır ki, genişmiqyaslı iş axınları 96 yuvalı plitə formatlarına uyğunlaşdırıla bilər və bu, yüzlərlə nümunəyədək paralel emala imkan verir – bu yanaşma UIP400MTP əsaslı ultrasəs emalı ilə tam uyğundur.
 

Fosfoproteomda reaksiyaların sürətlə dayandırılması, fosfopeptidlərin zənginləşdirilməsi və Phos-DIA-MS üçün optimallaşdırılmış protokol.
Protokol və şəkil: ©Die et al. 2023

Ultrasəslə işləmə vasitəsilə nəticələrin təkrarlana bilməsinin və məlumat keyfiyyətinin artırılması

Fosfoproteomikada əsas çətinliklərdən biri böyük məlumat dəstlərində ardıcıl miqdar təyininə nail olmaqdır. Nümunə hazırlığı zamanı yaranan dəyişkənlik bioloji baxımdan mənalı fərqləri gizlədə bilər.

Ultrasəslə işləmə aşağıdakıları təmin etməklə bu problemi həll edir:

1. Bütün nümunələrə standartlaşdırılmış enerji verilməsi
2. Əl ilə işdən qaynaqlanan dəyişkənliyin azalması
3. Zülal ekstraksiyası və həzmində nəticələrin təkrarlana bilməsinin yaxşılaşması

UIP400MTP kimi yüksək nümunə emalı məhsuldarlığına malik platformalarla birləşdirildikdə, laboratoriyalar sistem biologiyası tədqiqatları və klinik biomarkerlərin kəşfi üçün vacib olan nəticə ardıcıllığı səviyyəsinə nail ola bilər.

Fosfoproteomikanın gələcəyi: avtomatlaşdırma və miqyaslana bilmə

Fosfoproteomikanın genişmiqyaslı və klinik tətbiqlərdə istifadəsi artdıqca, avtomatlaşdırmaya və nümunə emalı məhsuldarlığına tələbat yalnız artacaq. Ultrasəs əsaslı nümunə hazırlığı, xüsusilə mikroplitələrlə uyğun sistemlərə inteqrasiya edildikdə, bu inkişafı mümkün edən əsas texnologiyalardan biridir.
Səmərəli ultrasəs lizisini, paralel emalı və avtomatlaşdırılmış iş axınları ilə uyğunluğu birləşdirən VialTweeter və UIP400MTP kimi cihazlar proteomikada nümunə hazırlığı üçün yeni standartlar müəyyən edir.
UIP400MTP cihazının avtomatlaşdırılmış laboratoriya iş axınlarına inteqrasiyası haqqında daha ətraflı oxuyun!

Fosfoproteomikada ultrasəslə işləmənin köməyi ilə nümunə hazırlığının üstünlüklərindən yararlanın!

Ultrasəslə işləmənin köməyi ilə zülal ekstraksiyası misilsiz səmərəlilik, miqyaslana bilmə və nəticələrin təkrarlana bilməsini təmin edərək müasir fosfoproteomikanın mühüm komponentinə çevrilmişdir. Böyük nümunə qruplarında mürəkkəb bioloji sistemləri analiz etmək ehtiyacı artdıqca, ultrasəs texnologiyaları sadəcə üstünlük təmin etmir – onlar vacibdir.
Yüksək nümunə emalı məhsuldarlığına malik, standartlaşdırılmış iş axınlarını mümkün edən VialTweeter və UIP400MTP kimi həllər hüceyrə siqnal ötürülməsi, xəstəlik mexanizmləri və dəqiq təbabət sahələrində kəşfləri sürətləndirir.

Layihələndirmə, istehsal və məsləhət xidmətləri – Almaniya istehsalı keyfiyyəti

Hielscher ultrasəs cihazları ən yüksək keyfiyyət və dizayn standartları ilə tanınır. Möhkəmlik və asan istifadə ultrasəs cihazlarımızın sənaye müəssisələrinə problemsiz inteqrasiyasına imkan verir. Hielscher ultrasəs cihazları sərt şəraitin və yüksək tələblər qoyan mühitlərin öhdəsindən asanlıqla gəlir.

Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatına malik şirkətdir və ən müasir texnologiya ilə istifadə rahatlığını birləşdirən yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs cihazlarına xüsusi diqqət yetirir. Əlbəttə, Hielscher ultrasəs cihazları CE tələblərinə uyğundur və UL, CSA və RoHs tələblərinə cavab verir.

Hielscher şirkətinin çoxsaylı nümunələr üçün ultrasəs cihazı modelləri: mikroplitələr üçün UIP400MTP, VialTweeter və CupHorn – yüksək sürət və yüksək nümunə emalı məhsuldarlığı ilə nümunə hazırlığı