Proteomika protokolu: təmassız sonikasiya MS üçün peptid nümunələrinin hazırlanmasını təkmilləşdirir

Aşağıdan yuxarı proteomika müasir biomarker kəşfinin, struktur biologiyanın və klinik diaqnostikanın təməl istiqamətlərindən birinə çevrilmişdir. Kütlə spektrometriyası (MS) analizindən əvvəl zülalları peptidlərə həzm etməklə tədqiqatçılar amin turşusu ardıcıllığının daha geniş əhatəsinə və daha etibarlı kəmiyyət təyininə nail ola bilərlər. Bununla belə, yüksək mürəkkəblikli bioloji nümunələrin MS üçün hazırlanması texniki baxımdan çətin olaraq qalır. Son metodoloji nailiyyətlər nəzarət olunan ultrasəs emalının – xüsusilə təmassız VialTweeter çoxsınaqşüşəli sonikatoru və UIP400MTP mikroplitə sonikatoru ilə – bu iş prosesini əhəmiyyətli dərəcədə sadələşdirə, təkrarlana bilməni yaxşılaşdıra və cihazların işində rast gəlinən darboğazların qarşısını ala bildiyini göstərir.
MS analizi üçün uyğun ölçülü peptidlər əldə etmək məqsədilə ətraflı nümunə hazırlama protokolu ilə tanış olun.

Peptid nümunələrinin hazırlanması üçün təmassız sonikasiyadan kimlər istifadə etməlidir?

• Aşağıdan yuxarı proteomika və kəşf laboratoriyaları: LC-MS və ya MALDI iş prosesləri üçün yüksək mürəkkəblikli nümunələr hazırlayan və müxtəlif bioloji matrislərdən sabit, yüksək çıxımlı peptid əldə edilməsinə ehtiyac duyan tədqiqatçılar.
• S-Trap™ və suspenziyada tutma texnologiyasının istifadəçiləri: Mikrokolonla təmizləməyə əsaslanan, kolonun tıxanmasının qarşısını almaq və nümunənin maneəsiz yüklənməsini və həzmini təmin etmək üçün DNT-nin nəzarətli kəsici qüvvələrlə parçalanmasına ehtiyac duyan komandalar.
• Klinik və translasiya tədqiqat qrupları: Partiyalar arasında təkrarlana bilmənin və nümunə bütövlüyünün kritik əhəmiyyət daşıdığı toxuma, hüceyrə, plazma, serum və ya onurğa-beyin mayesi emal edən laboratoriyalar.
• Kəmiyyət və hədəfli MS komandaları: Zondlu sonikatorların az miqdarda olan peptidlərin kəmiyyət təyinini poza biləcək çarpaz çirklənmə riskləri yaratdığı ciddi müqayisəli tədqiqatlar aparan laboratoriyalar.
• Mərkəzi laboratoriya xidmətləri və yüksək nümunə emal məhsuldarlığı olan əməliyyatlar: Bir neçə bioloji təkrarı eyni vaxtda emal edən və zondun təmizlənməsinə ehtiyacı aradan qaldıran, əl ilə işləmə müddətini azaldan və aseptik şəraiti qoruyan VialTweeter ilə qapalı sınaq şüşələrində çoxsınaqşüşəli blok sonikasiyasından faydalanan qruplar.
• PTM və zülal strukturu tədqiqatçıları: Hüceyrə lizisi və homogenləşdirmə zamanı labil modifikasiyaları qorumaq və amin turşusu ardıcıllığının əhatəsini maksimuma çatdırmaq üçün yumşaq, temperaturu nəzarətdə saxlanılan emala ehtiyac duyan tədqiqatçılar.

Protokolun icmalı: toxuma və hüceyrələrdən MS üçün hazır peptidlərə

Wojtkiewicz və həmmüəlliflərinin təsvir etdiyi, geniş tətbiq olunan aşağıdan yuxarı proteomika iş prosesi müxtəlif bioloji matrislərdən peptid nümunələrinin hazırlanması üçün etibarlı və miqyası artırıla bilən üsul təqdim edir. 50–100 mg sürətlə dondurulmuş toxuma və ya 1–20 milyon hüceyrə ilə başlayan protokol fermentativ həzmdən əvvəl detergentləri, duzları və çirkləndiriciləri səmərəli şəkildə uzaqlaşdırmaq üçün suspenziyada tutma (S-Trap™) texnologiyasını birləşdirir.
Lizis, zülalın kəmiyyət təyini, reduksiya və alkilləşdirmədən sonra nümunə turşulaşdırılır və tripsin/lysC həzminin baş verdiyi S-Trap™ sentrifuqalama kolonuna yüklənir. Alınan peptidlər elüsiya edilir, qurudulur və LC-MS analizinə məruz qoyulur. 50 mg insan ürək toxumasına tətbiq edildikdə bu iş prosesi hər analizdə 4.000-dən çox unikal zülalı müəyyən etməklə 30–40 inyeksiya üçün kifayət qədər peptid verir. Kimyəvi mərhələlər və kolon əsaslı təmizləmə dəqiq müəyyən edilmiş olsa da, prosesin uğuru böyük dərəcədə ilkin fiziki parçalanma və DNT ilə işləmə mərhələlərindən asılıdır.
Protokol hüceyrələrin ultrasəslə lizisi və DNT-nin kəsici qüvvələrlə parçalanması üçün VialTweeter çoxsınaqşüşəli sonikatorundan istifadəni tövsiyə edir – hər iki mərhələ peptid analizi üçün kritik əhəmiyyət daşıyır.

Zülal ekstraksiyası üçün hüceyrə və toxumaların ultrasəslə lizisi

Aşağıdan yuxarı proteomika iş prosesində sonikasiya sonrakı kütlə spektrometriyası analizi üçün zülalları ekstraksiya etmək məqsədilə hüceyrə nümunələrinin lizisində əsas mərhələdir. Hüceyrə çöküntüsünə SDS hüceyrə lizisi buferi əlavə edildikdən sonra nümunələr VialTweeter çoxsınaqşüşəli sonikatoru ilə ultrasəs emalına məruz qoyulur. Protokolda 1,5 mL mikrosentrifuqa sınaq şüşələrindən istifadə edilir və sonikatorun 30% gücdə 10 saniyə işlədilməsi və 10 saniyə söndürülməsi, bunun 3 sikl ərzində təkrarlanması göstərilir. 1 dəqiqə gözlədikdən sonra sikl daha iki dəfə təkrarlanır. Nümunələr davamlı olaraq buzla soyudulur.
Bu proses hüceyrələrin parçalanmasına kömək etməklə yanaşı, lizis zamanı ayrılan genom DNT-sinin kəsici qüvvələrlə parçalanması üçün xüsusilə zəruridir. DNT-nin effektiv parçalanması nümunənin özlülüyünü azaltmaq və S-Trap™ kolonlarının tıxanmasının qarşısını almaq üçün həlledicidir; bununla da zülalların optimal çıxımı və sonrakı peptid həzminin etibarlılığı təmin edilir.

DNT-nin ultrasəslə kəsici qüvvələr vasitəsilə parçalanmasının həlledici rolu

S-Trap™ əsaslı iş proseslərində ən çox rast gəlinən nasazlıqlardan biri kolonun tıxanmasıdır; buna demək olar ki, yalnız hüceyrə və ya toxumanın homogenləşdirilməsi zamanı ayrılan yüksək molekul kütləli genom DNT-si səbəb olur. Bütöv DNT nümunənin özlülüyünü kəskin artırır, peptidləri tutub saxlayır və S-Trap™ sorbentinin mikroməsaməli qatını bloklayır.
Ultrasəs emalı DNT-ni mexaniki olaraq kiçik, həll olan fraqmentlərə parçalayaraq bu problemi həll edir. Nəzarət olunan akustik enerji tətbiq etməklə VialTweeter həddindən artıq istilik yaratmadan və kənar çirkləndiricilər daxil etmədən nuklein turşularını kəsici qüvvələrlə səmərəli şəkildə parçalayır. Özlülüyün bu şəkildə azalması nümunənin maneəsiz yüklənməsini, kolondan keçən axının sabit sürətini və fasiləsiz həzm kinetikasını təmin edir.

Optimallaşdırılmış VialTweeter sonikasiya parametrləri

Protokol bioloji nümunənin bütövlüyü və sonrakı MS analizi ilə uyğunluğu üçün optimallaşdırılmış, yüksək təkrarlana bilən sonikasiya rejimi müəyyən edir. Hielscher VialTweeter təmassız blok sonikatoru ilə 1,5mL mikrosentrifuqa sınaq şüşələrindəki nümunələr üçün aşağıdakı parametrlər zülal strukturunu qorumaqla lizisi və DNT-nin kəsici qüvvələrlə optimal parçalanmasını təmin edir:

• Amplituda: 30% güc
• Sikl sxemi: 10 saniyə İŞLƏK / 10 saniyə SÖNDÜRÜLMÜŞ
• Müddət: 3 sikl (10sec İŞLƏK/10sec SÖNDÜRÜLMÜŞ) → buz üzərində 1 dəqiqəlik fasilə → daha 2 dəfə təkrarlayın
• Temperaturun idarə edilməsi: termiki denaturasiyanın və vaxtından əvvəl fermentativ aktivliyin qarşısını almaq üçün nümunələr emal zamanı buz üzərinə yerləşdirilir

Bu impulslu sonikasiya yanaşması lokal həddindən artıq qızmanın qarşısını alır, peptid oksidləşməsini minimuma endirir və bütün flakonların bərabər akustik təsirə məruz qalmasını təmin edir. Qapalı sınaq şüşələri ilə quruluş həmçinin nümunələr arasında zondun təmizlənməsinə ehtiyacı aradan qaldırır, əl ilə işləmə müddətini və operatorlar arasındakı dəyişkənliyi kəskin azaldır.

Müasir proteomika iş prosesləri üçün əsas üstünlüklər

VialTweeter cihazının aşağıdan yuxarı proteomika prosesinizə inteqrasiyası bir sıra əməliyyat və elmi üstünlüklər təqdim edir:

1. DNT-nin sabit fraqmentasiyası: Bütün flakonlara akustik enerjinin bərabər ötürülməsi özlülüyün təkrarlana bilən azalmasını təmin edir və S-Trap™ yüklənməsində partiyalar arasındakı dəyişkənliyin qarşısını alır.
2. Labil modifikasiyaların qorunması: Buz vannasında aşağı temperaturlu emal posttranslyasiya modifikasiyalarını (PTM-ləri) qoruyur və hüceyrə lizisi zamanı istiliyin yaratdığı zülal aqreqasiyasının qarşısını alır.
3. Sonrakı emalın sadələşdirilməsi: VialTweeter ilə emal olunmuş lizatlar əlavə təmizləmə mərhələləri olmadan birbaşa sentrifuqalama ilə durulaşdırıla və onların kəmiyyət təyini aparıla bilər; bu da S-Trap™ həzminə keçidi sürətləndirir.
4. Miqyasın artırılması imkanı və çeviklik: Eyni sonikasiya parametrləri həm yüksək mürəkkəblikli toxuma nümunələrinə, həm də hüceyrə suspenziyalarına tətbiq edilir və kəşf proteomikası, hədəfli kəmiyyət təyini və qlikoproteomika iş proseslərini dəstəkləyir. Hielscher mikroplitə sonikatorları çoxquyulu plitələrdə çoxsaylı nümunələrə keçməklə miqyasın asanlıqla artırılmasına imkan verir.

Ədəbiyyat / İstinadlar

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
• Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
• Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.