Proteomika Protokolu: Kontaktsız Sonikasiya MS üçün Peptid Nümunələrinin Hazırlanmasını Gücləndirir
Aşağıdan yuxarıya doğru proteomika müasir biomarker kəşfinin, struktur biologiyanın və klinik diaqnostikanın təməl daşına çevrilmişdir. Kütləvi spektrometriya (MS) analizindən əvvəl zülalları peptidlərə həzm etməklə tədqiqatçılar ardıcıllığın daha dərin əhatə dairəsinə və daha etibarlı kəmiyyətə nail ola bilərlər. Bununla belə, MS üçün yüksək mürəkkəbliyə malik bioloji nümunələrin hazırlanması texniki cəhətdən tələbkar olaraq qalır. Son metodoloji inkişaflar ultrasəs emalının necə idarə olunduğunu vurğulayır – xüsusilə təmassız VialTweeter Multi-Tube sonikatoru və UIP400MTP Microplate sonikatoru ilə – bu iş prosesini əhəmiyyətli dərəcədə asanlaşdıra, təkrar istehsal qabiliyyətini yaxşılaşdıra və ümumi alət darboğazlarının qarşısını ala bilər.
MS tərəfindən analiz üçün uyğun ölçülü peptidlər əldə etmək üçün ətraflı nümunə hazırlama protokolunu tapın.
Peptid Nümunə Hazırlanması üçün Temassız Sonikasiyanı Kim İstifadə Etməlidir?
- Bottom-Up Proteomika & Kəşfiyyat Laboratoriyaları: LC-MS və ya MALDI iş axınları üçün yüksək mürəkkəbliyə malik nümunələri hazırlayan tədqiqatçılar, müxtəlif bioloji matrislər üzrə davamlı, yüksək məhsuldarlıq peptid bərpasına ehtiyac duyurlar.
- S-Trap™ & Həll Tutma İstifadəçiləri: Mikro-kolon təmizləməsinə əsaslanan komandalar, kolon tıxanmalarının qarşısını almaq və hamar nümunə yükləmə və həzm təmin etmək üçün DNA parçalamasını idarə etməyə ehtiyac duyurlar.
- kliniki & Translyasiya Tədqiqat Qrupları: Hissə, hüceyrə, plazma, serum və ya beyin omurilik mayesini emal edən laboratoriyalar, burada partiyadan-partiyaya təkrarolunma və nümunə bütövlüyü kritikdir.
- Kvantitativ & Hədəf MS Qrupları: Təkrar istifadə olunan sonda sonikatorlarının aşağı bolluqdakı peptidlərin kəmiyyətini pozacaq çarpaz çirklənmə riskini yaratdığı ciddi müqayisəli tədqiqatlar aparan laboratoriyalar.
- Əsas Təsisatlar & Yüksək Sürətli Əməliyyatlar: Bir neçə bioloji replikatı eyni anda işləyən qruplar, VialTweeter ilə qapalı şüşə, çoxlu şüşə blok sonikasiyasından faydalanır ki, bu da prob təmizləməni aradan qaldırır, əllə işləmə vaxtını azaldır və aseptik şəraiti qoruyur.
- PTM & Struktur Zülal Tədqiqatçıları: Hüceyrələrin lizisi və homogenizasiyası zamanı həssas modifikasiyaları qorumaq və ardıcıllıq örtüyünü maksimuma çatdırmaq üçün yumşaq, temperatur nəzarətində işləmə tələb edən tədqiqatçılar.
Çox Nümunəvi Sonicator “VialTweeter” Proteomika üçün bir neçə möhürlənmiş şüşənin qeyri-əlaqəli nümunə hazırlanması üçün
Protokol Ümumi Baxış: Doku və Hüceyrələrdən MS-Ready Peptidlərə
Wojtkiewicz et al tərəfindən təsvir edilən geniş şəkildə qəbul edilmiş aşağıdan yuxarı proteomik iş axını. müxtəlif bioloji matrislərdən peptid nümunələrinin hazırlanması üçün möhkəm, genişlənə bilən bir üsul təqdim edir. 50-100 mq dondurulmuş toxuma və ya 1-20 milyon hüceyrədən başlayaraq, protokol fermentativ həzmdən əvvəl yuyucu vasitələri, duzları və çirkləndiriciləri effektiv şəkildə təmizləmək üçün suspenziya tutma (S-Trap™) texnologiyasını birləşdirir.
Liz, zülal miqdarı, reduksiya və alkilləşmədən sonra nümunə turşudur və tripsin/lysC həzminin baş verdiyi S-Trap™ spin sütununa yüklənir. Nəticədə əldə olunan peptidlər elüasiya edilir, qurudulur və LC-MS analizinə məruz qalır. 50 mq insan ürək toxumasına tətbiq edildikdə, bu iş axını ardıcıl olaraq 30–40 inyeksiya üçün kifayət qədər peptid verir və hər qaçışda 4,000-dən çox unikal zülal müəyyən edilir. Kimya və sütun əsaslı təmizləmə yaxşı müəyyən olunsa da, boru kəmərinin uğuru əsasən ilkin fiziki pozulma və DNT idarəetmə addımlarından asılıdır.
Protokol hüceyrələrin sonikasiya lizizində və DNT-nin kəsilməsi üçün VialTweeter Multi-Tube Sonicator-un istifadəsini tövsiyə edir – hər iki addım peptid analizi üçün kritikdir.
VialTweeter möhürlənmiş 1.0, 1.5 və 2.0 mL Eppendorf tüplərini və müxtəlif NUNC flakonlarını sonikləşdirir
Zülal çıxarılması üçün ultrasəs hüceyrə və toxuma lizi
Aşağıdan yuxarı proteomika iş axınında, zülalların sonrakı kütlə spektrometriya analizinə çıxarılması üçün hüceyrə nümunələrinin lizi üçün sonikləşdirmə əsas addımdır. Hüceyrə pelletinə SDS hüceyrə lizi tamponu əlavə edildikdən sonra, nümunələr VialTweeter Multi-Tube Sonicator istifadə edilərək ultrasəs emalına məruz qalır. Protokol 1.5 mL mikrofuge tüplərinin istifadəsini nəzərdə tutur və sonikləşdiricini 30% gücdə 10 saniyə iş, 10 saniyə dayandırmaq üzrə, 3 dövrə üçün işlətməyi göstərir. 1 dəqiqə gözlədikdən sonra, dövr iki dəfə daha təkrarlanır. Nümunələr davamlı olaraq buz ilə soyudulur.
Bu proses yalnız hüceyrələrin pozulmasına kömək etmir, eyni zamanda lizis zamanı azad olunan genetik DNA-nın doğranması üçün xüsusi olaraq vacibdir. Effektiv DNA doğranması nümunənin viskozitesini azaltmaq və S-Trap™ kolonlarının tıxanmasının qarşısını almaq üçün çox önəmlidir, beləliklə optimal protein bərpası və etibarlı aşağı axın peptid həzmini təmin edir.
Ultrasonik DNA Doğranmasının Kritik Rolu
S-Trap™ əsaslı iş axınlarında ən çox rast gəlinən uğursuzluqlardan biri kolonların tıxanmasıdır ki, bu da demək olar ki, yalnız hüceyrələrin və ya toxumaların homogenizasiyası zamanı açığa çıxan yüksək molekulyar çəkiyə malik genetik DNA tərəfindən baş verir. Düzgün olmayan DNA nümunənin viskozitesini dramatik şəkildə artırır, peptidləri tələyə salır və mikro-poroz S-Trap™ sorbent yatağını bloklayır.
Ultrasəs emalı bu problemi DNT-ni mexaniki olaraq kiçik, həll olunan fraqmentlərə parçalayaraq həll edir. İdarə olunan akustik enerji tətbiq etməklə, VialTweeter nuklein turşularını həddindən artıq istilik yaratmadan və yad çirkləndiricilər daxil etmədən effektiv şəkildə kəsir. Bu viskozluğun azaldılması nümunənin hamar yüklənməsini, sabit axın sürətini və fasiləsiz həzm kinetikasını təmin edir.
Optimallaşdırılmış VialTweeter Sonication Parametrləri
Protokol bioloji nümunə bütövlüyü və aşağı axın MS uyğunluğu üçün optimallaşdırılmış yüksək təkrarlanan sonikasiya rejimini müəyyən edir. Hielscher VialTweeter qeyri-kontakt blok sonikatoru ilə 1.5mL mikrosentrifuqa borularında nümunə üçün aşağıdakı parametrlər lizis və optimal DNT kəsilməsini təmin edir, zülal strukturunu qoruyur:
- Amplituda: 30% güc
- Dövr Nümunəsi: 10 saniyə AÇIQ / 10 saniyə SÖNDÜRÜLMÜŞ
- Müddət: 3 dövr (10 saniyə AÇIQ/10 SANIYƏ SÖNDÜRÜLMÜŞ) → buzda 1 dəqiqəlik istirahət → 2 dəfə daha təkrarla
- Temperatur İdarəetməsi: Nümunələr emal zamanı buzun üzərinə qoyulur ki, termal denaturasiya və erkən fermentativ aktivlik yaranması
Bu impulslu sonikasiya yanaşması lokal həddindən artıq qızmanı önləyir, peptid oksidləşməsini minimuma endirir və bütün flakonlarda bərabər akustik təsir təmin edir. Qapalı boru quruluşu nümunələr arasında prob təmizləməsinə ehtiyac aradan qaldırır, bu da əllə işləmə vaxtını və operatorun dəyişkənliyini əhəmiyyətli dərəcədə azaldır.
Müasir Proteomika İş Axınları üçün Əsas Üstünlüklər
VialTweeter-i aşağıdan yuxarı proteomika boru kəmərinizə inteqrasiya etmək bir neçə əməliyyat və elmi üstünlüklər təqdim edir:
- Davamlı DNA Fragmentasiyası: Bütün viallarda bərabər akustik enerji çatdırılması viskozitenin təkrar istehsal oluna bilən şəkildə azalmasını təmin edir və S-Trap™ yükləməsində batchdən-batchə dəyişkənliyi önləyir.
- Həssas Dəyişikliklərin Qorunması: Buz vannasında aşağı temperaturda işləmə, translasiya sonrası dəyişiklikləri (PTM) qoruyur və hüceyrə lizisi zamanı istilikdən qaynaqlanan protein aqreqasiyasının qarşısını alır.
- Sadələşdirilmiş Sonrakı Emal: VialTweeter ilə işlənmiş lizatlar əlavə təmizləmə addımları olmadan birbaşa sentrifuqasiya ilə təmizlənə və kəmiyyətcə müəyyən edilə bilər, bu da S-Trap™ həzminə keçidi sürətləndirir.
- Ölçeklenebilirlik & Çeviklik: Eyni sonikasya parametrləri həm yüksək mürəkkəbliyə malik toxuma nümunələrinə, həm də hüceyrə süspansiyalarına tətbiq olunur, bu da kəşf proteomikası, hədəfli kvantifikasiyası və glikoproteomika iş axınlarını dəstəkləyir. Hielscher mikrotəxminə sonikatorları çoxlu quyulu nümunələr üçün asan miqyas artırılmasına imkan verir.
Əlaqəsiz Multi-Tube Sonicator VialTweeter soyudulmuş kabinetlərdə işlədilə bilər.
Proteomik Nümunələrin Hazırlanması üçün Sonikatorlar
Kütlənin spektrometriyası üçün yüksək keyfiyyətli peptid nümunələrin hazırlanması yalnız səmərəli lizis tələb etmir. – Bu, DNT-nin qırılması, temperatur və kontaminasiyanın qarşısının alınması üzərində dəqiq nəzarət tələb edir. Hielscher VialTweeter-i bottom-up proteomika iş axınınıza daxil etməklə, S-Trap™ tıxanmasının qarşısını ala, zülalın təkrar istehsalını təmin edə və həssas MS analizləri üçün tələb olunan təmizliyi saxlaya bilərsiniz. İnsan toxuması, mədəniyyət hüceyrələri və ya mürəkkəb lysatları işləməyinizdən asılı olmayaraq, ultrasəs blok işlənməsi müasir proteomika laboratoriyalarının tələb etdiyi etibarlılığı, miqyaslana bilməyi və prosesə nəzarəti təmin edir.
Daha yüksək nümunə sayına miqyaslanmaq üçün, Hielscher-ə məxsus, qeyri-əlaqəli mikroplaka sonikator modelləri UIP400MTP və UIP550MTP-dən faydalanın! Yüksək məhsuldarlıq proteomikası üçün istənilən standart çoxüstlü plakanı emal edin!
Qapalı-Ölçülü Emal vs. Ənənəvi Probe Sonikatorlar
Tarixən tədqiqatçılar DNT-ni parçalamaq üçün birbaşa kontakt probe sonikatorlarına etibar edirdi. Effektiv olsa da, probe sistemləri proteomika iş axınlarında bir sıra əsas məhdudiyyətlər yaradır:
- Çarpaz İnfeksion Risk: Birdən çox nümunədə probe-nun yenidən istifadə edilməsi aerozol daşımasına səbəb olur və kəmiyyət MS nəticələrini əyən çarpaz çirkləndiricilər təqdim edir.
- Nümunə itkisi: Birbaşa daxil etmə sıçrama, buxarlanma və qiymətli peptidlərin probe səthinə yapışmasına səbəb ola bilər.
- Təmizləmə: Növbələr arasında sondanın ətraflı dezinfeksiyası vaxt aparan və tez-tez natamam olur, bu da az miqdarda zülal tədqiqatlarını təhlükə altına qoyur.
VialTweeter blok sonikatoru nümunələri tam olaraq möhürlənmiş mikrotsentrifuqal tüplərin içində işləyir. Bu bağlanmış sistem dizaynı sondanın nümunəyə toxunmasını aradan qaldırır, aerosol əmələ gəlməsinin qarşısını alır və homogenləşmə və lizis prosesləri boyunca ciddi aseptik şəraiti təmin edir. Yüksək mürəkkəblikli toxuma lizatlarını və ya bir neçə hüceyrə xəttini işləyən laboratoriyalar üçün bu, daha təmiz MS məlumatları, daha yüksək peptid bərpası və daha etibarlı bioloji replikasiyalar deməkdir.
Çoxxanalı Məmulat Plitələrində Yüksək Həcimli Nümunə Hazırlığına Ölçülərin Artırılması
Microplate Sonicator modelləri UIP400MTP və UIP550MTP ilə, tüp işlənməsi hər hansı standart çoxxanalı plitədə yüksək həcimli nümunə hazırlığına asanlıqla artırıla bilər.
Çox quyulu boşqab sonikatoru UIP400MTP nümunələrdən yüksək məhsuldarlıqlı zülal çıxarılması üçün
Peptid nümunələrinin hazırlanması üçün sonikasiyaya dair tez-tez verilən suallar
S-Trap™ peptid işlənməsindən əvvəl niyə sonikasiyaya ehtiyac var?
Sonikasiya, hüceyrə və ya toxuma lizası zamanı sərbəst buraxılan yüksək molekulyar çəkili genom DNA-sını kəsmək üçün zəruridir. Tam DNA nümunənin viskozluğunu kəskin artırır, bu da S-Trap™ mikrosütununu tıxaya və peptidləri saxlaya bilər, bərpa və MS uyğunluğunu ciddi şəkildə azaldır.
VialTweeter blok sonikator ənənəvi prob sonikatorlarına nisbətən nümunə hazırlığını necə yaxşılaşdırır?
Birbaşa kontaktlı prob sonikatorlarından fərqli olaraq, hansı ki hər istifadə sonrası diqqətlə təmizləmə tələb edir və aerosol daşıma riski yaradır, VialTweeter nümunələri tamamilə möhürlənmiş flakonlar və mikrotsentrifüqa borularında emal edir. Bu qapalı boru dizaynı çarpaz kontaminasiyanı aradan qaldırır, nümunə itkisinin qarşısını alır və homogenləşmə və hüceyrə lizisi zamanı ciddi aseptik şəraiti qoruyur.
Proteomika nümunələrinin hazırlanması üçün optimal sonikasiya parametrləri hansılardır?
Hüceyrə və toxumalar kimi bioloji nümunələr üçün tövsiyə olunan protokol VialTweeter sonikatorundan 30% gücdə, 10 saniyə iş / 10 saniyə fasilə sikli ilə istifadə edilməsini nəzərdə tutur, bu sikl 3 dəfə təkrarlanır. Emal zamanı nümunələr buz üzərində saxlanmalıdır və əgər ≥5 milyon hüceyrə emal edilirsə, sikl iki dəfə daha təkrarlanmalıdır. (müqayisə üçün bax: Wojtkiewicz et al., 2021)
Nümunə yükləmə zamanı S-Trap™ sütunum tıxanırsa nə etməliyəm?
Sütunların tıxanması adətən yüksək DNT özlülüyündən və ya qeyri-kafi aydınlıqdan qaynaqlanır. Bunu həll etmək üçün pipetləmədən əvvəl lizatınızı hərtərəfli sentrifuqa edin və DNT-nin sonikasiya vasitəsilə adekvat şəkildə kəsilməsini təmin edin.
Təmassız sonikasiya kəmiyyət proteomik iş axınlarına necə fayda gətirir?
Kəmiyyət tədqiqatlarında, hətta nümunələr arasında çapraz çirklənmənin izi az miqdarda peptid ölçmələrini təhrif edə bilər. VialTweeter-in qapalı borulu, çox flakonlu emal prosesi zondun daxil edilməsini aradan qaldırır, partiyadan partiyaya təkrar istehsal imkanını təmin edir və dəqiq müqayisəli analizlər üçün nümunənin bütövlüyünü qoruyur.
Bu protokoldan hansı protein məhsuldarlığını və MS dərinliyini gözləyə bilərəm?
İnsan ürək toxuması 50 mq və ya 5 milyon hüceyrə ilə başlayaraq, S-Trap™ iş axını adətən 30–50 LC-MS inyeksiyası üçün kifayət qədər peptid verir və hər qaçışda 4,000-dən çox unikal zülal müəyyən edilir. (bax: Wojtkiewicz və b., 2021)
Ədəbiyyat / İstinadlar
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics nümunə hazırlığı və klinik analiz üçün güclü təmas olmayan sonikatorlar təmin edir. Çoxquyulu lövhə sonikatoru UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn və GDmini2 axın sonikatoru nümunələri toxunmadan emal edir.