FFPE-dən parafinin uzaqlaşdırılması və zülal ekstraksiyası

VialTweeter çoxsınaqşüşəli ultrasəs cihazı ilə parafinin uzaqlaşdırılması, həllolmanın təmin edilməsi və ultrasəslə emalın optimallaşdırılmış kombinasiyasından istifadə edərək formalinlə fiksasiya edilmiş, parafinə daxil edilmiş (FFPE) toxuma kəsiklərindən zülal ekstraksiyasını asanlaşdırın. Bu protokol sonrakı kütlə spektrometriyasına əsaslanan proteomik analizləri dəstəkləyir və SP3 ilə təmizləmə və fermentativ parçalanma iş axınları ilə uyğundur.

Bu standart əməliyyat proseduru (SOP) yüksək effektivlikli ultrasəslə emaldan istifadə etməklə FFPE toxuma nümunələrinin proteomik analizini aparan laboratoriya əməkdaşları üçün nəzərdə tutulub. O, VialTweeter çoxsınaqşüşəli sonikatorundan istifadə etməklə onadək FFPE nümunəsinin paralel emalı üçün optimallaşdırılıb.

Protokol: VialTweeter istifadə etməklə FFPE nümunələrindən zülal ekstraksiyası

Materiallar və reagentlər

Reagentlər

• Ksilol (histoloji təmizlik dərəcəli)
• Etanol (mütləq 96%)
• Lizis buferi:

6 M Quanidin hidroxlorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-karboksietil)fosfin)
40 mM CAA (2-Xlorasetamid)

• Proteaza inhibitoru (istəyə bağlı; məsələn, cOmplete™ mini EDTA-free)

Avadanlıq

• VialTweeter çoxsınaqşüşəli ultrasəs cihazı
• 1,5 mL və ya 2,0 mL həcmli, zülal bağlama qabiliyyəti aşağı olan mikrosentrifuqa sınaq şüşələri
• Qızdırıcı blok və ya inkubator (95°C və 80°C parametrləri)
• Mikrosentrifuqa
• Termomikser (istəyə bağlıdır, lakin tövsiyə olunur)

Başlanğıc nümunə miqdarı

• Hər nümunə (yəni hər flakon) üçün 10 µm qalınlığında 1–2 FFPE toxuma kəsiyi

VƏ YA

• Hər nümunə (yəni hər flakon) üçün ümumilikdə ~100 µg toxuma

Qeyd: Parafin qalıqları ilə çirklənməni minimuma endirmək üçün mikrotomiya zamanı yeni bıçaqlardan istifadə edin.

Prosedur

1. Parafinin uzaqlaşdırılması
   1. FFPE kəsiklərini zülal bağlama qabiliyyəti aşağı olan mikrosentrifuqa sınaq şüşələrinə köçürün.
   2. 1 mL ksilol əlavə edin, vorteksdə qısa müddət qarışdırın.
   3. Otaq temperaturunda 10 dəqiqə inkubasiya edin.
   4. 14.000 × g-də 2 dəqiqə sentrifuqalayın; supernatantı atın.
   5. Ksilolla yumanı bir dəfə də təkrarlayın (2–4-cü addımlar).
   6. Çöküntünü 1 mL 96% etanolla yuyun, vorteksdə qarışdırın, sonra 14.000 × g-də 2 dəqiqə sentrifuqalayın. Supernatantı atın.
   7. Etanolla yumanı bir dəfə də təkrarlayın (ümumilikdə etanolla 2 yuma).
   8. Qalıq etanolun buxarlanması üçün qapaqları açıq saxlayaraq çöküntünü otaq temperaturunda 10 dəqiqə havada qurudun.
2. Zülal ekstraksiyası və ultrasəslə emal
   1. Hər quru çöküntüyə 200 µL lizis buferi əlavə edin.

      Qeyd: Sonikator 1 mL-ə qədər həcm qəbul etsə də, sonrakı emal üçün 200 µL optimaldır.

   2. Vorteksdə və ya pipetlə ehtiyatla qarışdırın.
3. Birinci termik inkubasiya
   1. Termomikser və ya qızdırıcı blokdan istifadə edərək sınaq şüşələrini 95 °C-də 30 min müddətində, 400 rpm sürətlə çalxalayaraq inkubasiya edin.
   2. Nümunələri otaq temperaturunda 5 min soyumağa qoyun.
4. VialTweeter ilə birinci ultrasəslə emal
   1. Sınaq şüşələrini VialTweeter cihazına yerləşdirin.
   2. VialTweeter UP200St cihazını aşağıdakı dəyərlərə uyğun tənzimləyin və ultrasəslə emal edin.
Sonikatorun parametrləri
• Amplitudanı (A) 100%-ə təyin edin
• Pulsasiya rejimini (C) 100%-ə təyin edin
• Dövr taymeri: Aktiv
• Aktiv qalma müddəti: 60s
• Sönülü qalma müddəti: 30s
• Hədd dəyəri: 15 min (10 dövrə uyğundur)
(Hesablama qeydi: (60 s aktiv + 30 s sönülü) × 10 dövr = 900 s = 15 min)
5. İkinci termik inkubasiya
   Sınaq şüşələrini çıxarın və yenidən 95 °C-də 15 min müddətində, 400 rpm sürətlə inkubasiya edin.
6. İkinci ultrasəslə emal
   VialTweeter cihazında eyni parametrlərdən (yuxarıda göstərildiyi kimi) istifadə edərək ultrasəslə emalı əlavə 10 dövr ərzində təkrarlayın (ümumilikdə 15 min).
7. Lizatın durulaşdırılması
   1. Nümunələri 23°C-də (otaq temperaturunda) 13.000 × g-də 10 min sentrifuqalayın.
   2. Supernatantı ehtiyatla yeni 2,0 mL Safe-lock Eppendorf sınaq şüşəsinə toplayın. Çöküntünü yerindən tərpətməyin.
8. Sonrakı emal
   Lizat artıq SP3 ilə təmizləmə və fermentativ parçalanma üçün hazırdır.

Qeydlər və ən yaxşı təcrübələr

1. Ultrasəslə emal zamanı həddindən artıq qızma riski proqramlaşdırılmış aktiv/sönülü dövrlər vasitəsilə azaldılır.
2. Zülal aqreqasiyasının qarşısını almaq üçün ultrasəslə emaldan sonra vorteksdə qarışdırmayın.

Tullantıların utilizasiyası və təhlükəsizlik

Aşağıdakı cədvəl laboratoriya ölçülü ultrasəs cihazlarımızın təxmini emal tutumu barədə məlumat verir: