FFPE-dən deparafinləşmə və zülalların çıxarılması
VialTweeter çox borulu ultrasəs cihazı ilə deparafinləşdirmə, həll etmə və sonikasiyanın optimallaşdırılmış kombinasiyasından istifadə edərək formalinlə sabitlənmiş parafinə daxil edilmiş (FFPE) toxuma bölmələrindən protein çıxarılmasını asanlaşdırın. Bu protokol aşağı axın kütlə spektrometriyasına əsaslanan proteomikanı dəstəkləyir və SP3 təmizləmə və fermentativ həzm iş axınları ilə uyğun gəlir.
Bu SOP yüksək performanslı sonikasiyadan istifadə edərək FFPE toxuma nümunələrinin proteomik analizində iştirak edən laboratoriya işçiləri üçün nəzərdə tutulub. VialTweeter Multi-Tube Sonicator istifadə edərək paralel olaraq işlənmiş on FFPE nümunəsi üçün optimallaşdırılmışdır.
VialTweeter sonikatoru 10 nümunənin eyni vaxtda sonikasiyası üçün, məsələn, FFPE nümunələrindən liziz və protein çıxarılması üçün
Protokol: VialTweeter istifadə edərək FFPE nümunələrindən zülal çıxarılması
Materiallar və reagentlər
reagentlər
- Ksilen (histoloji dərəcəsi)
- Etanol (mütləq 96%)
- Lizis buferi:
- Proteaz inhibitoru (isteğe bağlı; məsələn, cOmplete™ mini EDTA-sız)
6 M Quanidin hidroxlorid
50 mM Tris-HCl, pH 8.5
10 mM TCEP (Tris(2-karboksietil)fosfin)
40 mM CAA (2-Xloroasetamid)
Avadanlıq
- VialTweeter Multi-Tube Ultrasonikator
- 1,5 mL və ya 2,0 mL aşağı bağlayıcı mikrosentrifuqa boruları
- İstilik bloku və ya inkubator (95°C və 80°C parametrləri)
- Mikrosentrifuqa
- Termomikser (isteğe bağlı, lakin tövsiyə olunur)
Nümunə Girişi
- Nümunə başına 10 µm qalınlığında FFPE toxumasının 1-2 bölməsi (yəni, flakon başına)
- Nümunə başına cəmi ~100 µg toxuma (yəni, flakon başına)
və ya
Qeyd: Parafin qalıqlarının çirklənməsini minimuma endirmək üçün mikrotomiya üçün təzə bıçaqlardan istifadə edin.
Prosedur
- deparafinləşmə
- FFPE bölmələrini aşağı bağlayıcı mikrosentrifuqa borularına köçürün.
- 1 ml ksilen əlavə edin, qısa müddət ərzində burulğan edin.
- Otaq temperaturunda 10 dəqiqə inkubasiya edin.
- 2 dəqiqə 14000 × g-də sentrifuqa edin; supernatantı atın.
- Ksilen yuyulmasını bir daha təkrarlayın (2-4-cü addımlar).
- Qranulları 1 ml 96% etanol ilə yuyun, burulğan edin, sonra 2 dəqiqə 14,000 × g-də sentrifuqa edin. Supernatantı atın.
- Etanol yuyulmasını bir daha təkrarlayın (cəmi 2 etanol yuyulması).
- Qalıq etanolun buxarlanması üçün açıq qapaqlar ilə otaq temperaturunda 10 dəqiqə havada quru pellet.
- Protein çıxarılması və sonikasiya
- Hər quru pelletə 200 µL lizis buferi əlavə edin.
Qeyd: Sonikator 1 ml-ə qədər tutsa da, aşağı axın emal üçün 200 µL optimaldır. - Vortekslə və ya yumşaq pipetləmə ilə qarışdırın.
- Hər quru pelletə 200 µL lizis buferi əlavə edin.
- İlk Termal İnkubasiya
- Boruları termomikser və ya istilik blokundan istifadə edərək 400 rpm-də qarışdırmaqla 30 dəqiqə ərzində 95 °C-də inkubasiya edin.
- Nümunələri otaq temperaturunda 5 dəqiqə sərinləyin.
- VialTweeter ilə ilk Sonikasiya
- Boruları VialTweeter-ə qoyun.
- VialTweeter UP200St-ni aşağıdakı dəyərlərə qoyun və sonikləşdirin.
- İkinci Termal İnkubasiya
Boruları çıxarın və yenidən 95 °C-də 15 dəqiqə, 400 rpm-də inkubasiya edin. - İkinci Sonikasiya
Əlavə 10 dövr (cəmi 15 dəqiqə) üçün eyni parametrlərdən (yuxarıda olduğu kimi) istifadə edərək, VialTweeter-də sonikasiyanı təkrarlayın. - Lizatın aydınlaşdırılması
- Nümunələri 23°C-də (otaq temperaturu) 13000 × g-də 10 dəqiqə sentrifuqa edin.
- Supernatantı ehtiyatla yeni 2,0 mL Safe-lock Eppendorf borusuna toplayın. Peleti narahat etməkdən çəkinin.
- Aşağı Emal
Lizat artıq SP3 təmizləmə və enzimatik həzm üçün hazırdır.
• Amplitudu (A) 100%-ə təyin edin
• Pulsasiya rejimini (C) 100%-ə təyin edin
• Dövr saatı: Aktivdir
• Vaxtında: 60s
• Söndürmə vaxtı: 30s
• Limit dəyəri: 15 dəq (10 dövrə uyğundur)
(Hesablama Qeydi: (60 s On + 30 s Off) × 10 dövr = 900 s = 15 dəq)
Hielscher VialTweeter 10 Eppendorf borusu ilə
Qeydlər və Ən Yaxşı Təcrübələr
- Sonikasiya zamanı həddindən artıq istiləşmə riski proqramlaşdırılmış ON/OFF velosipedi ilə azaldılır.
- Protein yığılmasının qarşısını almaq üçün sonikasiyadan sonra burulğandan çəkinin.
Tullantıların Atılması və Təhlükəsizlik
Aşağıdakı cədvəl sizə laboratoriya ölçülü ultrasəs aparatlarımızın təxmini emal qabiliyyətinin göstəricisini verir:
| Tövsiyə olunan Cihazlar | Partiya Həcmi | Axın |
|---|---|---|
| UIP400MTP 96 Quyu Plitə Sonikatoru | çox quyulu / mikrotitr plitələr | na |
| Ultrasonik Kubok Horn | Flakonlar və ya stəkanlar üçün CupBuynuz | na |
| GDmini2 | ultrasəs mikro axın reaktoru | na |
| VialTweeter | 0,5 - 1,5 ml | na |
| UP100H | 1 ilə 500 ml | 10-200 ml/dəq |
| UP200Ht, UP200 St | 10 ilə 1000 ml | 20-200 ml/dəq |
| UP400St | 10 ilə 2000 ml | 20 - 400 ml/dəq |
| Ultrasonik ələk çalkalayıcısı | na | na |
Hielscher Ultrasonics, laboratoriya, pilot və sənaye miqyasında qarışdırma tətbiqləri, dispersiya, emulsiya və ekstraksiya üçün yüksək performanslı ultrasəs homogenizatorları istehsal edir.
Ədəbiyyat / İstinadlar
- Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
- Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
- Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.
Tez-tez soruşulan suallar
Niyə toxuma nümunələri FFPE kimi sabitlənir?
Formalinlə sabitlənmiş parafinə daxil edilmiş (FFPE) qorunma formaldehid vasitəsilə kovalent çarpaz əlaqələr yaratmaqla toxuma morfologiyasını və zülal strukturlarını sabitləşdirir. Parafinə daxil olmaq, retrospektiv analizlər üçün histoloji və molekulyar bütövlüyü qoruyarkən otaq temperaturunda uzunmüddətli saxlamağa imkan verir.
FFPE Nümunələrini necə deparafinləşdirə bilərəm?
Deparafinləşdirmə parafinin çıxarılması üçün ardıcıl həlledicilərin yuyulmasını əhatə edir: adətən ksilenlə iki inkubasiya, ardınca etanol ilə iki yuyulma (96%). Santrifüqadan və qurudulduqdan sonra toxuma aşağı axın ekstraksiyasına hazırdır. Bu proses lizis və fermentativ həzm üçün nümunənin əlçatanlığını bərpa edir.
Termal inkubasiyanın məqsədi nədir?
Termal inkubasiya biokimyəvi və ya fiziki dəyişikliklərə səbəb olmaq üçün nümunənin müəyyən bir müddət ərzində müəyyən edilmiş temperaturda nəzarət altında saxlanılmasına aiddir. Proteomikada ümumiyyətlə zülalları denatürasiya etmək, FFPE toxumalarında formaldehid çarpaz əlaqələrini bərpa etmək və ya lizis tamponunun effektivliyini artırmaq üçün istifadə olunur. Temperatur və müddət hədəf reaksiyaya və ya nümunə növünə uyğunlaşdırılmış kritik parametrlərdir.
SP3 Digestion nədir?
Tək Qablı Bərk Fazalı Təkmilləşdirilmiş Nümunə Hazırlanması (SP3) muncuq əsaslı proteomik iş axınıdır. O, zülalları bağlamaq üçün paramaqnit muncuqlardan istifadə edərək denaturasiya şəraitində effektiv təmizləmə, konsentrasiya və muncuq üzərində fermentativ həzm etməyə imkan verir. SP3 nümunə itkisini minimuma endirir və aşağı giriş və FFPE nümunələri ilə yüksək səviyyədə uyğun gəlir.
Hielscher Ultrasonics yüksək performanslı ultrasəs homogenizatorları istehsal edir laboratoriya üçün sənaye ölçüsü.