FFPE nümunələrinin yüksək məhsuldarlıqlı hazırlanması: zülal ekstraksiyası və nuklein turşularının kəsici qüvvələrlə parçalanması

Tez-tez verilən suallar
Aşağıda FFPE toxumalarının hazırlanmasına və FFPE nümunələrinin ultrasəs emalına aid tez-tez verilən sualları cavablandırırıq.

FFPE toxuması necə hazırlanır?

FFPE toxumasının hazırlanma mərhələləri: Təzə toxuma ilə diqqətlə davranılması və onun emalı yüksək keyfiyyətli FFPE nümunələrinin əldə edilməsi üçün mühüm əhəmiyyət daşıyır. Hüceyrə arxitekturasının, nuklein turşularının və zülalların qorunmasının təmin edilməsi sonrakı analizin dəqiqliyi üçün vacibdir. Hər bir mərhələ – toplanmadan parafinə daxil edilməyə qədər – histoloji müayinə, immunohistokimya və molekulyar tədqiqatlar daxil olmaqla müxtəlif analizlər üçün nümunənin bütövlüyünü qorumaq məqsədilə dəqiqlik tələb edir. Düzgün həyata keçirildikdə, bu fiksasiya və parafinə daxil etmə prosesi qorunan toxumanın in vivo vəziyyəti dəqiq əks etdirməsini təmin edir və etibarlı diaqnostik və tədqiqat nəticələrinin əldə edilməsinə imkan verir.
Sizi FFPE toxuma nümunələrinin parafinə daxil edilməsi prosesinin 6 əsas mərhələsi ilə tanış edirik.

• Toxumanın toplanması
  Canlı məməlilərdən götürülən biopsiyalar və toxuma kulturları FFPE nümunələrinin hazırlanması üçün təzə toxuma əldə etməyə yararlı mənbələrdir.
  Aseptik texnikadan istifadə etmək vacibdir: Kontaminasiyanın qarşısını almaq üçün steril alətlər və əlcəklərdən istifadə edin. İdeal halda toxumaları əməliyyat otağı və ya laminar axın şkafı kimi steril mühitdə toplayın.
  Nümunə çox kövrək olduğundan onunla ehtiyatla davranmaq vacibdir: Emaldakı gecikmələri minimuma endirin və toxuma kəsilib götürüldükdən dərhal sonra onun sonrakı emalına başlayın. Bu, autoliz və deqradasiyanın qarşısını almaq üçün mühüm əhəmiyyət daşıyır. Toxumanı otaq temperaturunda saxlayın; dondurmaqdan çəkinin, çünki bu, buz kristallarının yaranmasına və toxumanın zədələnməsinə səbəb ola bilər.
• Toxumanın fiksasiyası
  Əvvəlcə toxuma fiksator məhlulu ilə işlənir: Neytral pH-a qədər buferlənmiş, suda 4% formaldehidə ekvivalent olan 10% neytral buferli formalindən (NBF) istifadə edin.
  Toxumanı tamamilə formalinə batırın. Fiksatorun həcminin toxumanın həcminə nisbətinin ən azı 10:1 olmasını təmin edin. Fiksasiya müddəti toxumanın növündən və ölçüsündən asılı olaraq adətən 6 ilə 24 saat arasında dəyişir. Fiksatorun toxumaya tam nüfuz edə bilməsi vacibdir. Lakin həddindən artıq fiksasiya antigenlərin bərpasını çətinləşdirən çarpaz bağların yaranmasına səbəb ola bilər, qeyri-kafi fiksasiya isə toxumanın zəif qorunması ilə nəticələnə bilər.
• Toxumanın kəsilərək ölçüsünün kiçildilməsi
  İkincisi, fiksatorun kifayət qədər nüfuz etməsinə imkan vermək üçün toxumanı təxminən 3–5 mm qalınlığında kəsin. Müvafiq histoloji strukturları əhatə etmək üçün toxumanın düzgün istiqamətləndirilməsini təmin edin. Bu, toxuma sonradan analiz üçün istifadə edildikdə ekstraksiya prosesini asanlaşdırır.
• Fiksasiya edilmiş nümunənin emalı
  İndi fiksasiya edilmiş toxuma susuzlaşdırılmalıdır: Fiksasiyadan sonra parafinin tam nüfuz etməsini təmin etmək üçün toxuma susuzlaşdırılmalıdır. Suyu çıxarmaq üçün toxumanı konsentrasiyası tədricən artırılan etanol məhlulları sırasından (70%, 80%, 90% və 100%) keçirin.
  Ksilolla şəffaflaşdırma: Parafin suda həll olmur, lakin ksilolda həll olur. Buna görə toxumadakı su ksilolla əvəz edilməlidir. Lakin ksilolun özü suda həll olmur, amma spirtdə həll olur; buna görə suyun əvvəlcə spirtlə əvəz edildiyi aralıq mərhələ tələb olunur. Etanolu çıxarmaq və toxumanı parafin infiltrasiyasına hazırlamaq üçün toxumanı ksilola və ya ksilol əvəzedicisinə batırın.
  Parafinlə infiltrasiya: Tam infiltrasiyanı təmin etməklə toxumanı əridilmiş parafinə daxil edin. Bu mərhələdə parafinin toxumaya tam hopmasını təmin etmək üçün adətən parafin bir neçə dəfə dəyişdirilir.
• Toxumanın parafinə daxil edilməsi
  Bu mərhələdə toxuma qəlibdə toxuma bloku şəklinə salınır: Toxumanı istənilən istiqamətdə qəlibə yerləşdirin və üzərinə əridilmiş parafin tökün. Otaq temperaturunda və ya soyuq lövhə üzərində soyutmaqla parafinin bərkiməsinə imkan verin.
• Kəsiklərin hazırlanması və yerləşdirilməsi
  Mikrotomiya: Parafinə daxil edilmiş toxumanı dilimləmək üçün mikrotomdan istifadə edərək parafin blokundan nazik kəsiklər (adətən 4–5 mikrometr) hazırlayın. Sonra nümunə yerləşdirilir: sonrakı boyanma və mikroskopik analiz üçün kəsiklər əşya şüşələrinin üzərinə qoyulur.
  Sonda histoloji hazırlığın keyfiyyətini yoxlayın: Düzgün fiksasiya və emalı təmin etmək üçün ilk kəsikləri mikroskop altında qiymətləndirin. Toxumanın növünə və müşahidə olunan keyfiyyətə əsasən protokolları lazım gəldikdə uyğunlaşdırın.

 
FFPE toxumalarından RNA, DNA və zülallar əldə etmək, həmçinin xərçəng və ya digər xəstəliklərin əlamətlərini aşkar etmək üçün istifadə edilə bilər. Onlar illərlə saxlanıla bilər və tədqiqatçıların və həkimlərin toxuma nümunələrindən diaqnostika və tədqiqat üçün istifadəsinin mühüm bir hissəsidir.

FFPE toxuması ilə bağlı geniş yayılmış problemlər və çətinliklər hansılardır?

Formalinlə fiksasiya edilmiş, parafinə daxil edilmiş (FFPE) toxuma nümunələri tədqiqat və diaqnostikada geniş istifadə olunur, lakin onlarla bağlı bir sıra çətinliklər və geniş yayılmış problemlər mövcuddur:

• Biomolekulların deqradasiyası: Uzunmüddətli fiksasiya DNA, RNA və zülalların deqradasiyasına səbəb ola bilər və sonrakı tətbiqlər üçün yüksək keyfiyyətli nuklein turşularının və ya zülalların ekstraksiyasını çətinləşdirə bilər. Toxumanın qorunması üçün düzgün fiksasiya (qeyri-kafi və həddindən artıq fiksasiyadan çəkinmək) vacibdir.

Çarpaz bağların yaranması: Formalinlə fiksasiya zülallar və nuklein turşuları arasında çarpaz bağların yaranmasına səbəb olur; bu, molekulyar analizi çətinləşdirə və immunohistokimyanın və digər analizlərin dəqiqliyinə təsir göstərə bilər.

• Antigenlərin maskalanması: Fiksasiya prosesi antigen sahələrini maskalaya bilər və immunohistokimyada və digər immunoloji analizlərdə anticisimlərin bağlanmasının effektivliyini azalda bilər. Bu, çox vaxt antigenlərin bərpasını tələb edir; həmin prosedur vasitəsilə epitopun maskalanması aradan qaldırılır və epitop–anticisim bağlanması bərpa olunur. Lakin tam antigenlik həmişə bərpa olunmaya bilər.
• Fiksasiya keyfiyyətinin dəyişkənliyi: Fiksasiya müddətlərində və şəraitindəki fərqlər nümunələrin keyfiyyətinin qeyri-sabit olmasına səbəb ola bilər və nəticələrin təkrarlana bilməsinə və müqayisə edilə bilməsinə təsir göstərə bilər. Etibarlı fiksasiya protokollarından istifadə edin və qeyri-kafi və həddindən artıq fiksasiyadan çəkinin.
• DNA-nın zədələnməsi və fraqmentləşməsi: FFPE nümunələrinin formalinlə fiksasiyası DNA-nın müxtəlif növ zədələnmələrinə, o cümlədən sitozinin deaminasiyasına (C-dən T-yə mutasiyalar), oksidləşdirici zədələnməyə (məsələn, G-dən T-yə mutasiyalara səbəb olan 8-okso-quanin), həmçinin DNA polimerazanın fəaliyyətinə mane olan təkzəncirli qırılmalar, boşluqlar və azot əsası olmayan sahələr kimi fiziki pozuntulara səbəb ola bilər. Formalinlə fiksasiya prosesi DNA-nın fraqmentləşməsinə səbəb olaraq PCR və sekvensləmə kimi genetik və genomik analizləri çətinləşdirə bilər.
• RNA-nın keyfiyyəti: FFPE toxumalarından ekstraksiya edilmiş RNA çox vaxt fraqmentləşmiş və kimyəvi modifikasiyaya uğramış olur, bu isə yüksək keyfiyyətli transkriptomik analizlərin aparılmasını çətinləşdirir.
• Zülalların modifikasiyaları: Formalin zülallarda kimyəvi modifikasiyalar yarada, onların strukturuna və funksiyasına təsir göstərə bilər; bu isə proteomik analizlərə mane ola bilər.
• Nümunə emalı artefaktları: Parafinə daxil etmə və kəsiklərin hazırlanması prosesində mexaniki gərginlik və istilik artefaktlar yarada və toxumanın əlavə zədələnməsinə səbəb ola bilər.
• Partiyalararası dəyişkənlik: Müxtəlif partiyalar arasında fiksasiya və parafinə daxil etmə protokollarındakı fərqlər nəticələrdə əhəmiyyətli dəyişkənliyə səbəb ola və tədqiqatlar arasındakı müqayisələri çətinləşdirə bilər.
• Saxlanma problemləri: FFPE bloklarının uzun müddət saxlanması zamanla əlavə deqradasiyaya və nuklein turşularının bütövlüyünün itirilməsinə səbəb ola bilər və arxiv nümunələrinin retrospektiv tədqiqatlar üçün yararlılığına təsir göstərə bilər.

Optimallaşdırılmış protokollardan istifadə, nümunələrlə diqqətlə davranılması və qabaqcıl üsulların tətbiqi FFPE toxumalarından əldə edilən məlumatların keyfiyyətini və etibarlılığını yaxşılaşdırmağa kömək edir.

FFPE və dondurulmuş toxuma arasındakı fərq nədir?

FFPE (formalinlə fiksasiya edilmiş, parafinə daxil edilmiş) toxuması formalinlə fiksasiya olunaraq qorunur və sonra parafinə daxil edilir; bu, toxumanın morfologiyasını saxlamaqla otaq temperaturunda uzunmüddətli saxlanmaya imkan verir. Bunun əksinə, dondurulmuş toxuma dondurulmaqla sürətlə qorunur; bu, nuklein turşularının və zülalların bütövlüyünü daha yaxşı saxlayır, lakin çox aşağı temperaturlarda saxlanma tələb edir.

FFPE üçün parafinə daxil etmədə hansı kimyəvi maddələrdən istifadə olunur?

FFPE üçün parafinə daxil etmədə istifadə olunan kimyəvi maddələrə adətən fiksasiya üçün formalin və daxil etmə üçün parafin daxildir. FFPE üçün parafinə daxil etmədə toxumalar adətən ya 10% (v/v) neytral buferli formalin (FA), ya da paraformaldehid tozundan hazırlanmış təzə 4% (w/v) formaldehid məhlulu (PFA) ilə fiksasiya edilir. Formaldehidin suda məhlulu olan formalin toxumanın morfologiyasını qorumaq və həddindən artıq çarpaz bağların yaranmasının qarşısını almaq üçün neytral pH-a qədər buferlənir. Paraformaldehid əsaslı məhlul da zülallar arasında çarpaz bağlar yaradaraq effektiv fiksasiya təmin edir və bununla toxumanın strukturunu sonradan parafinə daxil edilmək üçün sabitləşdirir. Bu kimyəvi maddələr fiksasiya və parafinə daxil etmə prosesi zamanı toxumanın bütövlüyünü və morfologiyasını qorumaq üçün vacibdir.

FFPE nümunələrindən parafin necə çıxarılır?

FFPE nümunələrindən parafini çıxarmaq üçün toxuma kəsikləri adətən ardıcıl ksilol yuyulmalarına məruz qoyulur, sonra konsentrasiyası tədricən dəyişən spirtlər sırası və sonda su vasitəsilə rehidratasiya edilir. Ksilol yüksək dərəcədə toksik olduğundan və tənəffüs problemləri, dəri qıcıqlanması və təkrar məruzqalma zamanı potensial uzunmüddətli təsirlər kimi sağlamlıq riskləri yaratdığından, parafinin ultrasəslə çıxarılması bir çox laboratoriyada perspektivli alternativ kimi ortaya çıxır. Bu üsul ksilol kimi toksik həlledicilərə ehtiyac olmadan parafini səmərəli və təhlükəsiz şəkildə çıxarmaq üçün intensiv ultrasəs dalğalarından istifadə edir, bununla laboratoriya işçiləri üçün riski azaldır və daha təhlükəsiz iş mühiti yaradır.

Yaxşı keyfiyyətli FFPE nümunəsi əldə etmək üçün toxumalarımı nə qədər müddət fiksasiya etməliyəm?

Fiksasiya müddəti ilə bağlı ümumi tövsiyələr adətən toxuma nümunələrinin formalində 24 ilə 48 saat ərzində fiksasiya edilməsini nəzərdə tutur. Bu müddət ümumiyyətlə toxumanın morfologiyasını və hüceyrə strukturlarını qorumaq üçün kifayətdir və eyni zamanda həddindən artıq çarpaz bağların yaranmasına, nuklein turşularının və zülalların deqradasiyasına səbəb ola bilən həddindən artıq fiksasiyanı minimuma endirir. Lakin optimal fiksasiya müddəti toxumanın ölçüsündən və növündən asılı olaraq dəyişə bilər; daha kiçik və ya daha həssas nümunələr daha qısa fiksasiya müddəti tələb edir. Toxumanın autolizinin və deqradasiyasının qarşısını almaq üçün kifayət qədər fiksasiya ilə sonrakı molekulyar analizləri çətinləşdirə bilən uzunmüddətli fiksasiyadan çəkinmək arasında tarazlıq yaratmaq mühüm əhəmiyyət daşıyır.