Biofilm və Proteomik Analizdə Hielscher Çox Nümunəvi Sonicatorlardan istifadə edən protokol

VialTweeter Multi-Tube Sonicator və UIP400MTP Microplate Sonicator kimi çox nümunəli sonikatorların istifadəsi yüksək məhsuldarlıqlı tətbiqlər üçün laboratoriya iş axınlarını asanlaşdırır. Hər iki cihaz müxtəlifliyi minimuma endirərək və təkrar istehsal qabiliyyətini artıraraq çoxsaylı nümunələrdə dəqiq və vahid ultrasəs emal etməyə imkan verir. Bu, ardıcıl nümunə lizisi, biofilmin ayrılması, zülal çıxarılması və ya proteolitik həzm tələb edən eksperimentlərdə xüsusilə faydalıdır, burada əllə və ya tək nümunəli üsullar daha az səmərəli və uyğunsuzluğa meyllidir.

Çox Nümunəvi Sonicators ilə iş axınlarını sadələşdirin

UIP400MTP, məsələn, biofilmlərin və ya hüceyrə materialının vahid şəkildə ayrılmasını təmin edərək, mikroplitə quyularının eyni vaxtda ultrasəs müalicəsini təmin edir. Bu arada, VialTweeter çarpaz çirklənmədən çoxlu boru nümunələrinin dəqiq lizis və homogenləşdirilməsini təklif edir. Bu sonikatorlar emal vaxtlarını əhəmiyyətli dərəcədə azaldır, eksperimental təkrarlanma qabiliyyətini yaxşılaşdırır və yüksək nümunə bütövlüyünü qoruyur, bu da onları mikrobiologiya, proteomika və molekulyar biologiya tədqiqatlarında əvəzsiz alətlərə çevirir.
Aşağıda E. coli biofilm formalaşması və sonrakı proteomik analizi əhatə edən bir araşdırmada Hielscher çox nümunəli sonikator modellərinin, VialTweeter Çox Boru Sonikatorunun və Microplate Sonicator UIP400MTP-nin istifadəsini nümunə göstərən ətraflı protokol var.

Protokol: Hielscher Çox Nümunə Sonicatorlarından istifadə edərək biofilmin formalaşması, ayrılması və proteomik analizi

1. Bakterial Kultura Hazırlanması

• E. coli bakteriyası (W3110 ştammı) 30°C-də, E. coli biofilm əmələ gəlməsi üçün əlverişli temperaturda, tripton bulyonu (TB) mühitində:
  – 10 q/l tripton
  – 5 q/L NaCl
• Plazmidin tutulmasını təmin etmək üçün lazım olduqda antibiotiklərlə əlavə edin.
• Mikroskopiya və promotor fəaliyyəti tədqiqatları üçün rplL promotorunun nəzarəti altında genomik gücləndirilmiş GFP (eGFP) müxbiri ilə W3110 E. coli ştamından istifadə edin.
• Müxtəlif promouterlər üçün GFP reportyor plazmidlərindən istifadə edin (məsələn, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) təşviqatçıların fəaliyyətini ölçmək üçün.

2. Biofilmin yetişdirilməsi və ayrılması

• Hər quyuya 1,5 mL seyreltilmiş bakteriya mədəniyyətini 12 quyuluq boşqaba səpin (CellStar 12 quyu boşqabları, Greiner Bio-One).
• Biofilmin əmələ gəlməsinə imkan vermək üçün inkubasiya edin.
• Planktonik (yapışmayan) mədəniyyəti diqqətlə çıxarın.

– Hər quyunu 500 µL PBS ilə yuyun.
– UIP400MTP mikroplitə sonikatorunda 12 quyu boşqabını sonikasiya edərək əlavə hüceyrələri ayırın. UIP400MTP, bütün quyular arasında ardıcıl ultrasəs enerjisi çatdırmaqla vahid ayrılma təmin edir.
– Sonikasiya parametrləri: 60% amplituda, dövr rejimi: 60 san ON / 30 saniyə OFF.

3. Hüceyrə yığımı və lizisi

• 5 dəqiqə ərzində 4500 q-da ayrılmış biofilm hüceyrələrini sentrifuqa edin.
• PBS ilə pelet hüceyrələri yuyun.
• Hüceyrələri 100 µL 2% natrium lauroil sarkosinatda (SLS) yenidən dayandırın və 95°C-də 15 dəqiqə inkubasiya edin.
• Hüceyrələrin tam parçalanmasını təmin etmək üçün VialTweeter Multi-Tube Sonicator istifadə edərək sonikasiya edin.
  – Sonikasiya parametrləri: 100% amplituda, 50 s ON / 10 s OFF 10 dəqiqə ümumi iş vaxtı; nümunələri buz üzərində saxlayın.

4. Reduksiya və Alkilləşmə

• Disulfid bağlarını azaltmaq üçün 5 mM Tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP) əlavə edin və 95°C-də 15 dəqiqə inkubasiya edin.
• 25°C-də 30 dəqiqə ərzində 10 mM yodoasetamid ilə alkilat zülalları.

5. Zülalların miqdarı və həzmi

• Zibilləri təmizləmək üçün lizatları sentrifuqa edin.
• Pirs BCA Protein Təhlil Kitindən istifadə edərək ümumi protein tərkibini ölçün.
• Tərkibində 2% SLS və 100 mM ammonium bikarbonat olan məhlulda 1 µg tripsin ilə 50 µg ümumi proteini həzm edin.
• Həzm reaksiyasını bir gecədə 30 ° C-də inkubasiya edin.

6. Peptidlərin təmizlənməsi

• 1,5% trifluoroasetik turşu (TFA) əlavə edərək SLS-i çökdürün, sonra sentrifuqa edin.
• C18 mikrospin sütunlarından istifadə edərək peptidləri təmizləyin.
• Təmizlənmiş peptidləri qurutun və 0,1% TFA-da yenidən dayandırın.

7. Maye Xromatoqrafiyası-Kütləvi Spektrometriya (LC-MS/MS)

• Ultimate 3000 RSLC nano sistemi ilə birləşdirilmiş Q-Exactive Plus kütlə spektrometrində peptidləri təhlil edin.
• C18 qatranı (2,4 µm) ilə qablaşdırılan tərs fazalı HPLC sütunundan (75 µm × 42 sm) istifadə edərək peptidləri ayırın.
• 140 dəqiqə ərzində 2%-dən 35%-ə qədər həlledici B (0,15% qarışqa turşusu ilə asetonitril) gradienti tətbiq edin.
• 10 ən sıx ionun tandem MS/MS skanından sonra yüksək rezolyusiyaya malik MS taramalarından istifadə edərək məlumat əldə edin.

8. Məlumatların təhlili

• Progenesis proqramından istifadə edərək xam LC-MS məlumatlarını emal edin.
• .mgf fayllarını ixrac edin və MASCOT ilə təhlil edin.
• Keyfiyyətə nəzarət və yanlış kəşflərin tənzimlənməsi üçün SafeQuant istifadə edərək peptidin miqdarını təyin edin.
• Təkrarlanmağı təmin etmək üçün bütün təcrübələri dublikat və ya üç nüsxədə aparın.

Yüksək məhsuldarlıqlı Nümunə Hazırlanması üçün Çox Nümunə Sonicatorlar

Çox nümunəli sonikator modelləri VialTweeter və UIP400MTP eksperimental iş axınlarının dəqiqliyini və səmərəliliyini əhəmiyyətli dərəcədə artırır, xüsusən də biofilm tədqiqatı və proteomikada. Onların birdən çox nümunəni vahid şəkildə emal etmək qabiliyyəti məlumatların keyfiyyətinə xələl gətirmədən yüksək ötürmə qabiliyyətini təmin edir. Bu üstünlüklər, yuxarıda göstərilən sadələşdirilmiş iş axınları ilə birləşərək, Hielscher çox nümunəli sonikatorları müasir bioloji tədqiqatlar üçün vacib alətlər halına gətirir.

Dizayn, İstehsalat və Konsaltinq – Keyfiyyətli Almaniya istehsalı

Hielscher ultrasəs cihazları ən yüksək keyfiyyət və dizayn standartları ilə tanınır. Sağlamlıq və asan əməliyyat ultrasəs aparatlarımızın sənaye obyektlərinə rahat inteqrasiyasına imkan verir. Kobud şərtlər və tələbkar mühitlər Hielscher ultrasəs cihazları tərəfindən asanlıqla idarə olunur.

Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikatlı bir şirkətdir və ən müasir texnologiya və istifadəçi dostu olan yüksək performanslı ultrasəs cihazlarına xüsusi diqqət yetirir. Əlbəttə ki, Hielscher ultrasəs cihazları CE-yə uyğundur və UL, CSA və RoHs tələblərinə cavab verir.