Biofilm və proteomik analizdə Hielscher çoxnümunəli sonikatorlarından istifadə protokolu

VialTweeter Multi-Tube Sonicator və UIP400MTP Microplate Sonicator kimi çoxnümunəli sonikatorlardan istifadə çoxsaylı nümunələrin emalını tələb edən tətbiqlər üçün laboratoriya iş axınlarını sadələşdirir. Hər iki cihaz çoxsaylı nümunələrin dəqiq və bərabər ultrasəs emalına imkan verir, dəyişkənliyi minimuma endirir və təkrarlana bilməni artırır. Bu, nümunələrin ardıcıl nəticələrlə lizisini, biofilmin ayrılmasını, zülalların ekstraksiyasını və ya proteolitik həzmi tələb edən təcrübələrdə xüsusilə üstünlük yaradır; belə təcrübələrdə əl ilə və ya tək nümunə ilə işləyən üsullar daha az səmərəlidir və qeyri-sabit nəticələrə meyillidir.

Çoxnümunəli sonikatorlarla iş axınlarını sadələşdirin

Məsələn, UIP400MTP mikroplitanın yuvalarının eyni vaxtda ultrasəslə emalına imkan verir və biofilmlərin və ya hüceyrə materialının bərabər ayrılmasını təmin edir. VialTweeter isə sınaq borularındakı çoxsaylı nümunələrin çarpaz çirklənmə olmadan dəqiq lizisini və homogenləşdirilməsini təmin edir. Bu sonikatorlar emal müddətini əhəmiyyətli dərəcədə azaldır, təcrübələrin təkrarlana bilməsini yaxşılaşdırır və nümunələrin yüksək bütövlüyünü qoruyur; beləliklə, mikrobiologiya, proteomika və molekulyar biologiya tədqiqatlarında əvəzolunmaz alətlərə çevrilir.
Aşağıda E. coli biofilminin əmələ gəlməsini və sonrakı proteomik analizi əhatə edən tədqiqatda Hielscher çoxnümunəli sonikator modellərindən – VialTweeter Multi-Tube Sonicator və Microplate Sonicator UIP400MTP – istifadəni göstərən ətraflı protokol təqdim olunur.

Protokol: Hielscher çoxnümunəli sonikatorlarından istifadə etməklə biofilmin əmələ gəlməsi, ayrılması və proteomik analiz

1. Bakteriya kulturasının hazırlanması

• E. coli bakteriyalarını (W3110 ştammı) E. coli biofilminin əmələ gəlməsi üçün əlverişli temperatur olan 30°C-də aşağıdakı tərkibli tripton bulyonu (TB) mühitində yetişdirin:
  – 10 g/L tripton
  – 5 g/L NaCl
• Plazmidin saxlanmasını təmin etmək üçün lazım olduqda antibiotiklər əlavə edin.
• Mikroskopiya və promotor aktivliyi tədqiqatları üçün rplL promotorunun nəzarəti altında genomda yerləşən gücləndirilmiş GFP (eGFP) reporteri olan W3110 E. coli ştammından istifadə edin.
• Promotor aktivliklərini ölçmək üçün müxtəlif promotorlara (məs., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) aid GFP reporter plazmidlərindən istifadə edin.

2. Biofilmin yetişdirilməsi və ayrılması

• 12 yuvalı plitanın hər yuvasına 1,5 mL durulaşdırılmış bakteriya kulturası əkin (CellStar 12 yuvalı plitalar, Greiner Bio-One).
• Biofilmin əmələ gəlməsi üçün inkubasiya edin.
• Planktonik (səthə yapışmayan) kulturanı ehtiyatla uzaqlaşdırın.

– Hər yuvanı 500 µL PBS ilə yuyun.
– 12 yuvalı plitanı UIP400MTP mikroplita sonikatorunda ultrasəslə emal edərək yapışmış hüceyrələri ayırın. UIP400MTP bütün yuvalara eyni səviyyədə ultrasəs enerjisi ötürərək bərabər ayrılmanı təmin edir.
– Ultrasəs emalı parametrləri: 60% amplituda, dövr rejimi: 60 sec AKTİV / 30 sec QEYRİ-AKTİV.

3. Hüceyrələrin toplanması və lizisi

• Ayrılmış biofilm hüceyrələrini 4.500 g-də 5 dəqiqə sentrifuqalayın.
• Çökdürülmüş hüceyrələri PBS ilə yuyun.
• Hüceyrələri 100 µL 2% natrium lauroil sarkozinat (SLS) məhlulunda yenidən suspenziyalaşdırın və 95°C-də 15 dəqiqə inkubasiya edin.
• Hüceyrələrin tam lizisini təmin etmək üçün VialTweeter Multi-Tube Sonicator ilə ultrasəs emalı aparın.
  – Ultrasəs emalı parametrləri: 100% amplituda, ümumi işləmə müddəti 10 min olmaqla 50 s AKTİV / 10 s QEYRİ-AKTİV; nümunələri buz üzərində saxlayın.

4. Reduksiya və alkilləşdirmə

• Disulfid rabitələrini reduksiya etmək üçün 5 mM Tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP) əlavə edin və 95°C-də 15 dəqiqə inkubasiya edin.
• Zülalları 10 mM yodoasetamidlə 25°C-də 30 dəqiqə alkilləşdirin.

5. Zülalın miqdarının təyini və həzmi

• Qalıqları uzaqlaşdırmaq üçün lizatları sentrifuqalayın.
• Pierce BCA Protein Assay Kit ilə ümumi zülal miqdarını təyin edin.
• 50 µg ümumi zülalı 2% SLS və 100 mM ammonium bikarbonat tərkibli məhlulda 1 µg tripsinlə həzm edin.
• Həzm reaksiyasını 30°C-də gecə boyu inkubasiya edin.

6. Peptidlərin təmizlənməsi

• 1,5% triflüoroasetik turşu (TFA) əlavə edərək SLS-i çökdürün, sonra sentrifuqalayın.
• Peptidləri C18 mikrosentrifuqa sütunları ilə təmizləyin.
• Təmizlənmiş peptidləri qurudun və 0,1% TFA məhlulunda yenidən suspenziyalaşdırın.

7. Maye xromatoqrafiyası–kütlə spektrometriyası (LC-MS/MS)

• Peptidləri Ultimate 3000 RSLC nano sistemi ilə birləşdirilmiş Q-Exactive Plus kütlə spektrometrində analiz edin.
• Peptidləri C18 qatranı (2,4 µm) ilə doldurulmuş tərs fazalı HPLC sütunu (75 µm × 42 cm) ilə ayırın.
• 140 dəqiqə ərzində B həlledicisinin (0,15% qarışqa turşusu tərkibli asetonitril) payını 2%-dən 35%-ə artıran qradiyent tətbiq edin.
• Yüksək ayırdetmə qabiliyyətli MS skanlarından, ardınca isə ən yüksək intensivliyə malik 10 ionun tandem MS/MS skanlarından istifadə edərək məlumatları əldə edin.

8. Məlumatların analizi

• İlkin LC-MS məlumatlarını Progenesis proqramı ilə emal edin.
• .mgf fayllarını ixrac edin və MASCOT ilə analiz edin.
• Keyfiyyətə nəzarət və yanlış aşkarlamalara düzəliş üçün SafeQuant ilə peptidlərin miqdarını təyin edin.
• Təkrarlana bilməni təmin etmək üçün bütün təcrübələri iki və ya üç təkrarda aparın.

Çoxsaylı nümunələrin yüksək emal məhsuldarlığı ilə hazırlanması üçün çoxnümunəli sonikatorlar

VialTweeter və UIP400MTP çoxnümunəli sonikator modelləri, xüsusilə biofilm tədqiqatlarında və proteomikada, təcrübi iş axınlarının dəqiqliyini və səmərəliliyini əhəmiyyətli dərəcədə artırır. Onların çoxsaylı nümunələri bərabər emal etmək qabiliyyəti məlumatların keyfiyyətini azaltmadan yüksək nümunə emalı məhsuldarlığını təmin edir. Bu üstünlüklər yuxarıda təsvir olunan sadələşdirilmiş iş axınları ilə birlikdə Hielscher çoxnümunəli sonikatorlarını müasir bioloji tədqiqatlar üçün zəruri alətlərə çevirir.

Layihələndirmə, istehsal və məsləhət xidmətləri – Almaniya istehsalının keyfiyyəti

Hielscher ultrasəs cihazları ən yüksək keyfiyyət və dizayn standartları ilə tanınır. Möhkəmlik və istismar asanlığı ultrasəs cihazlarımızın sənaye müəssisələrinə problemsiz inteqrasiyasına imkan verir. Hielscher ultrasəs cihazları sərt şəraitdə və yüksək tələblər qoyan mühitlərdə asanlıqla işləyir.

Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatlı şirkətdir və ən müasir texnologiyaya və istifadə rahatlığına malik yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs cihazlarına xüsusi diqqət yetirir. Əlbəttə, Hielscher ultrasəs cihazları CE tələblərinə uyğundur və UL, CSA və RoHs tələblərini ödəyir.