Bakterial nümunələrdə hüceyrələrin ultrasəslə dezaqreqasiyası

Bakterial nümunələr nadir hallarda həqiqi təkhüceyrəli suspenziyalar şəklində daxil olur. Kulturalar zəncirlər və floklar şəklində böyüyür, ətraf mühitdən təcrid edilmiş izolyatlar hüceyrəxarici polimer maddələrlə birləşmiş aqreqatlar əmələ gətirir, sentrifuqalanmış çöküntülər isə çox vaxt intensiv vorteksləməyə baxmayaraq yenidən suspenziyalaşdırılmaya müqavimət göstərir. Canlı hüceyrələrin sayılması, optik sıxlıq, axın sitometriyası və mikrobiomun profillənməsi bir hissəciyin bir hüceyrəyə bərabər olduğunu qəbul edir. Hüceyrələrin ultrasəslə dezaqreqasiyası bu ziddiyyəti aradan qaldırır: qısa, nəzarət olunan ultrasəs impulsları aqreqatları hüceyrələri lizisə uğratmadan ayrı-ayrı hüceyrələrə ayırır.

Hüceyrə aqreqasiyası nəticələrinizin etibarlılığını niyə pozur

Aqreqasiya nümunə hazırlama xətası deyil, bioloji xüsusiyyətdir. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces və ətraf mühitdəki bir çox növ zəncirlər, qruplar və ya biopərdə fraqmentləri şəklində böyüyür, hüceyrəxarici DNT və polisaxaridlər isə çöküntülərdə və yaxma elüatlarında hüceyrələri bir-birinə yapışdırır. Analitik nəticələr sistematik xarakter daşıyır:

• Koloniyaların sayı olduğundan az qiymətləndirilir, çünki bir yığın tərkibindəki hüceyrələrin sayından asılı olmayaraq bir koloniya əmələ gətirir.
• Optik sıxlıq ölçmələri və hissəcik sayğacları hüceyrələr əvəzinə aqreqatları qeydə alaraq böyümə əyrilərini təhrif edir.
• Axın sitometriyası və hüceyrələrin çeşidlənməsi yığınlara aid hadisələri səhv sayır və onları təhlildən kənarlaşdırır.
• DNT və zülal ekstraksiyaları yalnız aqreqatın səthindəki hüceyrələri əks etdirərək mikrobiom və omiks məlumatlarını təhrif edir.

Ənənəvi həllər ləngdir, natamamdır və ya kimyəvi dəyişikliklərə səbəb olur. İntensiv pipetləmə və vorteksləmə mikroaqreqatları aradan qaldırmır. Ferment və ya xelatlaşdırıcı maddələr əsasında dispersiya təhlil etmək istəyə biləcəyiniz hüceyrə səthini dəyişdirir. Nəzarət olunan kavitasiya vasitəsilə mexaniki dezaqreqasiya saniyələr ərzində təsir göstərir və heç bir əlavə maddə tələb etmir.

Ultrasəslə işləmə hüceyrələri lizisə uğratmadan necə dezaqreqasiya edir

Hüceyrələrin ultrasəslə dezaqreqasiyası mexaniki möhkəmlik fərqindən istifadə edir. Bakterial aqreqatları nisbətən zəif hüceyrələrarası əlaqələr və hüceyrəxarici matriks bir yerdə saxlayır, bütöv hüceyrə örtüyü isə xeyli daha yüksək sürüşmə təsirinə davam gətirir. Kalibrlənmiş ultrasəs suspenziyaya daxil olduqda akustik kavitasiya əvvəlcə aqreqatların təmas sərhədlərinə təsir edən mikroaxınlar, təzyiq impulsları və sürüşmə qüvvələri yaradır. Membranların parçalandığı enerji səviyyəsinə (lizis) çatmazdan əvvəl yığınlar, zəncirlər və biopərdə fraqmentləri sürüşmə qüvvələrinin təsiri ilə ayrılır (deaqqlomerasiya).

Bakterial hüceyrə yığınlarının ultrasəslə dezaqreqasiyası

Dezaqreqasiya və ya lizis – ultrasəslə işləmə parametrlərinin əhəmiyyəti

Praktik nəticə budur ki, dezaqreqasiya və lizis eyni cihazın müxtəlif parametrlərdə işlədilməsi ilə həyata keçirilir. Orta amplituda, qısa impuls dövrləri və nəzarət olunan temperaturda canlı təkhüceyrəli suspenziya əldə edirsiniz. Amplitudanın, təsir müddətinin və ya nümunə temperaturunun artırılması prosesi hüceyrədaxili hədəflər üçün hüceyrələrin tam parçalanmasına doğru yönəldir. Hielscher generatorları amplitudanı, gücü, impulsu və daxil edilən enerjini dəqiq təyin etməyə və metodu yadda saxlamağa imkan verir; beləliklə, dezaqreqasiya mərhələsi müxtəlif nümunələr, operatorlar və emal dövrləri arasında təkrarlana bilir.

Səmərəli təmassız ultrasəslə işləmə

Vannada ultrasəslə işləmə bu nəzarət səviyyəsinə çata bilmir. Ultrasəs təmizləmə vannaları və çənləri yalnız aşağı ultrasəs enerjisi verir, bu isə natamam hazırlama ilə nəticələnir; kavitasiya da qeyri-bərabər baş verdiyindən hər boru vannadakı mövqeyinə uyğun işlənir. VialTweeter intensiv, fokuslanmış ultrasəs qüvvələrini qabın divarından birbaşa eyni vaxtda 10-a qədər kip bağlanmış nümunəyə ötürür. Vannada uzun və dəyişkən təsir müddəti tələb edən emallar standartlaşdırılmış impuls ardıcıllığı ilə tamamlanır.
Hielscher təmassız ultrasəs cihazları intensiv, fokuslanmış ultrasəsi bağlı flakonların divarlarından ötürür. VialTweeter nümunəyə zond daxil edilmədən, çarpaz çirklənmə və aerozol buraxılması olmadan 10-a qədər flakonu eyni vaxtda eyni intensivliklə emal edir. Nümunə emalı məhsuldarlığının tələbləri bunu zəruri etdikdə, UIP400MTP və UIP550MTP mikroplitə ultrasəs cihazları eyni nəzarət olunan enerji ötürülməsini çoxyuvalı plitələrə tətbiq edir.

Təmassız ultrasəs dezaqreqasiyasının üstünlükləri

• Sıfır çarpaz çirklənmə: Flakonlar daim bağlı qaldığından və nümunəyə heç bir zond salınmadığından çarpaz çirklənmə və nümunə itkisi tamamilə aradan qaldırılır. Nümunələr arasında sterilizasiya edilməli heç nə yoxdur və bir emal dövrü növbəti dövrə təsir edə bilməz.
• Aerozollardan qorunma: Açıq zondla ultrasəslə işləmə yoluxucu aerozollar yaradır və cihaz səthlərini çirkləndirir. Kip bağlanmış flakonda ultrasəslə işləmə nümunəni öz borusunun daxilində saxlayır; bu, Mycobacterium tuberculosis kimi patogen bakteriyalar və digər BSL-2 və ya BSL-3 agentləri ilə işləyərkən əhəmiyyətlidir.
• Zond ucunun eroziyası yoxdur: Titan zondlar işləmə zamanı nümunəyə az miqdarda mikrohissəcik buraxa bilər. Bu hissəciklər sonrakı mərhələlərdə optik sıxlığı və hissəcik sayını dəyişdirir. Qabın divarından dolayı ultrasəslə işləmə bu bərk hissəcik mənbəyini tamamilə aradan qaldırır.
• Bərabər nümunə emalı məhsuldarlığı: VialTweeter 10-a qədər flakonun hər birinə eyni ultrasəs intensivliyini ötürür; buna görə ultrasəslə işləmə nəticələri bərabər və təkrarlana biləndir. Vannalarda və ayrı-ayrı nümunələrin zondla işlənməsində problem yaradan mövqe təsirləri aradan qalxır və başlanğıc göstəriciləriniz təkrar nümunələr arasında müqayisə edilə bilən qalır.
• Nümunənin bütövlüyü: Borular emal boyu bağlı qalır, buna görə nümunə çirklənə, xarab ola və ya buxarlanaraq itə bilməz. Kiçik həcmlər durulaşdırılmadan işlənir; əlavə köçürmə mərhələsinin mümkün olmadığı qiymətli klinik çöküntülər də buna daxildir.
• Prosesə nəzarət: Amplituda 20–100%, impuls rejimi isə 0–100% arasında tənzimlənir və sistemlər temperatur monitorinqini dəstəkləyir; beləliklə, istiliyə həssas ştammlar və zülallar zədələnmə hədlərindən aşağı temperaturda qalır.

Tipik tətbiqlər

• Mikrobiom və bağırsaq möhtəviyyatının təhlili: yığınların sayma nəticələrini azaltmaması üçün Lactobacillus, Bifidobacterium və nəcis nümunələrinin əkilmə və ya sekvensləmədən əvvəl dispersiyası.
• Qida və su mikrobiologiyası: koloniyaların və canlılığın dəqiq müəyyənləşdirilməsi üçün yaxmalarda, yuyuntu mayelərində və zənginləşdirmə bulyonlarında flokların dezaqreqasiyası.
• Biopərdə tədqiqatları: səth zülallarını uzaqlaşdıracaq fermentativ işləmə olmadan hüceyrələrin daşıyıcılardan və səthlərdən təkhüceyrəli suspenziyalar şəklində əldə edilməsi.
• Klinik diaqnostika: bəlğəm, irin və yaxma elüatlarının bioloji təcrid şəraitində yenidən suspenziyalaşdırılması.
• Hüceyrə kulturası: sayma və pasajlamadan əvvəl yığınlaşmış məməli, həşərat və CHO hüceyrə aqreqatlarının ayrılması.
• Bütün iş prosesi üçün hazırlama: aşağı amplitudada dezaqreqasiya edən eyni cihaz daha yüksək parametrlərdə hüceyrələri tam parçalayır; beləliklə, lizis, zülal ekstraksiyası və DNT fraqmentasiyası nümunələr başqa borulara köçürülmədən ardıcıl aparılır.

Ədəbiyyat / İstinadlar

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.