Staphylococcus biofilminin yetişdirilməsi və ayrılması protokolu

Etibarlı tədqiqat nəticələri üçün standartlaşdırılmış üsullar vacibdir. Burada stafilokok biofilmlərinin yetişdirilməsi və ayrılması protokolunu tapa bilərsiniz. Bu protokol 96 quyucuqlu lövhələrdə biofilmlərin səmərəli şəkildə və yüksək nümunə emalı məhsuldarlığı ilə ayrılması üçün UIP400MTP çoxquyucuqlu lövhə sonikatorundan istifadə etməklə nümunələrin hazırlanması prosesinin sadələşdirilməsinə yönəlmişdir. Protokol həmçinin dəyişkənliyin minimuma endirilməsinə və təkrarlana bilmənin təmin edilməsinə diqqət yetirməklə biofilmlərin yetişdirilməsi, yuyulması və vizuallaşdırılması üçün əsas mərhələləri əhatə edir.

Staphylococcus biofilmi və antibiotik tədqiqatları

Staphylococcus biofilmləri antibiotiklərə və immun cavablara davamlı olduqları üçün davamlı infeksiyalarda mühüm rol oynayır. Biofilmin əmələ gəlməsi bakteriyalar üçün qoruyucu mühit yaradır və infeksiyaların müalicəsini çətinləşdirir. Biofilm tədqiqatları çox vaxt onların əmələ gəlməsini, davranışını və antimikrob preparatlara həssaslığını anlamağa yönəlir; eksperimental iş proseslərini sadələşdirmək üçün yüksək nümunə emalı məhsuldarlığı olan üsullara xüsusi diqqət yetirilir.
UIP400MTP çoxquyucuqlu lövhə sonikatoru biofilmlərin 96 quyucuqlu lövhələrdən sürətli və səmərəli ayrılmasına imkan verməklə biofilm tədqiqatlarında əhəmiyyətli üstünlük təmin edir. Bu cihaz bütün quyucuqlara bərabər ultrasəs enerjisi ötürür və dəyişkənliyi minimuma endirməklə ardıcıl nəticələr təmin edir.

Staphylococcus biofilminin yetişdirilməsi və ayrılması protokolu

Aşağıda sizi stafilokok biofilminin yetişdirilməsi və ayrılması prosesi üzrə addım-addım təlimatla istiqamətləndiririk. Nümunəvi analitik mərhələ kimi yetişdirilmiş biokütlənin kristal violetlə boyanaraq spektrofotometrik üsulla kəmiyyətcə necə təyin edildiyini göstəririk.

Staphylococcus biofilminin yetişdirilməsi

Tələb olunan materiallar:

• Qapaqlı, steril, yastı dibli, toxuma kulturası üçün səthi işlənmiş, 96 quyucuqlu polistirol mikrotitr lövhələri
• 0,25% qlükoza ilə triptik soya bulyonu (TSB)
• Bioloji təhlükəsizlik kabineti

Mərhələlər:

1. Kontaminasiyanı minimuma endirmək üçün bioloji təhlükəsizlik kabinetində steril iş mühiti hazırlayın.
2. Mikrotitr lövhəsinin quyucuqlarına 0,25% qlükoza olan TSB əlavə edin. Qlükozasız TSB ümumiyyətlə biofilmin əmələ gəlməsini dəstəkləmir və yalnız tələb olunduqda nəzarət kimi istifadə edilməlidir.
3. Quyucuqları aşağıda təsvir olunduğu kimi hazırlanmış bakteriya ştamları ilə inokulyasiya edin:
4. Suspenziyaları sonikasiya ilə homogenləşdirərək və ya hüceyrə topalarını 23 kalibrli iynə və qısa vorteksləmə ilə parçalayaraq əvvəlcədən mövcud hüceyrə topalarının olmamasını təmin edin və bakteriya suspenziyalarını hazırlayın.
5. Lövhəni qapağı ilə bağlayın və biofilmin əmələ gəlməsi üçün optimal şəraitdə inkubasiya edin (məsələn, 37°C-də 24 saat).
6. Etibarlılığı təmin etmək üçün hər bakteriya ştamı üzrə təcrübəni üç təkrarda aparın (hər ştam üçün üç quyucuq).
7. Hər lövhədə mənfi nəzarətlər üçün altı quyucuq ayırın. Hər 96 quyucuqlu lövhədə 30-a qədər ştam sınaqdan keçirilə bilər.

Biofilmin vizuallaşdırılması və yuyulması

1. İnkubasiyadan sonra biofilmi pozmamaq üçün mühiti ehtiyatla kənarlaşdırın.
2. Planktonik bakteriyaları çıxarmaq üçün hər quyucuğu fizioloji məhlulla dörd dəfə yuyun.
3. Biofilmin mövcudluğunu göstərən ağ sahələrin olub-olmadığını müəyyən etmək üçün quyucuqların dibini yoxlayın.

UIP400MTP çoxquyucuqlu lövhə sonikatoru ilə biofilmin ayrılması

Cihazın qurulması və parametrlər:

• UIP400MTP çoxquyucuqlu lövhə sonikatoru
• İş parametrləri: 60% amplituda, 60 saniyə AKTİV / 30 saniyə QEYRİ-AKTİV olan dövri rejim

Mərhələlər:

1. Yuyulmuş mikrotitr lövhəsini UIP400MTP platformasına yerləşdirin.
2. Nümunələri tövsiyə olunan parametrlərlə sonikasiya edin (60% amplituda, 60 saniyə AKTİV, 30 saniyə QEYRİ-AKTİV). Parametrləri bakteriya ştamına uyğunlaşdırın.
3. Biofilmi ayırmaq üçün sonikasiya prosesini başladın. Ultrasəs dalğaları biofilm matrisini parçalayaraq səthə yapışmış bakteriyaları sərbəst buraxır.
4. UIP400MTP ardıcıl ayrılma nəticələri üçün bütün quyucuqlarda bərabər təsir təmin edir.

Analitik mərhələ: ayrılmış Staphylococcus biofilminin biokütləsinin kristal violet (CV) ilə kəmiyyətcə təyini

Tələb olunan materiallar:

• 0,1% kristal violet (CV) məhlulu
• 95% etanol və ya 30% sirkə turşusu (həll etmək üçün)
• 570 nm-də ölçmə apara bilən mikrolövhə oxuyucusu
• Boyama üçün steril mikrotitr lövhələri

Mərhələlər:

1. Boyama lövhəsinin hazırlanması: sonikasiya edilmiş lövhənin hər quyucuğundan 100 µL ayrılmış biofilm suspenziyasını təmiz, steril 96 quyucuqlu mikrotitr lövhəsinin uyğun quyucuqlarına köçürün. Bu, boyama üçün təmiz və vahid mühit təmin edir.
2. Ayrılmış biofilmin boyanması: ayrılmış biofilm suspenziyası olan hər quyucuğa 150 µL 0,1% kristal violet məhlulu əlavə edin. Biofilm suspenziyası ilə kristal violetin bərabər qarışmasını təmin etmək üçün pipetlə ehtiyatla qarışdırın.
3. İnkubasiya: kristal violetin biokütləni effektiv boyamasına imkan vermək üçün lövhəni otaq temperaturunda 15 dəqiqə inkubasiya edin.
4. Yuma: inkubasiyadan sonra biokütləni pozmadan kristal violet məhlulunu quyucuqlardan ehtiyatla kənarlaşdırın. Bağlanmamış boyanı çıxarmaq üçün hər quyucuğu steril fizioloji məhlulla üç dəfə yuyun.
5. Qurutma: lövhəni otaq temperaturunda havada və ya steril hava axını olan şkafda qurumağa qoyun. Qızdırmaqdan çəkinin, çünki bu, nəticələri dəyişə bilər.
6. Həll etmə: bağlanmış kristal violeti həll etmək üçün hər quyucuğa 200 µL 95% etanol (və ya standart laboratoriya təcrübələrindən asılı olaraq 30% sirkə turşusu) əlavə edin. Otaq temperaturunda 10 dəqiqə ərzində pipetləmə və ya lövhəni çalxalama yolu ilə ehtiyatla qarışdırın.
7. Ölçmə: mikrolövhə oxuyucusundan istifadə edərək həll edilmiş kristal violet məhlulunun optik sıxlığını (OD) 570 nm-də ölçün.
8. Məlumatların təhlili: fon boyanmasını nəzərə almaq üçün mənfi nəzarətlərin (TSB olan, lakin bakterial inokulum olmayan quyucuqların) orta OD570 qiymətini təcrübə quyucuqlarının qiymətlərindən çıxın. Məlumatları qeyd edin və təhlil edin.

Qeyd: təkrarlana bilməni təmin etmək üçün hər şərait üzrə təcrübəni üç təkrarda aparın. Təhlükəsizlik və tullantıların utilizasiyası protokollarına əməl edərək kristal violet və etanolla düzgün işləməyi təmin edin.
 

UIP400MTP cihazının əsas üstünlüklərinə qısa baxış:

• Yüksək nümunə emalı məhsuldarlığı: Xüsusi olaraq çoxquyucuqlu lövhələr üçün hazırlanıb və eyni vaxtda çoxsaylı nümunələri emal etməyə imkan verir.
• Ultrasəsin bərabər paylanması: Quyucuqlar arasında bərabər ultrasəs intensivliyi təmin edərək bütün nümunələr üzrə ardıcıl nəticələr verir.
• İstənilən standart lövhədən istifadə edin: UIP400MTP istənilən standart çoxquyucuqlu lövhələri, Petri qablarını və sınaq borusu ştativlərini emal edə bilər. Bahalı, istehsalçıya məxsus xüsusi lövhələr tələb olunmur!
• İstifadəçi üçün rahat interfeys: Qurulması və idarə edilməsi asandır, buna görə laboratoriya məhsuldarlığını artırmaq üçün əla vasitədir. Proqramlaşdırıla bilən parametrlər və avtomatlaşdırma prosesin standartlaşdırılmasını asanlaşdırır!