Minimum İnhibitor Konsentrasiya (MIC) Təhlil Protokolu
Biofilm əsaslı Minimum İnhibitor Konsentrasiya (MİK) analizi, qoruyucu hüceyrədənkənar matriks sayəsində yüksək müqavimət göstərən biofilmlə əlaqəli mikroorqanizmlərə qarşı antimikrob agentlərin effektivliyini qiymətləndirmək üçün vacib bir üsuldur. Bu analizdə mühüm addım, canlılığın dəqiq qiymətləndirilməsi üçün daxil edilmiş hüceyrələrin buraxılması üçün biofilm strukturlarının pozulmasıdır. UIP400MTP çox quyulu boşqab sonikatoru idarə olunan kavitasiya yaratmaq, biofilm hüceyrələrini səmərəli şəkildə ayırmaq və onları vahid asqıya səpmək üçün fokuslanmış ultrasəsdən istifadə etməklə bu prosesi asanlaşdırır. Bu dəqiq və təkrarlana bilən biofilmin pozulması MİK analizlərinin etibarlılığını və ötürmə qabiliyyətini artırır, UIP400MTP-ni biofilm tədqiqatının inkişafında mühüm alətə çevirir.
Biofilm Dekolmanı üçün sonikasiya
Biofilm əsaslı MİK təhlili adətən örtük, koloniyaların sayılması və ya optik sıxlığın ölçülməsi kimi üsullardan istifadə etməklə bakteriyanın canlılığını və ya böyüməsinin qarşısını alır. Sonication biofilm ilə əlaqəli mikroorqanizmlərin antimikrobiyal həssaslığını qiymətləndirərkən biofilm əsaslı MİK analizlərində kritik bir addımdır. Onun əsas funksiyası dəqiq analiz üçün biofilm matrisinə daxil edilmiş hüceyrələrin vahid süspansiyona ayrılması və yayılmasıdır.
Biofilmlər planktonik hüceyrələrlə müqayisədə antimikrobiyal agentlərə əhəmiyyətli dərəcədə daha davamlıdır, bu da dəqiq analiz üçün düzgün ayrılmanı vacib edir. Bu proses zamanı ultrasəs dalğaları idarə olunan kavitasiya yaradır, biofilm matrisini parçalayır və daxili hüceyrələri bərpa mühitində vahid bir süspansiyona buraxır. Bu addım örtük, seyreltmə və koloniyaların sayılması kimi üsullarla biofilmlə yayılmış hüceyrələrin canlılığını dəqiq qiymətləndirməyə imkan verir. Sonikasiya yolu ilə düzgün biofilmin pozulması qalıq matriks komponentlərinin hüceyrələrin qorunmasının qarşısını alır, əks halda antimikrobiyal fəaliyyətin düzgün qiymətləndirilməməsinə səbəb ola bilər. Çox quyulu boşqab sonikatoru UIP400MTP bu məqsəd üçün xüsusilə uyğundur, analiz plitələrinin etibarlı və yüksək məhsuldarlıqla hazırlanmasını təmin etmək üçün dəqiq və təkrarlana bilən sonikasiya şərtləri təklif edir.
UIP400MTP mikroplitə sonikatoru MIC və MBEC analizlərində dəqiq idarə olunan biofilm ayrılması üçün.
Biofilm əsaslı minimum inhibitor konsentrasiya analizlərində sonikasiya niyə lazımdır
Həyat qabiliyyətinin ölçülməsi və hüceyrələrin sayılması üçün tək hüceyrələrin tam və etibarlı bir şəkildə ayrılması və yayılması tələb olunur. UIP400MTP, sağlam analiz nəticələri üçün vahid, zərərsiz biofilm ayrılmasını və hüceyrə dispersiyasını təşviq edir.
- Biofilm mürəkkəbliyi: Biofilmlər mikroorqanizmləri qoruyan və onları antimikrob agentlərə qarşı daha davamlı edən hüceyrədənkənar polimerik maddə (EPS) matrisinə daxil edilmiş strukturlaşdırılmış mikrob icmalarıdır.
- Vahid dispersiya: Biofilmlə yerləşdirilmiş hüceyrələrin həyat qabiliyyətini və ya onların antimikroblara qarşı həssaslığını dəqiq ölçmək üçün əvvəlcə biofilm yerindən çıxarılmalı və homojen süspansiyona parçalanmalıdır.
Biofilm əsaslı Minimum İnhibitor Konsentrasiya Təhlili Protokolu
Minimum İnhibitor Konsentrasiya (MIC) analizi mikroorqanizmlərin görünən artımını maneə törətmək üçün lazım olan antimikrob agentin ən aşağı konsentrasiyasını müəyyən edir. Bu protokol biofilmin pozulması üçün UIP400MTP çox quyulu boşqab sonikatorundan istifadə edərək biofilmlə əlaqəli mikroorqanizmlər üçün nəzərdə tutulmuşdur.
Addım 1: Bakterial İnokulumun Hazırlanması
- Bakterial süspansiyonu hazırlayın:
Bakteriyaları orta loqarifmik fazaya uyğun mühitdə böyüdün.
Standartlaşdırılmış hüceyrə sıxlığına nail olmaq üçün mədəniyyəti seyreltin (məsələn, 0,5 McFarland standartı və ya OD600 ~ 0,1). - Antimikrobiyal məhlulları hazırlayın:
Bir sıra konsentrasiyalar yaratmaq üçün antimikrob agenti uyğun mühitdə seyreltin (məsələn, ikiqat ardıcıl seyreltmələr). - 96 quyu boşqabına tökün:
Son quyu həcmi ~150-200 µL olan standart 96 quyu boşqabının quyularına antimikrob məhlulları əlavə edin.
Böyümə nəzarəti (antibikrob yoxdur) və sterilliyə nəzarət (bakterial inokulum yoxdur) daxildir.
Addım 2: Peg Qapağında Biofilmin əmələ gəlməsi
- Qapağı bağlayın:
Xüsusi dirək qapağını peyvənd edilmiş quyuların üzərinə qoyun, dirəklərin bakterial suspenziyaya tam batmasını təmin edin. - Plitəni inkubasiya edin:
Dirəklərdə biofilmin əmələ gəlməsinə imkan vermək üçün statik şəraitdə müəyyən müddət ərzində (məsələn, 24 saat) müvafiq temperaturda (məsələn, 37°C) inkubasiya edin. - Dırnaqları yuyun:
Bakterial suspenziyadan dirək qapağını çıxarın və boş bir şəkildə bağlanmış planktonik hüceyrələri çıxarmaq üçün steril salin və ya PBS ilə yumşaq bir şəkildə yuyun. - Antimikrobiyal maddələrə məruz qalma:
Qapağı əvvəllər hazırlanmış antimikrobiyal seyreltmələri olan yeni 96 quyu boşqabına köçürün.
Antimikrob agentin biofilmlərə təsir etməsinə imkan vermək üçün statik şəraitdə müəyyən müddətə (məsələn, 24 saat) inkubasiya edin.
Addım 3: Antimikrob məruz qalma
Çox quyulu boşqab sonikatoru UIP400MTP yüksək məhsuldarlıqlı nümunənin hazırlanması üçün
Addım 4: Microplate Sonicator UIP400MTP ilə sonikasiya
Sonikasiya mərhələsi canlılığı qiymətləndirmək üçün biofilmləri dirək qapaqlarından ayırmaq üçün vacibdir. UIP400MTP sonikatoru üçün bu addımları yerinə yetirin:
- Quraşdırmanı hazırlayın:
Təzə 96 quyu boşqabını hər quyuda bərpa mühiti (məsələn, neytrallaşdırıcı bulyon və ya steril böyümə mühiti) ilə doldurun. - Çubuğun qapağını köçürün:
Antimikrobiyal müalicə lövhəsindən dirək qapağını çıxarın.
Qalıq antimikrob agentləri çıxarmaq üçün qapağı steril salin və ya PBS ilə yuyun. - Plitəni sonikatorda yerləşdirin:
Mıxın qapağını bərpa orta boşqabına yapışdırın.
Bərpaedici orta boşqabını UIP400MTP sonikatoruna yerləşdirin, boşqabın təsvir edilmiş təlimatda olduğu kimi mərkəzdə və sabit oturmasını təmin edin. - Sonikasiya parametrlərini tənzimləyin:
UIP400MTP-də sonikasiya parametrlərini təyin edin (parametrlər biofilmə uyğunlaşdırıla bilər):
Amplituda: 70-100%.
Sonikasiya müddəti: sikl rejimində 1-3 dəqiqə (biofilm strukturuna əsasən tənzimləyin). - Sonikasiya:
Sonikasiya prosesinə başlayın. Ultrasəs dalğaları biofilm matrisini pozacaq və hüceyrələri bərpa mühitinə çıxaracaq. - Prosesə nəzarət edin:
Quyularda nümunə temperaturuna nəzarət etmək üçün qoşula bilən temperatur sensorundan istifadə edin. UIP400MTP soyutma üçün laboratoriya soyuducuya qoşula bilər. - Post-Sonication İdarəetmə:
Tərkibində ayrılmış biofilmləri olan bərpa mühitini dərhal sonrakı analiz üçün təzə steril boşqaba köçürün.
(A) Biofilmin əmələ gəlməsi, hüceyrələrin bərpası və MİK və MBEC-in təyini üçün istifadə edilən 2% qlükoza ilə TSB olan lövhə; (B) Stafilokok biofilmlərinin əmələ gəlməsi üçün sancaqlar olan qapaq.
Sancaqlar üzərində əmələ gələn biofilm hüceyrələri sonikasiya (Hielscher Ultrasəs Texnologiyası) ilə hüceyrələrin bərpası üçün təzə mədəniyyət mühiti olan 96 quyuluq boşqablarda 5 dəqiqə ərzində yerindən çıxarıldı.
(Şəkil və tədqiqat: ©de Oliveira et al., 2016)
Addım 4: Həyat qabiliyyətinin qiymətləndirilməsi
Plaka və kulturadan ayrılmış biofilmlər:
- Koloniya əmələ gətirən vahidləri (CFU) sadalamaq üçün aqar üzərinə bərpaedici mühit və boşqabın ardıcıl seyreltmələrini həyata keçirin.
- MİK-i qiymətləndirin:
MİK-i bərpa mühitində görünən mikrob artımını tamamilə maneə törədən ən aşağı antimikrob konsentrasiyası kimi müəyyənləşdirin.
MİK Minimum İnhibitor Konsentrasiyası: Mikrotitr lövhəsinin nümunəsi və mikrodilüsyon nəticələrinin şərhi.
(Tədqiqat və şəkil: ©Jaskiewicz et al. 2019)
Dizayn, İstehsalat və Konsaltinq – Keyfiyyətli Almaniya istehsalı
Hielscher ultrasəs cihazları ən yüksək keyfiyyət və dizayn standartları ilə tanınır. Sağlamlıq və asan əməliyyat ultrasəs aparatlarımızın sənaye obyektlərinə rahat inteqrasiyasına imkan verir. Kobud şərtlər və tələbkar mühitlər Hielscher sonicatorları tərəfindən asanlıqla idarə olunur.
Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikatlı bir şirkətdir və ən müasir texnologiya və istifadəçi dostu olan yüksək performanslı ultrasəs cihazlarına xüsusi diqqət yetirir. Əlbəttə ki, Hielscher ultrasəs cihazları CE-yə uyğundur və UL, CSA və RoHs tələblərinə cavab verir.
96 quyu boşqablarda və analiz lövhələrində nümunənin hazırlanmasını sürətləndirin UIP400MTP çox quyulu boşqab sonikatorundan istifadə etməklə
Ədəbiyyat / İstinadlar
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Tez-tez soruşulan suallar
MIC Testi nədir?
Minimum İnhibitor Konsentrasiya (MIC) analizi mikroorqanizmin görünən böyüməsini maneə törətmək üçün tələb olunan antimikrob agentin ən aşağı konsentrasiyasını təyin etmək üçün istifadə edilən standartlaşdırılmış testdir. Bu, adətən mikroorqanizmlərin antimikrob agentin ardıcıl seyreltmələrinə məruz qaldığı bulyon mikrodilüsyonu və ya agar seyreltmə üsullarından istifadə etməklə həyata keçirilir. MİK analizləri antimikrobiyal effektivliyi qiymətləndirmək, klinik müalicəyə rəhbərlik etmək və həm planktonik, həm də biofilmlə əlaqəli mikroorqanizmlərdə müqavimət səviyyələrini qiymətləndirmək üçün vacibdir.
Biofilm əsaslı Minimum İnhibitor Konsentrasiya Təhlili ilə MBIC Təhlili arasındakı fərq nədir?
Biofilm əsaslı Minimum İnhibitor Konsentrasiya (MIC) və Minimum Biofilm İnhibitor Konsentrasiyası (MBIC) təhlili bir-biri ilə əlaqəlidir, lakin məqsədləri və metodologiyası ilə fərqlənir.
Biofilm əsaslı MİK analizi planktonik bakteriyalara deyil, biofilmlə əlaqəli hüceyrələrə fokuslanaraq görünən biofilmin böyüməsini və ya canlılığını maneə törətmək üçün lazım olan antimikrob agentin ən aşağı konsentrasiyasını qiymətləndirir. Bunun əksinə olaraq, MBIC analizi əvvəlcədən əmələ gələn biofilmləri müalicə etməkdənsə, antimikrob agentin biofilm əmələ gəlməsinin qarşısını almaq qabiliyyətini xüsusi olaraq ölçür. Hər iki analiz biofilmlə əlaqəli bakteriyalarla məşğul olsa da, biofilm əsaslı MİK analizi müalicəyə müraciət edir və MBIC təhlili profilaktikanı vurğulayır və onları biofilmlərə qarşı antimikrob effektivliyin öyrənilməsi üçün tamamlayıcı vasitələrə çevirir.
MİK analizlərində hansı biofilmlərdən istifadə olunur?
Mikrob biofilmləri və planktonik hüceyrələr, müxtəlif şəraitlərdə mikrob əleyhinə effektivliyi öyrənmək üçün Minimum İnhibitor Konsentrasiya (MIC) analizlərində istifadə olunur.
- Planktonik hüceyrələr:
Planktonik hüceyrələr ənənəvi MİK analizləri üçün standart model kimi xidmət edən sərbəst üzən, tək mikrob hüceyrələridir. Ümumi mikroorqanizmlərə Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus və Candida albicans daxildir. Bu analizlər sərbəst yaşayan hüceyrələrin böyüməsini maneə törətmək üçün tələb olunan MİK-i müəyyən edir və ilkin antimikrob skrininq üçün vacibdir. - Biofilmlə əlaqəli hüceyrələr:
Biofilm hüceyrələri hüceyrədənkənar matrisdə yerləşmiş mikroorqanizmlərdir ki, bu da onların antimikroblara qarşı müqavimətini əhəmiyyətli dərəcədə artırır. Biofilm MİK analizlərinə tez-tez aşağıdakılar daxildir:- Qram-mənfi bakteriyalar: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa və Klebsiella pneumoniae, infeksiyalarda və sənaye şəraitində biofilm əmələ gəlməsi ilə tanınır.
- Qram-müsbət bakteriyalar: Staphylococcus aureus (MRSA daxil olmaqla), Staphylococcus epidermidis və Enterococcus faecalis, adətən cihazla əlaqəli infeksiyalara səbəb olur.
- Göbələklər: Candida albicans və əlaqəli növlər, biofilmlə əlaqəli göbələk infeksiyalarında vacibdir.
- Qarışıq növlü biofilmlər: Bunlar bəzən xroniki yaralarda və ya sənaye biofoulingində olanlar kimi təbii polimikrob biofilmləri təkrarlamaq üçün istifadə olunur.
Planktonik hüceyrələr və biofilmlə əlaqəli hüceyrələr üçün MİK dəyərlərini müqayisə etməklə tədqiqatçılar biofilmlərin artan müqavimətini qiymətləndirə və bu daha möhkəm mikrob icmalarına qarşı təsirli agentləri müəyyən edə bilərlər.
MIC və MBEC arasındakı fərq nədir?
Minimum İnhibitor Konsentrasiya (MIC) biofilmin əmələ gəlməsinin qarşısını almaq üçün tələb olunan antimikrob agentin ən aşağı konsentrasiyasıdır, Minimum Biofilm Eradikasiya Konsentrasiyası (MBEC) isə müəyyən edilmiş biofilmin məhv edilməsi üçün lazım olan ən aşağı konsentrasiyadır. MIC biofilmin qarşısının alınmasına diqqət yetirir, MBEC isə yetkin biofilmlərə qarşı müalicənin effektivliyini qiymətləndirir.
MBEC Təhlilləri üçün hansı Plitələr adətən istifadə olunur?
MBEC analizləri üçün adətən istifadə edilən mikrotiter plitələr adətən polistirol və ya polipropilendən hazırlanmış 96 quyulu lövhələrdir. Bu materiallar biofilmin formalaşması üçün uyğun bir səth təmin edir və analiz zamanı sınaqdan keçirilmiş antimikrob agentlərə kimyəvi cəhətdən davamlıdır. Polistirol plitələr, spektrofotometrik və ya flüoresan əsaslı ölçmələr kimi aşağı axın analizləri üçün əlverişli olan optik aydınlığına görə geniş şəkildə seçilir. Bu plitələrin dizaynına çıxarıla bilən dirək qapaqları daxildir ki, bunlar analiz üçün vacibdir, çünki biofilmlər böyümə mühiti olan quyulara batırılmış dirəklərdə əmələ gəlir. MBEC analiz protokoluna uyğun olanlar kimi standartlaşdırılmış lövhələr UIP400MTP sonikatoru və ya digər emal avadanlığı ilə reproduktivliyi və uyğunluğu təmin etmək üçün xüsusi olaraq hazırlanmışdır.
PEG-Qapaq Plitələr nədir?
PEG-qapaq plitələri, qapağın hər bir quyuya uzanan kiçik polietilen qlikol (PEG) dirəkləri və ya sancaqları ilə təchiz olunduğu xüsusi çox quyulu boşqab sistemləridir. Bu dirəklər, real biofilmin böyüməsini təqlid edərək, idarə olunan şəraitdə mikrob biofilminin formalaşması üçün bir səth təmin edir. Dizayn, quyularda böyümə mühiti və ya antimikrob agentləri olduğu halda, biofilmlərin dirəklərdə inkişaf etməsinə imkan verir, MBEC, MBIC və MIC analizləri kimi müalicələrə biofilmin həssaslığının yüksək məhsuldarlıq testinə imkan verir.
Hüceyrə kazıma ilə müqayisədə ultrasəs biofilmin yerindən çıxarılmasının üstünlüyü nədir?
Ultrasonik biofilmin yerindən çıxarılması, biofilmlərin səthlərdən çıxarılması üçün qeyri-invaziv, vahid və yüksək effektiv üsul təmin etməklə hüceyrə qırıntıları üzərində əhəmiyyətli bir üstünlük təqdim edir. Uyğun olmayan və əsas səthə və ya hüceyrələrə zərər verə bilən qırıntıdan fərqli olaraq, ultrasəs dalğaları biofilm matrisinə nüfuz edərək, bitişik strukturların bütövlüyünü pozmadan onu parçalayır. Bu üsul təkrarlanabilirliyi təmin edir, çirklənmə riskini minimuma endirir və mikrobioloji tədqiqatlar və ya tibbi cihaz sınaqları kimi dəqiq biofilmin çıxarılması tələb olunan tətbiqlər üçün xüsusilə effektivdir. UIP400MTP Sonicatorun hüceyrə qırıntılarını necə üstün tutduğunu oxuyun!
Hielscher Ultrasonics yüksək performanslı ultrasəs homogenizatorları istehsal edir laboratoriya üçün sənaye ölçüsü.