Protein granulalarining ultratovushli erishi
Proteomikada namunalarni tayyorlash hech qachon kichik tafsilot emas. Bu identifikatsiya aniqligi, miqdoriy aniqlash ishonchliligi va takrorlanuvchanlik asosidir. Oqsil namunalarini tayyorlashdagi eng doimiy muammolardan biri bu yog'ingarchilik yoki konsentratsiya bosqichlaridan keyin oqsil granulalarini samarali qayta eritishdir. Aynan shu yerda oqsil granulalarini ultratovush orqali erishi tobora muhim ahamiyat kasb etmoqda. Nazorat ostidagi sonikatsiyani qo'llash orqali laboratoriyalar oqsillarni qayta tiklashni yaxshilashi, granulalarning erishini tezlashtirishi va quyi oqimdagi massa spektrometriyasi va biokimyoviy tahlil uchun namunalarni samaraliroq tayyorlashi mumkin.
Oqsilning erishi: Nima uchun zamonaviy proteomikada sonikatsiya muhim
Oqsil granulalari ko'pincha aseton, etanol, metanol-xloroform, ammoniy sulfat yoki TCA cho'ktirish paytida hosil bo'ladi. Ushbu ish oqimlari ifloslantiruvchi moddalarni olib tashlash, oqsillarni konsentratsiyalash va tahlil qilishdan oldin ekstraktlarni tozalash uchun keng qo'llaniladi. Biroq, cho'ktirish tugallangandan so'ng, hosil bo'lgan granulani qayta eritish qiyin bo'lishi mumkin. Zich agregatlar, gidrofob domenlar, membrana bilan bog'liq oqsillar va kuchli o'zaro ta'sir qiluvchi oqsil komplekslari ko'pincha an'anaviy aralashtirish yoki vortekslashga qarshilik ko'rsatadi. To'liq bo'lmagan eruvchanlik namunalarning yo'qolishiga, oqsillarning noto'g'ri ko'rinishiga va tajribalarda yomon takrorlanishga olib kelishi mumkin.
Sonikatsiya aynan shu muammoni hal qiladi. Suyuq muhitda mexanik energiya hosil qilish orqali sonikatsiya ixcham granulalar tuzilmalarini buzadi, bufer penetratsiyasini rag'batlantiradi va agregatsiyalangan materialni eritmaga tarqatadi. Natijada oqsillarning tezroq va ko'pincha to'liqroq tiklanishi kuzatiladi, bu esa cheklangan namunalar, murakkab lizatlar yoki qiyin proteomik nishonlar bilan ishlashda ayniqsa qimmatlidir.
UIP400MTP mikroplastinkali sonikator oqsil ekstraktsiyasi va granulalarni eritish uchun
Nima uchun oqsil granulalarini eritish qiyin
Oqsillarni cho'ktirish samarali hisoblanadi, chunki u oqsillarni eritmadan chiqarib yuboradi. Biroq, cho'ktirishni foydali qiladigan jarayon granulalarni qayta tiklash muammosini ham keltirib chiqaradi. Granulalarga bo'lingandan so'ng, oqsillar zich joylashishi va qisman denaturatsiyalanishi mumkin. Gidrofobik o'zaro ta'sirlar kuchayishi, molekulalararo bog'lanish kuchayishi va ba'zi oqsillar tuzlar, lipidlar, nuklein kislotalar yoki boshqa matritsa komponentlarini ushlab qolishi mumkin. Kuchli eruvchanlik buferi ishlatilganda ham, passiv qayta suspenziya ko'pincha sekin va to'liq bo'lmaydi.
Proteomikada bu muhim, chunki granulalarning to'liq eritilmaganligi nafaqat umumiy hosilni kamaytiradi. Bu ma'lum oqsil sinflarini, ayniqsa membrana oqsillarini, strukturaviy oqsillarni yoki agregatsiyaga moyil turlarni tanlab chiqarib tashlashi mumkin. Bu shuni anglatadiki, yakuniy analitik natija endi asl namunaning haqiqiy tarkibini aks ettirmasligi mumkin. Yuqori aniqlikdagi proteomikada, ko'plikdagi yoki translyatsiyadan keyingi modifikatsiyadagi nozik farqlar biologik jihatdan hal qiluvchi bo'lishi mumkin bo'lgan hollarda, bunday tayyorlash tarafkashligi jiddiy cheklovdir.
Sonikatsiya oqsil granulalarining eruvchanligini qanday yaxshilaydi
Ultratovush bilan ishlov berish namunaga yuqori chastotali mexanik energiyani kiritish orqali eruvchanlikni yaxshilaydi. Bu energiya ixcham granula materialini parchalashga yordam beradi va eruvchanlik buferi va ko'milgan oqsillar o'rtasidagi aloqani oshiradi. Jarayon faqat diffuziya va qo'lda aralashtirish o'rniga, granulani eritish osonroq bo'lgan kichikroq fraktsiyalarga faol ravishda tarqatadi.
Amaliy ta'sir sezilarli. Sonikatsiya quyidagilarni amalga oshirishi mumkin:
- zich yoki o'jar oqsil granulalarining erishini tezlashtiradi
- yomon eriydigan va agregatlangan oqsillarning tiklanishini yaxshilaydi
- proteomika ish oqimlarida tayyorgarlik vaqtini qisqartiring
- hazm qilish va tahlil qilish uchun ko'proq bir hil namunalarni qo'llab-quvvatlash
Bu kuchaytirilgan dispersiya, ayniqsa, granulalar karbamid, tiourea, yuvish vositalari, xaotroplar yoki proteomikada keng qo'llaniladigan boshqa reagentlar bo'lgan buferlarda qayta suspenziyalanganda foydalidir. Sonikatsiya bu komponentlarga granulaga samaraliroq yetib borishga va uni eritishga yordam beradi, natijada namunaviy eritma bir xil bo'ladi.
Proteomikada ultratovushli eruvchanlikning afzalliklari
Ultratovushli eruvchanlikning asosiy afzalligi shundaki, u tez-tez kam baholanadigan tayyorgarlik bosqichini boshqariladigan va samarali jarayonga aylantiradi. Proteomikada bu to'g'ridan-to'g'ri analitik oqibatlarga olib keladi.
- Birinchidan, yaxshilangan eruvchanlik fermentativ hazm qilishga kiradigan namunaning to'liq oqsil populyatsiyasini ifodalash ehtimolini oshiradi. Masalan, tripsin hazm bo'lishi oqsillarning yetarli darajada ochilishiga va eritmada mavjud bo'lishiga bog'liq. Agar granulaning qismlari erimagan holda qolsa, bu oqsillar peptid hosil bo'lishidan va shuning uchun aniqlashdan samarali ravishda chiqarib tashlanadi.
- Ikkinchidan, ultratovush yordamida qayta ishlab chiqarishni yaxshilash mumkin. Qo'lda granulalarni qayta suspenziyalash, ayniqsa, turli operatorlar, granulalar o'lchamlari yoki namunaviy matritsalar ishtirok etganda, o'zgaruvchan bo'ladi. Nazorat ostidagi ultratovush bilan ishlov berish namunaga qo'llaniladigan jismoniy energiyani standartlashtiradi, bu preparatlar orasidagi o'zgaruvchanlikni kamaytirishi va quyi oqimdagi LC-MS yoki gel asosidagi ish oqimlarida izchillikni yaxshilashi mumkin.
- Uchinchidan, ultratovush tekshiruvi kam kirishli va qimmatli namunalar uchun juda qimmatlidir. Klinik proteomika, biomarkerlarni kashf etish, hujayra madaniyati bo'yicha tajribalar va to'qimalarni o'rganish ko'pincha cheklangan materiallarga tayanadi. Eritma paytida har qanday oqsil yo'qotilishi namunaning axborot qiymatini pasaytiradi. Samarali ultratovush qayta eritish iloji boricha ko'proq analitni saqlashga yordam beradi.
- Nihoyat, ultratovush tekshiruvi ish jarayonining tezligini qo'llab-quvvatlaydi. Bir nechta namunalarni qayta ishlaydigan proteomika laboratoriyalari mustahkam, vaqtni tejaydigan tayyorlash usullariga muhtoj. Tez va to'liq eriydigan granula nafaqat qulay; u kechikishlarni kamaytiradi, xatolarni qayta ishlash xavfini kamaytiradi va o'tkazish qobiliyatini yaxshilaydi.
Sonikatsiya va an'anaviy qayta suspenziya usullari
An'anaviy granulalarni qayta suspenziyalash usullari odatda pipetkalash, aralashtirish, vortekslash, uzoq muddatli inkubatsiya yoki takroriy isitish bosqichlarini o'z ichiga oladi. Bu usullar bo'shashgan granulalar uchun ish berishi mumkin bo'lsa-da, ular ko'pincha juda ixcham yoki hidrofob oqsil materiali bilan bog'liq muammolarga duch kelishadi. Faqat mexanik aralashtirish granulalar tuzilishini to'liq parchalab tashlamasligi va ko'rinadigan zarrachalar yoki ko'rinmas erimaydigan fraktsiyalarni qoldirishi mumkin.
Sonikatsiya yanada faol va maqsadli yondashuvni ta'minlaydi. Sekin bufer diffuziyasiga bog'liq bo'lish o'rniga, u granulani jismonan buzadi va tez gomogenizatsiyani rag'batlantiradi. Bu tegishli qayta suspenziya buferiga bo'lgan ehtiyojni bartaraf etmaydi, lekin bu buferning ish faoliyatini sezilarli darajada yaxshilaydi.
Faqat qo'lda bajariladigan usullar bilan taqqoslaganda, ultratovushli eruvchanlik ko'pincha yaxshiroq jarayonni boshqarish, yuqori samaradorlik va talabchan proteomika qo'llanmalari uchun yaxshilangan moslikni taklif etadi. Ham analitik sifat, ham operatsion ishonchlilikni qidiradigan laboratoriyalar uchun bu ultratovushni jozibador tanlovga aylantiradi.
Ultrasonik oqsil pelletini eritish uchun eng yaxshi foydalanish holatlari
Ultrasonik eritma ayniqsa quyidagilarni o'z ichiga olgan ish oqimlarida foydalidir:
- massa spektrometriyasidan oldin oqsil yog'inlari,
- hujayra lizatlari yoki to'qima ekstraktlaridan granulalarni qayta tiklash,
- membranaga boy yoki agregatsiyaga moyil oqsillarni tiklash,
- va takrorlanuvchanlik muhim bo'lgan miqdoriy proteomika uchun namuna tayyorlash.
Bu, shuningdek, granulalar saqlangan, juda kuchli quritilgan yoki murakkab biologik matritsalardan ishlab chiqarilgan hollarda ham juda muhimdir. Bunday hollarda, passiv qayta suspenziyalash ayniqsa samarasiz bo'lib qolishi mumkin, ultratovush yordamida esa qo'lda kamroq aralashuv bilan namunadan foydalanish qulayligini tiklashga yordam beradi.
VialTweeter sonikatori 10 ta namunani bir vaqtning o'zida sonikatsiya qilish uchun, masalan, oqsilni ajratib olish va eritish uchun
Proteinni eritish ish oqimingiz uchun eng yaxshi sonikatorni toping!
Qimmatbaho namunalar, past kirishli materiallar yoki yuqori o'tkazuvchanlikdagi proteomika bilan ishlaydigan laboratoriyalar uchun Hielscher portfeli ish jarayoniga aniq mos keladigan bir nechta sonikatsiya formatlarini taklif etadi.
Hielscher zond tipidagi sonikatori, VialTweeter Multi-Tube Sonicator yoki UIP400MTP Microplate Sonicator ni tanlashingizdan qat'iy nazar – Har bir ultrasonikator modeli bir xil asosiy afzallikni baham ko'rish bilan birga turli xil namunalarni tayyorlash stsenariylarini ko'rib chiqadi: samarali va boshqariladigan namunalarni qayta ishlash uchun takrorlanadigan ultratovush energiyasi.
Zond tipidagi sonikatorlar
UP200Ht kabi ultratovushli zondlar, ayniqsa, individual namunalarni to'g'ridan-to'g'ri sonikatsiya qilish uchun juda mos keladi. Proteomika laboratoriyalari uchun UP200Ht oqsil granulalari kichik va o'rta hajmlarda intensiv qayta suspenziyaga muhtoj bo'lganda, ayniqsa usulni boshqarish va takrorlanuvchanlik muhim bo'lgan hollarda kuchli tanlovdir. To'g'ridan-to'g'ri zondli sonikatsiya ixcham granula materialini tezda buzishi va eruvchanlik buferlariga aks holda qisman erimaydigan oqsillarga kirishga yordam berishi mumkin.
Barcha zond tipidagi sonikatorlarga umumiy nuqtai nazar!
VialTweeter ko'p quvurli sonikator
Bir nechta yopiq flakonlar bir xil sharoitlarda qayta ishlanishi kerak bo'lgan hollarda, Multi-Tube Sonicator VialTweeter aniq afzalliklarga ega. VialTweeter steril sharoitlarda bir nechta yopiq flakonlarni sonikatsiya qilish orqali kichik hajmlarni intensiv sonikatsiya qilish imkonini beradi. Bir xil sharoitlarda bir nechta sinov naychalarida bir vaqtning o'zida namunalarni tayyorlash, shuningdek, yopiq flakonda qayta ishlash paytida o'zaro ifloslanish, namunalarni yo'qotish va aerozol hosil bo'lish xavfini kamaytirish VialTweeterni namunalarni tayyorlash uchun ishonchli vositaga aylantiradi. Proteomika uchun bu bir nechta replikatsiyalardan yoki klinik namunalardan olingan qimmatli granulalarni qayta ishlashda juda muhimdir, bu yerda naychalar orasidagi izchillik juda muhimdir.
VialTweeter haqida ko'proq bilib oling!
UIP400MTP mikroplastinkali sonikator
Yuqori samarali laboratoriyalar uchun UIP400MTP mikroplastinka sonikatori sonikatsiyaning afzalliklarini plastinka asosidagi ish oqimlariga kengaytiradi. UIP400MTP 96 quduqli formatlarni o'z ichiga olgan standart plitalar bo'ylab bir xil ultratovushli ishlov berish uchun mikroplastinka va ko'p quduqli plastinka sonikatori sifatida ishlaydi va proteomika, diagnostika va dori vositalarini kashf etish kabi sohalarda avtomatlashtirilgan namunalarni tayyorlash uchun yaroqliligini ta'kidlaydi. Platforma ko'plab namunalarni bir vaqtning o'zida qayta ishlash uchun mo'ljallangan bo'lib, o'zaro ifloslanish xavfini kamaytirish, mehnat zichligini pasaytirish, namunalarni tiklashni yaxshilash va avtomatlashtirilgan ish oqimlariga integratsiyalashish kabi afzalliklarga ega.
Amaliy proteomikada bu granulalarni eritish, hujayra lizisi, ekstraktsiya va shunga o'xshash tayyorlash bosqichlarini ancha samaraliroq miqyoslash mumkinligini anglatadi. Namunalarni birma-bir qayta ishlash o'rniga, laboratoriyalar butun plastinkalarni izchil energiya kiritish bilan ultratovush yordamida aniqlay oladi. Bu ish oqimlari o'tkazuvchanlikni analitik qat'iylik bilan birlashtirishi kerak bo'lganda, masalan, skrining tadqiqotlarida, miqdoriy proteomikada yoki standartlashtirilgan namuna tayyorlash quvurlarida qimmatlidir. Shuning uchun UIP400MTP shunchaki qulaylik vositasi emas; bu avtomatlashtirish, takrorlanuvchanlik va mustahkam yuqori o'tkazuvchanlikdagi proteomikaga kengroq tendentsiyani qo'llab-quvvatlaydigan platformadir.
UIP400MTP mikroplastinka sonikatori haqida ko'proq bilib oling!
Sovutgich kamerasida VialTweeter – sonikatsiya paytida boshqariladigan jarayon parametrlari.
Yuqori samarali oqsil ekstraktsiyasi va eruvchanligi UIP400MTP mikroplastinka sonikatori bilan
Dizayn, ishlab chiqarish va konsalting – Germaniyada ishlab chiqarilgan sifat
Hielscher ultrasonikatorlari eng yuqori sifat va dizayn standartlari bilan mashhur. Mustahkamlik va qulay foydalanish ultratovush qurilmalarimizni sanoat ob'ektlariga silliq integratsiya qilish imkonini beradi. Qo'pol sharoitlar va talabchan muhit Hielscher ultrasonikatorlari tomonidan osonlik bilan hal qilinadi.
Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatiga ega kompaniya bo'lib, eng zamonaviy texnologiya va foydalanuvchilarga qulaylik bilan ajralib turadigan yuqori samarali ultratovush apparatlariga alohida e'tibor beradi. Albatta, Hielscher ultrasonikatorlari Idoralar talablariga javob beradi va UL, CSA va RoHs talablariga javob beradi.
Adabiyot / Adabiyotlar
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Susana Jorge, Kevin Pereira, Hugo López-Fernández, William LaFramboise, Rajiv Dhir, Javier Fernández-Lodeiro, Carlos Lodeiro, Hugo M. Santos, Jose L. Capelo-Martínez (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, Volume 206, 2020.
- Lindemann C, Lupilova N, Müller A, Warscheid B, Meyer HE, Kuhlmann K, Eisenacher M, Leichert LI. (2013): Redox proteomics uncovers peroxynitrite-sensitive proteins that help Escherichia coli to overcome nitrosative stress. Journal of Biological Chemistry 288(27); 2013. 19698-714.
- Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.
tez-tez so'raladigan savollar
Nima uchun ultratovushli vannalar oqsilni eritish uchun mos emas?
Ultratovushli vannalarda, sonikatsiyaning ish printsipi bo'lgan kavitatsiya, namunalarni turli xil sonikatsiya muolajalariga juda notekis taqsimlashda sodir bo'ladi. Ultratovushli vannadagi namuna naychalarining joylashishiga qarab, har bir namunaga turli intensivliklar ta'sir qiladi. Proteomika taqqoslashga bog'liq. Agar bitta granula to'liq erimagan bo'lsa, boshqasi to'liq qayta suspenziyalangan bo'lsa, natijada olingan ma'lumotlar haqiqiy biologiyani emas, balki tayyorlash tarafkashligini aks ettirishi mumkin. Ultratovushli vannalardan farqli o'laroq, VialTweeter yoki Microplate Sonicator UIP400MTP kabi kontaktsiz sonikatorlar bir nechta namunalarni mos keladigan ultratovush sharoitida parallel ravishda qayta ishlashga imkon berish orqali ko'proq standartlashtirilgan ishlov berishni qo'llab-quvvatlaydi, bu esa tajribalar davomida takrorlanuvchanlikni yaxshilashga yordam beradi. Bu, ayniqsa, biomarker tadqiqotlarida, qiyosiy proteomikada va bir nechta biologik yoki texnik replikatsiyalar bilan ish oqimlarida foydalidir.
Proteomikada eng keng tarqalgan tahlillar qaysilar?
Proteomikada eng keng tarqalgan tahlillar oqsil miqdorini aniqlash tahlillari va namunalarni tayyorlash va tahlil qilishda qo'llaniladigan oqsilni tavsiflash usullaridir. Tez-tez ishlatiladigan tahlillarga Bradford tahlili, BCA tahlili, Lowry tahlili va oqsil konsentratsiyasini o'lchash uchun 280 nm da UB yutilishini kiritish mumkin. Kengroq proteomika ish oqimlarida SDS-PAGE, Western blotting, ELISA, gel ichidagi hazm qilish va mass-spektrometriyaga asoslangan tahlillar ham oqsil miqdori, sofligi, molekulyar og'irligi va o'ziga xosligini baholash uchun keng qo'llaniladi.
Coomassie Brilliant Blue nima?
Coomassie Brilliant Blue oqsil fanida gellardagi oqsillarni bo'yash va kolorimetrik oqsil miqdorini aniqlash uchun keng qo'llaniladigan trifenilmetan bo'yog'i hisoblanadi. U asosan asosiy va aromatik aminokislota qoldiqlariga, ayniqsa argininga bog'lanadi va oqsillarga bog'langanda spektral siljishga uchraydi. Bu xususiyat uni elektroforezdan keyin oqsillarni vizualizatsiya qilish uchun ham, Bredford oqsil tahlili uchun ham foydali qiladi.
Bradford tahlili qanday ishlaydi?
Bradford tahlili oqsil namunasini Coomassie Brilliant Blue bo'yog'i bilan kislotali sharoitda aralashtirish orqali ishlaydi. Bo'yoq oqsillarga bog'langanda, uning yutish maksimal qiymati taxminan 465 nm dan 595 nm gacha o'zgaradi, bu esa rangning qizg'ish-jigarrangdan ko'k ranggacha o'zgarishiga olib keladi. 595 nm da yutishning oshishi belgilangan diapazonda oqsil konsentratsiyasiga mutanosib bo'lib, odatda sigir zardobidagi albumin bilan tayyorlangan standart egri chiziq bilan taqqoslash orqali miqdoriy aniqlash imkonini beradi.
Ko'p quduqli plitalardagi namunalarning fokuslangan sonikatsiyasi
Hielscher Ultrasonics kompaniyasi yuqori samarali ultratovushli homogenizatorlarni ishlab chiqaradi laboratoriya uchun sanoat hajmi.