Fosfoproteomika uchun sonikatsiya yordamida oqsil ekstrakti

Zamonaviy hayot fanlarida fosfoproteomika hujayra signalizatsiya yo'llarini dekodlash va tizim darajasida kasallik mexanizmlarini tushunish uchun asosiy texnologiya sifatida paydo bo'ldi. Fosforillanish muhim biologik funktsiyalarni boshqarganligi sababli – ferment faolligidan oqsil-oqsil o'zaro ta'sirigacha – uning aniq o'lchovi ham fundamental tadqiqotlar, ham translyatsion tibbiyot uchun juda muhimdir. Mass-spektrometriyadagi so'nggi yutuqlar bitta tajribada o'n minglab fosforillanish hodisalarini aniqlash imkonini berdi, bu esa mustahkam, kengaytiriladigan va takrorlanadigan namunalarni tayyorlash ish jarayonlariga ehtiyojni ta'kidlaydi.
Ushbu sohadagi eng ta'sirli yutuqlar qatoriga ultratovush yordamida oqsil ekstraksiyasining joriy etilishi kiradi, bu esa namunalar sifatini, o'tkazuvchanligini va takrorlanuvchanligini sezilarli darajada oshiradi. VialTweeter va UIP400MTP kabi ultratovush texnologiyalari endi laboratoriyalarning katta namunaviy kohortalarni, ayniqsa yuqori o'tkazuvchanlikdagi fosfoproteomikada qanday boshqarishini qayta belgilamoqda.

Fosfoproteomikada samarali namuna tayyorlashning ilmiy ahamiyati

Oqsil fosforillanishi inson hujayralaridagi oqsillarning aksariyat qismiga ta'sir qiluvchi juda dinamik va qaytariladigan post-translyatsion modifikatsiyadir. U oqsil tuzilishini, lokalizatsiyasini va o'zaro ta'sir tarmoqlarini tartibga soladi va uning disregulyatsiyasi saraton va neyrodegeneratsiya kabi kasalliklarda ishtirok etadi.
Biroq, fosfoproteomik tahlil noyob texnik qiyinchiliklarni keltirib chiqaradi. Fosforlangan peptidlar ko'pincha kam miqdorda bo'ladi va ehtiyotkorlik bilan boyitishni va yuqori samarali namunalarni tayyorlashni talab qiladi. Oqsilni ajratib olish yoki hazm qilish paytida har qanday samarasizlik signal yo'qolishiga, yomon takrorlanuvchanlikka va fosfosit qoplamasining to'liq emasligiga olib kelishi mumkin.
Bu yerda sonikatsiya juda muhim bo'lib qoladi.

Nima uchun sonikatsiya oqsil ekstraktsiyasini o'zgartirmoqda

Ultratovush tekshiruvi hujayralar va to'qimalarni mexanik ravishda yo'q qilish uchun yuqori intensivlikdagi ultratovush to'lqinlaridan foydalanadi, bu esa hujayralar, to'qimalar, biosuyuqliklar va hujayradan tashqari vesikulalardan oqsilni samarali ravishda ajratish imkonini beradi. An'anaviy lizis texnikalari bilan taqqoslaganda, ultratovush tekshiruvi bir qator aniq afzalliklarni taqdim etadi:

• Birinchidan, bu hujayralarning tez va bir xilda buzilishini ta'minlaydi, bu esa vaqtinchalik fosforillanish holatlarini saqlab qolish uchun ayniqsa muhimdir. Fosfoproteomikada hatto kichik kechikishlar yoki to'liq bo'lmagan lizis ham signalizatsiya profillarini o'zgartirishi mumkin, bu esa tez va takrorlanadigan ekstraksiyani zarur qiladi.
• Ikkinchidan, ultratovush yordamida oqsil hosil bo'lishi va eruvchanligi yaxshilanadi, ayniqsa zich to'qimalar yoki membranaga boy hujayralar kabi lizis qilish qiyin bo'lgan namunalar uchun. Bu to'g'ridan-to'g'ri quyi oqimda yaxshiroq hazm bo'lish va fosfopeptidlarning tiklanishiga olib keladi.
• Uchinchidan, ultratovushli ishlov berish o'z-o'zidan kengaytirilishi mumkin. VialTweeter kabi qurilmalar bir nechta muhrlangan naychalarni bir vaqtning o'zida ultratovush bilan ishlov berish imkonini beradi, bu esa namunalar bo'ylab bir xil ishlov berish sharoitlarini ta'minlaydi. Bu qo'lda ishlov berish natijasida yuzaga keladigan o'zgaruvchanlikni yo'q qiladi.
• UIP400MTP yanada yuqori o'tkazuvchanlik talablari uchun katta texnologik sakrashni ifodalaydi. U butun mikroplitalar yoki naycha tokchalarini, shu jumladan avtosampler flakonlarini to'g'ridan-to'g'ri ultratovush bilan ulash imkonini beradi, bu esa yuzlab namunalarni parallel ravishda qayta ishlash uchun ideal qiladi. Bu imkoniyat, ayniqsa, katta namunaviy kohortalar standart bo'lgan tizim biologiyasi va klinik tadqiqotlarda qimmatlidir.

Yuqori o'tkazuvchanlikdagi sonikatsiya: VialTweeter va UIP400MTP diqqat markazida

Ilg'or ultratovush qurilmalarini fosfoproteomik ish oqimlariga integratsiya qilish shunchaki qulaylik emas – bu metodologik yaxshilanishdir.
VialTweeter bir nechta yopiq flakonlarni sinxronlashtirilgan ultratovush bilan ishlov berish uchun mo'ljallangan bo'lib, takrorlanuvchanlikni ta'minlab, o'zaro ifloslanishni minimallashtiradi. U, ayniqsa, o'rtacha o'tkazuvchanlikdagi ilovalar va standartlashtirilgan ish oqimlari uchun juda mos keladi.
 

Bunga javoban, UIP400MTP yuqori o'tkazuvchanlikdagi muhitlar uchun optimallashtirilgan bo'lib, quyidagilarni ta'minlaydi:

• Butun standart mikroplitalar bo'ylab, masalan, 96-quduqli yoki 384-quduqli plitalar bo'ylab bir xil sonication
• Naychali tokchalar va avtomatik namunalar flakonlarini to'g'ridan-to'g'ri qayta ishlash
• Amaliy vaqtning sezilarli darajada qisqarishi
• Katta ma'lumotlar to'plamlarida takrorlanuvchanlikni oshirish

Ushbu miqyoslanish zamonaviy fosfoproteomika yondashuvlariga juda mos keladi, bu yerda ish oqimlari muntazam ravishda o'nlab yoki yuzlab namunalarni parallel ravishda qayta ishlaydi.

Sonikatsiya yordamida fosfoproteomik namunalarni tayyorlash bo'yicha umumiy protokol

Kuchli fosfoproteomik ish jarayoni samarali oqsil ekstraktsiyasini, fermentativ hazm qilishni va fosfopeptidlarni boyitishni birlashtiradi. Quyidagi reja sonikatsiya asosidagi preparatlarga moslashtirilgan eng yaxshi amaliyotlarni aks ettiradi:

1. Tez namunalarni sovutish va yig'ish
   Hujayralar yoki to'qimalar tezda so'riladi – odatda tezkor muzlatish orqali – fosforillanish holatlarini saqlab qolish uchun. Bu bosqich fosforillanish hodisalarining o'tkinchi tabiati tufayli juda muhimdir.
2. Ultratovushli hujayra lizisi va oqsil ekstrakti
   Namunalar eritiladi va odatda qisqa sikllarda sonikatsiyaga uchraydi. Ultratovush energiyasi hujayra membranalarini buzadi va oqsillarni samarali ravishda chiqaradi. Tasdiqlangan ish oqimlarida to'liq lizisni ta'minlash uchun sonikatsiya bir nechta sikllarda amalga oshiriladi.
   Misol: Namunalar muz ustida eritilgandan so'ng, hujayra lizisiga sonikatsiya orqali erishildi, masalan, Vialtweeter asbobi bilan 2 sikl davomida, har bir sikl 1 daqiqa.
3. Oqsilni aniqlashtirish va miqdoriy aniqlash
   Lizisdan so'ng, namunalar qoldiqlarni olib tashlash uchun santrifugalanadi. Eriydigan oqsillarni o'z ichiga olgan supernatant to'planadi va namunalar bo'ylab izchil kirishni ta'minlash uchun miqdori aniqlanadi.
4. Qaytarish va alkillash
   Disulfid bog'lanishlari oqsillarni barqarorlashtirish va ovqat hazm qilish samaradorligini oshirish uchun kamayadi (masalan, DTT yordamida) va alkillanadi (masalan, IAA yordamida).
5. proteolitik hazm qilish
   Oqsillar fermentativ ravishda, odatda tripsin bilan hazm qilinadi va massa spektrometriyasi tahlili uchun mos peptidlarni hosil qiladi. Ultratovush yordamida tezlashtirilgan oqsil hazm qilish haqida ko'proq o'qing!
6. Peptidlarni tozalash va tuzsizlantirish
   Peptidlar LC-MS tahliliga xalaqit berishi mumkin bo'lgan ifloslantiruvchi moddalarni olib tashlash uchun C18 asosidagi usullar yordamida tozalanadi.
7. Fosfopeptidni boyitish
   Fosforillangan peptidlarning kam miqdorini hisobga olgan holda, fosfopeptidlarni tanlab ajratish uchun Fe-NTA yoki TiO₂ affinlik usullari kabi boyitish usullari qo'llaniladi.
8. LC-MS/MS tahlili va ma'lumotlarni qayta ishlash
   Boyitilgan namunalar yuqori aniqlikdagi massa spektrometriyasi yordamida tahlil qilinadi, ko'pincha miqdoriy aniqlash va takrorlanuvchanlikni yaxshilash uchun ma'lumotlarga bog'liq bo'lmagan yig'ish (DIA) qo'llaniladi.

Shunisi e'tiborga loyiqki, keng ko'lamli ish oqimlari 96 quduqli plastinka formatlariga moslashtirilishi mumkin, bu esa yuzlab namunalarni parallel ravishda qayta ishlash imkonini beradi. – UIP400MTP asosidagi sonikatsiya bilan to'liq mos keladigan yondashuv.
 

Fosfoproteomni tez o'chirish, fosfopeptidni boyitish va Phos-DIA-MS uchun optimallashtirilgan protokol.
Protokol va tasvir: ©Die va boshqalar. 2023

Sonikatsiya orqali takrorlanuvchanlikni va ma'lumotlar sifatini oshirish

Fosfoproteomikaning asosiy muammolaridan biri katta ma'lumotlar to'plamlarida izchil miqdoriy aniqlashga erishishdir. Namuna tayyorlash jarayonida kiritilgan o'zgaruvchanlik biologik jihatdan mazmunli farqlarni yashirishi mumkin.

Sonikatsiya buni quyidagilar bilan hal qiladi:

1. Namunalar bo'yicha standartlashtirilgan energiya kiritish
2. Qo'lda o'zgaruvchanlikning kamayishi
3. Protein ekstraktsiyasi va hazm qilishda takrorlanuvchanlikni yaxshilash

UIP400MTP kabi yuqori o'tkazuvchanlikdagi platformalar bilan birlashtirilganda, laboratoriyalar tizim biologiyasi tadqiqotlari va klinik biomarkerlarni kashf etish uchun zarur bo'lgan izchillik darajasiga erishishi mumkin.

Fosfoproteomikaning kelajagi: Avtomatlashtirish va masshtablashuvchanlik

Fosfoproteomika keng ko'lamli va klinik qo'llanmalarga kengayishda davom etar ekan, avtomatlashtirish va o'tkazish qobiliyatiga talab faqat ortadi. Sonikatsiya asosida namunalarni tayyorlash, ayniqsa mikroplastinkaga mos keladigan tizimlar bilan integratsiyalashgan holda, asosiy imkoniyat yaratuvchi texnologiyani ifodalaydi.
Samarali ultratovushli lizis, parallel ishlov berish va avtomatlashtirilgan ish oqimlari bilan moslikni birlashtirish orqali VialTweeter va UIP400MTP kabi qurilmalar proteomika namunalarini tayyorlashda yangi standartlarni o'rnatmoqda.
UIP400MTP ning avtomatlashtirilgan laboratoriya ish oqimlariga integratsiyasi haqida ko'proq o'qing!

Fosfoproteomikada sonikatsiya yordamida namunalarni tayyorlashdan foydalaning!

Sonikatsiya yordamida oqsil ekstraktsiyasi zamonaviy fosfoproteomikaning muhim tarkibiy qismiga aylandi, mislsiz samaradorlik, miqyoslanish va takrorlanuvchanlikni taklif etadi. Katta namunaviy kohortalarda murakkab biologik tizimlarni tahlil qilish zarurati ortib borayotganligi sababli, ultratovush texnologiyalari nafaqat foydali, balki – ular juda muhim.
VialTweeter va UIP400MTP kabi yechimlar yuqori o'tkazuvchanlikdagi, standartlashtirilgan ish oqimlarini yoqish orqali hujayra signalizatsiyasi, kasallik mexanizmlari va aniq tibbiyotdagi kashfiyotlarni tezlashtirmoqda.

Dizayn, ishlab chiqarish va konsalting – Germaniyada ishlab chiqarilgan sifat

Hielscher ultrasonikatorlari eng yuqori sifat va dizayn standartlari bilan mashhur. Mustahkamlik va qulay foydalanish ultratovush qurilmalarimizni sanoat ob'ektlariga silliq integratsiya qilish imkonini beradi. Qo'pol sharoitlar va talabchan muhit Hielscher ultrasonikatorlari tomonidan osonlik bilan hal qilinadi.

Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatiga ega kompaniya bo'lib, eng zamonaviy texnologiya va foydalanuvchilarga qulaylik bilan ajralib turadigan yuqori samarali ultratovush apparatlariga alohida e'tibor beradi. Albatta, Hielscher ultrasonikatorlari Idoralar talablariga javob beradi va UL, CSA va RoHs talablariga javob beradi.

Hielscher ko'p namunali sonikator modellari UIP400MTP mikroplitalar, VialTweeter va CupHorn uchun: yuqori tezlikda va yuqori o'tkazuvchanlikdagi namunalarni tayyorlash