Ultratovush yordamida filtr koʻmagida namuna tayyorlash (FASP): ilgʻor ultratovush bilan ishlov berish orqali proteomik ish jarayonlarini takomillashtirish

Ultratovush yordamida filtr koʻmagida namuna tayyorlash (FASP) zamonaviy proteomikada yuqori samarali va takrorlanuvchan usul sifatida shakllanmoqda. Nazorat qilinadigan ultratovush bilan ishlov berishni mavjud FASP ish jarayonlariga kiritish orqali tadqiqotchilar oqsil ekstraksiyasini, parchalash samaradorligini va maʼlumotlarning umumiy sifatini sezilarli darajada yaxshilashlari mumkin. Koʻp sonli namunalarni tayyorlash va takrorlanuvchan natijalarga talab ortib borayotgan bir paytda, UIP400MTP mikroplastinka ultratovush qurilmasi kabi fokuslangan ultratovush bilan ishlov berish qurilmalarining ilmiy va amaliy ahamiyati oshmoqda.

Ilmiy kontekst: FASP proteomikada nima uchun muhim

Filtr koʻmagida namuna tayyorlash (FASP) samarali fermentativ parchalashni taʼminlagan holda detergentlar, tuzlar va boshqa ifloslantiruvchi moddalarni olib tashlash imkoniyati tufayli oqsillarni peptidlarga parchalab tahlil qilishga asoslangan proteomikada oltin standartga aylandi. Biroq anʼanaviy FASP protokollari koʻpincha toʻliq boʻlmagan lizis, parchalashning bir xil kechmasligi va namunalar oʻrtasidagi oʻzgaruvchanlik bilan bogʻliq cheklovlarga duch keladi – ayniqsa murakkab yoki chidamli biologik hujayralar yoki toʻqimalar bilan ishlaganda.
Aynan shu yerda fokuslangan ultratovush energiyasi (ultratovush bilan ishlov berish) hal qiluvchi ustunlikni taʼminlaydi. Mexanik siljish kuchlari va kavitatsiyani yuzaga keltirish orqali ultratovush bilan ishlov berish oqsillarning yaxlitligini buzmasdan FASP ish jarayonining bir nechta muhim bosqichlarini yaxshilaydi.

Ultratovushli FASPda ultratovush bilan ishlov berishning ijobiy taʼsirlari

Ultratovush bilan ishlov berish nazorat qilinadigan akustik kavitatsiyani – mikroskopik pufakchalarning hosil boʻlishi va qulashini – yuzaga keltiradi; bu esa mahalliy siljish kuchlari va mikrooqimlarni hosil qiladi.
Ultratovush bilan ishlov berish massa almashinuvini yaxshilash va reaksiya kinetikasini tezlashtirish orqali ultratovushli FASPning ham alkillash, ham parchalash bosqichlarini takomillashtiradi. Ultratovush energiyasini qoʻllash kavitatsiyani hosil qiladi, natijada mahalliy mikrooqimlar va qisqa muddatli siljish kuchlari yuzaga keladi; ular tez aralashishni va reagentlarning oqsil matritsasi yoki filtr muhitiga samarali kirib borishini taʼminlaydi. Alkillash vaqtida bu yodatsetamid yordamida sistein qoldiqlarining bir tekisroq va tezroq modifikatsiyalanishiga olib keladi. Parchalash bosqichida ultratovush bilan ishlov berish proteolitik uzilish joylariga kirish imkoniyatini oshiradi va ferment–substrat oʻzaro taʼsirlarini yaxshilaydi, shu orqali tripsin faolligini tezlashtiradi va parchalash samaradorligini oshiradi. Umuman olganda, ultratovush bilan ishlov berish reaksiyalarning toʻliq kechishi va takrorlanuvchanligini saqlagan yoki yaxshilagan holda ishlov berish vaqtini qisqartiradi.

Proteomikada namuna tayyorlashda ultratovushli FASP quyidagilarni taʼminlaydi:

• Hatto mustahkam toʻqimalar yoki mikrob namunalarida ham hujayralarni yanada samarali parchalash va oqsillarni ekstraksiya qilish
• Oqsillarni eritishning yaxshilanishi
• Parchalash vaqtida fermentlarning taʼsir joylariga kirish imkoniyatining yaxshilanishi
• Ishlov berish vaqtining qisqarishi va takrorlanuvchanlikning oshishi

Anʼanaviy mexanik yoki kimyoviy lizis usullaridan farqli ravishda, ultratovush bilan ishlov berishni yuqori darajada boshqarish va koʻlamini kengaytirish mumkin, bu esa uni standartlashtirilgan proteomik ish jarayonlari uchun ayniqsa mos qiladi.

Ultratovushli FASPning anʼanaviy yondashuvlarga nisbatan afzalliklari

Ultratovush bilan ishlov berishni FASP protokollariga kiritish keyingi mass-spektrometriya natijalariga bevosita taʼsir qiladigan, oʻlchash mumkin boʻlgan afzalliklarni taʼminlaydi.
Ultratovushli FASP oqsillarni, ayniqsa tolali toʻqimalar yoki bioplyonkalar kabi ishlov berish qiyin boʻlgan namunalardan toʻliqroq ajratib olish imkonini beradi. Energiyaning bir tekis taqsimlanishi takroriy namunalarga bir xil ishlov berilishini taʼminlab, oʻzgaruvchanlikni kamaytiradi – bu miqdoriy proteomikaning muhim talabidir.
Bundan tashqari, ultratovush bilan ishlov berish ferment–substrat oʻzaro taʼsirini yaxshilash orqali parchalash kinetikasini tezlashtiradi. Bu koʻpincha aminokislota ketma-ketligining tahlil bilan qamrovini saqlagan holda parchalash vaqtining qisqarishi va peptid chiqimining oshishiga olib keladi.
Ish jarayoni nuqtayi nazaridan ultratovush tizimlari qoʻlda bajariladigan amallarni kamaytiradi va agressiv kimyoviy ishlovlarga ehtiyojni bartaraf etadi, shu orqali namuna yaxlitligini saqlaydi va protokollarni standartlashtirishni soddalashtiradi.

Tun davomida bajariladigan FASP bilan solishtirganda ultratovushli FASP yordamida aniqlangan oqsillar sonining oshishini koʻrsatuvchi Venn diagrammasi
Tasvir va tadqiqot: ©Carvalho et al., 2020

Protokol: UIP400MTP yordamida koʻp sonli namunalar uchun ultratovushli FASP

Katta namuna toʻplamlariga ishlov beradigan laboratoriyalar uchun UIP400MTP mikroplastinka ultratovush qurilmasi standart koʻp quduqchali plastinkalarga (masalan, 96 quduqchali plastinkalarga) bir vaqtda ultratovush bilan ishlov berish imkonini beradi, bu esa ishlov beriladigan namunalar sonini va takrorlanuvchanlikni sezilarli darajada oshiradi.
Ushbu formatda namunalar (odatda har bir quduqchada 50–200 µL) bevosita ultrafiltratsiya yoki keyingi ishlov berishga mos mikroplastinkalarda tayyorlanadi. Lizis buferlari standart FASP protokollarida qoʻllaniladigan buferlarga oʻxshash.

UIP400MTP barcha quduqchalarga bir tekis ultratovush energiyasini yetkazadi. Ultratovush bilan ishlov berish odatda namuna turiga qarab 60–80% amplitudada 2–4 daqiqa davomida bajariladi. Haroratni ulanuvchi harorat sensori yordamida kuzatib boring. Impulsli ultratovush bilan ishlov berishdan va ixtiyoriy ravishda laboratoriya sovitkichidan foydalaning.

Namuna sifatidagi protokol:

1. Alkillash bosqichida namunalarga mikroplastinka ultratovush qurilmasi (UIP400MTP) yordamida 40% amplitudada 7 sikl davomida ultratovush bilan ishlov beriladi (30 s YOQILGAN, 15 s OʻCHIRILGAN; ultratovush bilan ishlov berishning umumiy vaqti: 5 min 45 s).
2. Ultratovush bilan ishlov berilgandan soʻng yodatsetamid (IAA) eritmasi sentrifugalash orqali olib tashlanadi. Tripsin bilan parchalashdan oldin fermentativ faollikni susaytiradigan kuchli xaotrop modda boʻlgan mochevina qoldiqlarini olib tashlash uchun namunalarni yuvish kerak. Shuning uchun namunalar 200 μL hajmdagi 25 mM ammoniy bikarbonat (AmBic) bilan ikki marta yuviladi.
3. Keyin 12,5 mM ammoniy bikarbonatda tayyorlangan 100 μL tripsin eritmasi (fermentning oqsilga nisbati 1:30) qoʻshiladi. Shundan soʻng oqsillar UIP400MTP yordamida xuddi shu ultratovush bilan ishlov berish sharoitlarida parchalanadi (40% amplituda, 7 sikl, 30 s YOQILGAN / 15 s OʻCHIRILGAN; umumiy vaqt: 5 min 45 s).
4. Ultratovush bilan ishlov berilgandan soʻng namunalar filtrli plastinkalarga oʻtkaziladi yoki plastinka asosidagi FASP tizimlari yordamida ishlov beriladi. Qaytarish va alkillash bosqichlari plastinkaning oʻzida bajarilib, ish jarayonining soddaligi saqlanadi.
5. Tripsin bilan parchalash nazorat qilinadigan sharoitlarda (masalan, 37°C, 4–16 soat) bajariladi; fermentativ faollikni tezlashtirish va peptid chiqimini oshirish uchun qisqa muddatli ultratovush stimulyatsiyasini qoʻllash imkoniyati mavjud.
6. Peptidlar sentrifugalash orqali ajratib olinadi va LC-MS/MS tahliliga tayyor boʻladi.

Ushbu tizimning asosiy afzalligi barcha quduqchalarda bir xil ishlov berish sharoitlarini taʼminlash qobiliyatidir; bu turli partiyalarga bogʻliq taʼsirlarni kamaytiradi va keng koʻlamli proteomik tadqiqotlarda ishonchli miqdoriy taqqoslashlarni amalga oshirish imkonini beradi.

Loyihalash, ishlab chiqarish va maslahat berish – Germaniyada yaratilgan sifat

Hielscher ultratovush qurilmalari eng yuqori sifat va loyihalash standartlari bilan mashhur. Mustahkamlik va foydalanishning osonligi ultratovush qurilmalarimizni sanoat obyektlariga muammosiz integratsiya qilish imkonini beradi. Hielscher ultratovush qurilmalari ogʻir sharoitlar va yuqori talablar qoʻyiladigan muhitlarda osongina ishlaydi.

Hielscher Ultrasonics ISO sertifikatiga ega kompaniya boʻlib, eng zamonaviy texnologiyalar va foydalanish qulayligini oʻzida mujassam etgan yuqori samarali ultratovush qurilmalariga alohida eʼtibor qaratadi. Albatta, Hielscher ultratovush qurilmalari CE talablariga mos keladi va UL, CSA hamda RoHs talablarini bajaradi.

Adabiyotlar / Manbalar

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).