Proteomika protokoli: kontaktsiz ultratovush bilan ishlov berish MS uchun peptid namunalarini tayyorlashni yaxshilaydi

Oqsillarni peptidlarga parchalashga asoslangan proteomika zamonaviy biomarkerlarni kashf etish, strukturaviy biologiya va klinik diagnostikaning tayanchiga aylandi. Oqsillarni mass-spektrometriya (MS) tahlilidan oldin peptidlarga parchalash orqali tadqiqotchilar aminokislotalar ketma-ketligining yanada kengroq qamroviga va ishonchliroq miqdoriy aniqlashga erishishlari mumkin. Biroq tarkibi juda murakkab biologik namunalarni MS uchun tayyorlash texnik jihatdan murakkabligicha qolmoqda. Metodologiyadagi soʻnggi yutuqlar boshqariladigan ultratovush bilan ishlov berish – xususan, kontaktsiz VialTweeter koʻp probirkali sonikatori va UIP400MTP mikroplastinka sonikatori yordamida – ushbu ish jarayonini sezilarli darajada soddalashtirishi, natijalarning takrorlanuvchanligini yaxshilashi va asboblar ishlashida tez-tez uchraydigan toʻsiqlarning oldini olishi mumkinligini koʻrsatmoqda.
MS yordamida tahlil qilish uchun mos oʻlchamdagi peptidlarni olishga moʻljallangan namunalarni tayyorlashning batafsil protokoli bilan tanishing.

Peptid namunalarini tayyorlash uchun kontaktsiz ultratovush bilan ishlov berishdan kimlar foydalanishi kerak?

• Oqsillarni peptidlarga parchalashga asoslangan proteomika va kashfiyot laboratoriyalari: LC-MS yoki MALDI ish jarayonlari uchun tarkibi juda murakkab namunalarni tayyorlaydigan va turli biologik matritsalardan peptidlarni barqaror ravishda yuqori unum bilan ajratib olishi zarur boʻlgan tadqiqotchilar.
• S-Trap™ va suspenziyani tutib qolish usulidan foydalanuvchilar: Mikrokolonkada tozalashga tayanadigan, kolonkaning tiqilib qolishining oldini olish hamda namunaning toʻsiqsiz yuklanishi va fermentativ parchalanishini taʼminlash uchun DNKni boshqariladigan tarzda mexanik parchalashi zarur boʻlgan jamoalar.
• Klinik va translatsion tadqiqot guruhlari: Toʻqima, hujayralar, plazma, qon zardobi yoki orqa miya suyuqligiga ishlov beradigan, partiyalar orasidagi natijalar takrorlanuvchanligi va namuna yaxlitligi hal qiluvchi ahamiyatga ega boʻlgan laboratoriyalar.
• Miqdoriy va maqsadli MS jamoalari: Qatʼiy qiyosiy tadqiqotlar olib boradigan, zondli sonikatorlar kam miqdorda uchraydigan peptidlarni miqdoriy aniqlashga putur yetkazishi mumkin boʻlgan oʻzaro kontaminatsiya xavfini yuzaga keltiradigan laboratoriyalar.
• Umumiy foydalanish markazlari va yuqori unumli ish jarayonlari: Bir vaqtning oʻzida bir nechta biologik takroriy namunaga ishlov beradigan va VialTweeter yordamida yopiq probirkalarda, koʻp probirkali blokda ultratovush bilan ishlov berishdan foyda oladigan guruhlar; bu usul zondni tozalash zaruratini bartaraf etadi, qoʻlda ishlash vaqtini qisqartiradi va aseptik sharoitlarni saqlaydi.
• PTM va oqsil tuzilishini oʻrganuvchi tadqiqotchilar: Hujayra lizisi va gomogenizatsiya vaqtida beqaror modifikatsiyalarni saqlash va aminokislotalar ketma-ketligi qamrovini maksimal darajaga yetkazish uchun yumshoq, harorati boshqariladigan ishlov berishga muhtoj tadqiqotchilar.

Protokolga umumiy nazar: toʻqima va hujayralardan MS uchun tayyor peptidlargacha

Wojtkiewicz va boshqalar bayon etgan, keng qoʻllaniladigan, oqsillarni peptidlarga parchalashga asoslangan proteomika ish jarayoni turli biologik matritsalardan peptid namunalarini tayyorlash uchun ishonchli, koʻlamini oshirish mumkin boʻlgan usulni taqdim etadi. 50–100 mg tez muzlatilgan toʻqima yoki 1–20 million hujayradan boshlanadigan ushbu protokol fermentativ parchalashdan oldin detergentlar, tuzlar va ifloslantiruvchi moddalarni samarali olib tashlash uchun suspenziyani tutib qolish (S-Trap™) texnologiyasini oʻz ichiga oladi.
Lizis, oqsilni miqdoriy aniqlash, qaytarish va alkillashdan soʻng namuna kislotalanadi va tripsin/lysC bilan parchalash amalga oshiriladigan S-Trap™ sentrifugalash kolonkasiga yuklanadi. Hosil boʻlgan peptidlar elyutsiya qilinadi, quritiladi va LC-MS tahlilidan oʻtkaziladi. 50 mg inson yuragi toʻqimasiga qoʻllanganda, ushbu ish jarayoni muntazam ravishda 30–40 marta kiritish uchun yetarli peptid beradi va har bir tahlilda 4 000 dan ortiq noyob oqsilni aniqlaydi. Kimyoviy bosqichlar va kolonkada tozalash aniq belgilangan boʻlsa-da, ish jarayonining muvaffaqiyati dastlabki fizik parchalash va DNKni boshqarish bosqichlariga kuchli bogʻliq.
Protokol hujayralarni lizis qilish va DNKni mexanik parchalash uchun VialTweeter koʻp probirkali sonikatori yordamida ultratovush bilan ishlov berishni tavsiya etadi – har ikkala bosqich ham peptid tahlili uchun hal qiluvchi ahamiyatga ega.

Oqsil ajratib olish uchun hujayra va toʻqimalarning ultratovushli lizisi

Oqsillarni peptidlarga parchalashga asoslangan proteomika ish jarayonida ultratovush bilan ishlov berish keyingi mass-spektrometriya tahlili uchun oqsillarni ajratib olish maqsadida hujayra namunalarini lizis qilishning asosiy bosqichidir. Hujayra choʻkmasiga SDS hujayra lizisi buferi qoʻshilgach, namunalarga VialTweeter koʻp probirkali sonikatori yordamida ultratovush bilan ishlov beriladi. Protokolda 1,5 mL mikrosentrifuga probirkalari ishlatiladi va sonikatorni 30% quvvatda 10 soniya yoqib, 10 soniya oʻchirib ishlatish, buni 3 sikl davomida takrorlash belgilangan. 1 daqiqa kutilgach, sikl yana ikki marta takrorlanadi. Namunalar muz bilan uzluksiz sovitiladi.
Bu jarayon hujayralarni parchalashga yordam berish bilan birga, aynan lizis vaqtida ajralib chiqqan genomik DNKni mexanik parchalash uchun ham zarur. DNKni samarali mexanik parchalash namuna qovushqoqligini kamaytirish va S-Trap™ kolonkalarining tiqilib qolishining oldini olish uchun juda muhim boʻlib, shu orqali oqsilning optimal ajratib olinishini va keyingi peptidlarning ishonchli fermentativ parchalanishini taʼminlaydi.

DNKni ultratovush bilan mexanik parchalashning hal qiluvchi roli

S-Trap™ asosidagi ish jarayonlarida eng koʻp uchraydigan nosozliklardan biri kolonkaning tiqilib qolishi boʻlib, bunga deyarli faqat hujayra yoki toʻqima gomogenizatsiyasi vaqtida ajralib chiqadigan yuqori molekulyar massali genomik DNK sabab boʻladi. Butun DNK namuna qovushqoqligini keskin oshiradi, peptidlarni tutib qoladi va S-Trap™ sorbentining mikrogʻovak qatlamini toʻsib qoʻyadi.
Ultratovush bilan ishlov berish DNKni kichik, eruvchan fragmentlarga mexanik parchalash orqali bu muammoni hal qiladi. Boshqariladigan akustik energiyani qoʻllash orqali VialTweeter ortiqcha issiqlik hosil qilmasdan yoki begona ifloslantiruvchi moddalarni kiritmasdan nuklein kislotalarni samarali mexanik parchalaydi. Qovushqoqlikning bunday kamayishi namunaning toʻsiqsiz yuklanishini, barqaror oʻtuvchi hajmiy oqim tezligini va uzluksiz fermentativ parchalanish kinetikasini taʼminlaydi.

VialTweeter bilan ultratovush bilan ishlov berishning optimallashtirilgan parametrlari

Protokol biologik namuna yaxlitligi va keyingi MS tahliliga moslik uchun optimallashtirilgan, natijalari yuqori darajada takrorlanuvchi ultratovush bilan ishlov berish rejimini belgilaydi. Hielscher VialTweeter kontaktsiz blok sonikatori yordamida 1,5mL mikrosentrifuga probirkalaridagi namunalarga ishlov berishda quyidagi parametrlar oqsil tuzilishini saqlagan holda lizisni va DNKning optimal mexanik parchalanishini taʼminlaydi:

• Amplituda: 30% quvvat
• Sikl tartibi: 10 soniya YOQILGAN / 10 soniya OʻCHIRILGAN
• Davomiylik: 3 sikl (10sec YOQILGAN/10sec OʻCHIRILGAN) → muz ustida 1 daqiqalik tanaffus → yana 2 marta takrorlash
• Haroratni boshqarish: termik denaturatsiya va muddatidan oldingi fermentativ faollikning oldini olish uchun ishlov berish vaqtida namunalar muz ustiga joylashtiriladi

Ultratovush bilan impulsli ishlov berishning bu usuli mahalliy ortiqcha qizishning oldini oladi, peptidlar oksidlanishini minimallashtiradi va barcha flakonlarga bir xil akustik taʼsirni taʼminlaydi. Yopiq probirkali tuzilma namunalar orasida zondni tozalash zaruratini ham bartaraf etib, qoʻlda ishlash vaqtini va operatorga bogʻliq oʻzgaruvchanlikni keskin kamaytiradi.

Zamonaviy proteomika ish jarayonlari uchun asosiy afzalliklar

VialTweeter ni oqsillarni peptidlarga parchalashga asoslangan proteomika ish jarayoningizga kiritish bir qator amaliy va ilmiy afzalliklarni beradi:

1. DNKning bir xil fragmentlanishi: Barcha flakonlarga akustik energiyaning bir xil yetkazilishi qovushqoqlik kamayishining takrorlanuvchanligini taʼminlaydi va S-Trap™ ga yuklashda partiyalar orasidagi oʻzgaruvchanlikning oldini oladi.
2. Beqaror modifikatsiyalarni saqlash: Muzli vannada past haroratda ishlov berish posttranslatsion modifikatsiyalarni (PTM) himoya qiladi va hujayra lizisi vaqtida issiqlik taʼsirida oqsil agregatsiyasining oldini oladi.
3. Keyingi ishlov berishning soddalashtirilishi: VialTweeter bilan ishlov berilgan lizatlarni qoʻshimcha tozalash bosqichlarisiz bevosita sentrifugalash orqali tiniqlashtirish va ularning miqdorini aniqlash mumkin, bu S-Trap™ da fermentativ parchalash bosqichiga oʻtishni tezlashtiradi.
4. Koʻlamni oshirish imkoniyati va moslashuvchanlik: Ultratovush bilan ishlov berishning bir xil sozlamalari tarkibi juda murakkab toʻqima namunalariga ham, hujayra suspenziyalariga ham qoʻllaniladi va kashfiyot proteomikasi, maqsadli miqdoriy aniqlash hamda glikoproteomika ish jarayonlarini qoʻllab-quvvatlaydi. Hielscher mikroplastinka sonikatorlari koʻp quduqchali plastinkalarda koʻp sonli namunalarga ishlov berish koʻlamini oson oshirish imkonini beradi.

Adabiyotlar / Manbalar

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
• Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
• Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.