Shotgun proteomikasida mikroplastinkalarni ultratovush bilan ishlov berish – Qoʻllash boʻyicha maʼlumot
Shotgun proteomikasi murakkab biologik materialni LC-MS/MS tahliliga tayyor peptidlarga aylantirish uchun samarali, takrorlanuvchan namuna tayyorlashga tayanadi. UIP400MTP mikroplastinka ultratovush qurilmasi kichik hajmli namunalarga standartlashtirilgan, parallel ultratovush bilan ishlov berish imkonini yaratib, bu jarayonni qoʻllab-quvvatlaydi va laboratoriyalarga mikroplastinka asosidagi ish jarayonlarida parchalash, ekstraksiya va qayta eritishni yaxshilashga yordam beradi. Qoʻllash boʻyicha ushbu maʼlumotda PLA2G12A/Th17 tadqiqotlaridagi chop etilgan hujayradan tashqari vezikulalar bilan ishlash jarayoni laboratoriyada sinovdan oʻtgan misol sifatida olinib, UIP400MTP qurilmasini proteomik namuna tayyorlashga qanday integratsiya qilish mumkinligi tasvirlangan.
Takrorlanuvchanligi yuqoriroq shotgun proteomikasi uchun mikroplastinkalarni ultratovush bilan ishlov berish
Proteomika tadqiqotchilari uchun takrorlanuvchan namuna tayyorlash yuqori sifatli LC-MS/MS maʼlumotlarini olishda hal qiluvchi ahamiyatga ega. UIP400MTP mikroplastinka ultratovush qurilmasi plastinka asosidagi hamda kichik hajmli/yuqori unumdorlikdagi ish jarayonlarida standartlashtirilgan, parallel ultratovush bilan ishlov berishni qoʻllab-quvvatlaydi.
Bu ayniqsa quyidagilar bilan ishlaydigan laboratoriyalar uchun foydalidir:
- Koʻplab quduqchalarda bir xil ishlov berishni talab qiladigan katta namuna toʻplamlari
- Namuna yoʻqotilishi va oʻzgaruvchanlikni imkon qadar kamaytirish zarur boʻlgan, boshlangʻich miqdori cheklangan material
- Hujayradan tashqari vezikulalar kabi lipidlarga boy namunalar
- Samarali parchalash, ekstraksiya yoki qayta eritishni talab qiladigan murakkab biologik preparatlar
- Turli sharoitlar va takroriy namunalar oʻrtasida takrorlanuvchanlik muhim boʻlgan qiyosiy shotgun proteomikasi
Parchalanishdan oldin mikroplastinkalarni ultratovush bilan ishlov berishni joriy etish orqali tadqiqotchilar namunalarning quyidagilarga tayyorligini yaxshilashlari mumkin:
- Oqsillarni ekstraksiya qilish va qayta eritish
- Tripsin/Lys-C bilan parchalash
- Nano-LC/MS/MS maʼlumotlarini olish
- Keyingi miqdoriy proteomik tahlil
Mikroplastinkalarni ultratovush bilan ishlov berish qoʻlda ishlashdan kelib chiqadigan oʻzgaruvchanlikni kamaytirishga, namunalarning parchalanishini yaxshilashga va murakkab biologik namunalarni ishonchli LC-MS/MS tahliliga tayyorlashga qanday yordam berishini bilib oling.
Mikroplastinkalarni ultratovush bilan ishlov berish quyidagilarga foyda keltirishi mumkin:
- Proteomika boʻyicha markaziy xizmat laboratoriyalari
- EV tadqiqot laboratoriyalari
- Immunologiya va hujayra biologiyasi laboratoriyalari
- Translyatsion tadqiqot guruhlari
- Bitta namuna tayyorlashdan yuqoriroq unumdorlikdagi ish jarayonlariga oʻtayotgan hayot haqidagi fanlar jamoalari
Hujayradan tashqari vezikulalar proteomini tahlil qilish uchun yuqori unumdorlikda namuna tayyorlash
Shotgun proteomikasi nima?
Shotgun proteomikasi butun hujayra lizatlari va toʻqima ekstraktlaridan tortib tozalangan organellalar, hujayradan tashqari vezikulalar va boshlangʻich miqdori kam boʻlgan klinik namunalargacha boʻlgan murakkab biologik namunalarni tavsiflashning asosiy tahliliy strategiyasiga aylangan. Uning asosiy kuchli jihati oqsillarni parchalash, yuqori ajrata olish qobiliyatiga ega suyuqlik xromatografiyasi–tandem mass-spektrometriyasi va peptidlardan oqsillarni hisoblash usullari orqali aniqlashni birlashtirishidadir. Biroq yakuniy proteom maʼlumotlar toʻplamining sifati namuna mass-spektrometrga yetib borishidan ancha oldin belgilanadi. Namunani samarali parchalash, oqsillarni eritish, xalaqit beruvchi moddalarni chiqarib tashlash, takrorlanuvchan fermentativ parchalash va peptidlarni ishonchli ajratib olish qamrov chuqurligi hamda miqdoriy ishonchlilik uchun hal qiluvchi ahamiyatga ega.
Cheklangan yoki qimmatli namunalar bilan ishlaydigan proteomika tadqiqotchilari va hayot haqidagi fanlar laboratoriyalari uchun namuna tayyorlash koʻpincha jarayonni cheklovchi bosqichdir.
UIP400MTP ishonchli namuna tayyorlashni va mavjud laboratoriya ish jarayonlariga oson integratsiyani taʼminlaydi
Proteomikada hujayradan tashqari vezikulalar bilan ishlashdagi qiyinchiliklar
Masalan, hujayradan tashqari vezikulalar (EV) ishlov berish ayniqsa murakkab boʻlgan namuna sinfini tashkil etadi. Ular membrana bilan oʻralgan, lipidlarga boy, nanooʻlchamli zarrachalar boʻlib, oqsil chiqishi nisbatan past va lipidlar, tuzlar, detergentlar, zardob oqsillari hamda matritsaning boshqa tarkibiy qismlarining keyingi bosqichlarga oʻtib ketish ehtimoli yuqori. Bu xususiyatlar parchalash samaradorligiga, xromatografik ajratish sifatiga, elektrospreyning barqarorligiga va peptidlarni identifikatsiya qilishga xalaqit berishi mumkin. Shu sababli EV proteomikasi uchun tayyorlash jarayoni vezikula tuzilmalarini parchalash va ular tashiydigan oqsillarni eritish uchun yetarlicha kuchli boʻlishi, ayni paytda keyingi fermentativ parchalash va LC-MS/MS tahliliga mos kelishi kerak.
Shu nuqtayi nazardan, mikroplastinkalarga mos ultratovush bilan ishlov berish namunalarga takrorlanuvchan, parallel ishlov berish uchun amaliy yondashuvni taklif qiladi. Hielscher mikroplastinka ultratovush qurilmalarining UIP400MTP (400 W) va UIP550MTP (550 W) modellari koʻp quduqchali plastinkalar va kichik hajmli idishlardagi namunalarga ultratovush bilan ishlov berish uchun moʻljallangan boʻlib, odatiy bir zondli ultratovush qurilmalariga qaraganda yuqoriroq unumdorlikdagi ish jarayonlarini qoʻllab-quvvatlaydi. Proteomika laboratoriyalari uchun bu format jozibador, chunki u qoʻlda bajariladigan amallardan kelib chiqadigan oʻzgaruvchanlikni kamaytirishi, bir nechta namunaga parallel ishlov berishni yaxshilashi va plastinka asosidagi namuna tayyorlash jarayonlariga tabiiyroq integratsiya qilinishi mumkin.
Namunaviy ish jarayoni
PLA2G12A taʼsirida kechadigan Th17 hujayra biologiyasidagi yaqinda chop etilgan hujayradan tashqari vezikulalar proteomikasi ish jarayoni UIP400MTP mikroplastinka ultratovush qurilmasini shotgun proteomikasi uchun namuna tayyorlashga qanday kiritish mumkinligining foydali, laboratoriyada sinovdan oʻtgan misolini beradi. Ushbu tadqiqotlar turkumida EV namunalariga proteom tahlili uchun metanol bilan ishlov berish, UIP400MTP yordamida ultratovush bilan ishlov berish, sentrifugalash, quritish, tripsin/Lys-C bilan parchalash va nanooqimli LC–yuqori ajrata olish qobiliyatiga ega tandem MS qoʻllanilgan. Biologik ish Mochizuki-Ono va hamkasblari tomonidan 2026-yilda eʼlon qilingan boʻlib, unda proteomik tahlil patogen T-hujayra javoblari doirasida PLA2G12A EV tashiydigan oqsillarni qanday oʻzgartirishini tavsiflashga yordam bergan.
Yuqori unumdorlikda oqsil ekstraksiyasi uchun UIP400MTP 96 quduqchali plastinka ultratovush qurilmasi
Ultratovush qurilmasi: UIP400MTP mikroplastinka ultratovush qurilmasi
Boshlangʻich material: 5 µg EV oqsil ekvivalenti
Parchalash: Tripsin/Lys-C
Oʻlchash natijasi: Nano-LC-MS/MS / DIA proteomikasi
Bosqichma-bosqich koʻrsatma: shotgun proteomikasi uchun UIP400MTP yordamida EV namunalarini tayyorlash
Ushbu ish jarayoni UIP400MTP mikroplastinka ultratovush qurilmasidan foydalanib, boshlangʻich miqdori kam boʻlgan hujayradan tashqari vezikula (EV) namunalarini shotgun proteomikasi uchun tayyorlash usulini tasvirlaydi. U EV namunalari normallashtirilgan, quritilgan, metanol bilan ishlov berilgan, ultratovush bilan ishlov berilgan, tripsin/Lys-C bilan parchalangan, kislotalangan va nano-LC-MS/MS yordamida tahlil qilingan chop etilgan EV proteomikasi ish jarayoniga asoslangan.
Ushbu tartib EV yoki boshqa kichik hajmli, lipidlarga boy biologik namunalarni bottom-up shotgun proteomikasi uchun tayyorlaydigan proteomika tadqiqotchilari va hayot haqidagi fanlar laboratoriyalari uchun moʻljallangan.
Ish jarayonining umumiy koʻrinishi
| Bosqich | Maqsad | Asosiy natija |
|---|---|---|
| EV tayyorlash | EV namunalarini ajratish, yuvish va miqdorini aniqlash | Normallashtirilgan boshlangʻich EV miqdori |
| Namunani quritish | Erituvchi yordamida ishlov berishdan oldin suyuqlikni chiqarib tashlash | Quritilgan EV materiali |
| Metanol bilan ishlov berish | Lipidlarga boy EV materialining parchalanishiga yordam berish | Metanol bilan namlangan namuna |
| UIP400MTP yordamida ultratovush bilan ishlov berish | Parchalash, ekstraksiya va gomogenizatsiyaga yordam berish | Ishlov berilgan EV namunasi |
| Parchalash | EV oqsillaridan peptidlar hosil qilish | Tripsin/Lys-C bilan parchalashdan olingan peptidlar aralashmasi |
| LC-MS/MS tahlili | Peptidlarni ajratish, aniqlash va miqdorini oʻlchash | Proteomika maʼlumotlar toʻplami |
| Maʼlumotlar tahlili | Peptidlar va oqsillarni identifikatsiya qilish hamda miqdorini aniqlash | Oqsil darajasidagi natijalar |
Bosqichma-bosqich protokol
| Qadam | Koʻrsatma | Muhim parametrlar |
|---|---|---|
| 1 | Laboratoriyada oʻrnatilgan ajratish ish jarayonidan foydalanib, tozalangan EV namunalarini tayyorlang. | Proteomika uchun tayyorlashdan oldin hujayralar, qoldiqlar va asosiy ifloslantiruvchi moddalarni chiqarib tashlang. |
| 2 | EV tarkibidagi oqsil miqdorini, masalan, BCA tahlili orqali aniqlang. | Barcha namunalarni bir xil boshlangʻich oqsil-ekvivalent miqdoriga normallashtiring. |
| 3 | 5 µg EV oqsil ekvivalentini toza PCR probirkalariga yoki mos kichik hajmli probirkalarga oʻtkazing. | Namuna yoʻqotilishi muammo boʻlganda, materialni kam bogʻlaydigan probirkalardan foydalaning. |
| 4 | EV namunalarini toʻliq quriting. | Ortiqcha qizib ketishdan saqlaning; koʻrinadigan suyuqlik qolmaganini tasdiqlang. |
| 5 | Har bir quritilgan EV namunasiga 25 µL metanol qoʻshing. | Quritilgan material toʻliq namlanganini taʼminlang. |
| 6 | UIP400MTP mikroplastinka ultratovush qurilmasi yordamida namunalarga 3 daqiqa davomida ultratovush bilan ishlov bering. | Barcha namunalar uchun bir xil ultratovush bilan ishlov berish sozlamalari va namunalarni joylashtirish mantiqidan foydalaning. |
| 7 | Ultratovush bilan ishlov berilgan namunalarni 19 000 × g da 20 daqiqa davomida 4°C haroratda sentrifugalang. | Sentrifugalashdan keyin har qanday choʻkma yoki erimaydigan materialni qoʻzgʻatishdan saqlaning. |
| 8 | Choʻkma ustidagi suyuqlikdan 20 µL ni ehtiyotkorlik bilan olib tashlang. | Barcha namunalar uchun bir xil pipetkalash usulidan foydalaning. |
| 9 | Qolgan namuna materialini toʻliq quriting. | Bevosita parchalash bosqichiga oʻting yoki faqat tasdiqlangan sharoitlarda saqlang. |
| 10 | 50 mM ammoniy bikarbonatdagi 100 ng/µL konsentratsiyali tripsin/Lys-C eritmasidan 4 µL qoʻshing. | Ferment eritmasini yangi tayyorlang yoki toʻgʻri saqlangan alikvotalardan foydalaning. |
| 11 | Quritilgan oqsil materialini parchalash eritmasida eritish uchun qisqa muddat ultratovush bilan ishlov bering. | Ultratovush bilan ishlov berishdan keyin barcha suyuqlikni probirka tubiga yigʻing. |
| 12 | 300 rpm da chayqatib, 37°C haroratda 2 soat davomida parchalashni amalga oshiring. | Bugʻlanishning oldini olish uchun qopqoqlarni mahkam yopiq tuting. |
| 13 | Parchalash mahsulotini kislotalash uchun 1,25% TFA dan 1 µL qoʻshing. | Kislotalash parchalashni toʻxtatadi va peptidlarni LC-MS/MS uchun tayyorlaydi. |
| 14 | Parchalash mahsulotini LC-MS ga mos flakonlar yoki plastinkalarga oʻtkazing. | Erimaydigan qoldiqlarni oʻtkazishdan saqlaning. |
| 15 | Nano-LC-MS/MS yordamida tahlil qiling. | Bir xil kiritish hajmi, LC gradiyenti va MS maʼlumotlarini olish sozlamalaridan foydalaning. |
| 16 | Zaruratga mos ravishda DIA, DDA yoki maqsadli proteomika dasturiy taʼminoti yordamida dastlabki maʼlumotlarga ishlov bering. | Mos maʼlumotlar bazasi, ferment spetsifikligi, modifikatsiya sozlamalari va FDR chegaralarini qoʻllang. |
(qarang: Mochizuki-Ono et al., 2026)
UIP400MTP koʻp quduqchali plastinka ultratovush qurilmasi
Nima uchun mikroplastinkalarni ultratovush bilan ishlov berish kerak?
UIP400MTP kichik hajmli namunalarga standartlashtirilgan, parallel ultratovush bilan ishlov berish imkonini beradi. Bu takrorlanuvchanlik, boshlangʻich namuna miqdorining kamligi va koʻp namunaga ishlov berish unumdorligi muhim boʻlganda foydalidir.
Istalgan standart mikroplastinkadan foydalaning! UIP400MTP yordamida yuqori unumdorlikda namuna tayyorlash
Havola qilingan EV proteomikasi ish jarayonida 5 µg oqsil-ekvivalent boshlangʻich EV miqdori, 25 µL metanol, UIP400MTP yordamida 3 daqiqa ultratovush bilan ishlov berish, tripsin/Lys-C bilan parchalash, TFA bilan kislotalash va nano-LC-MS/MS tahlili qoʻllanilgan.
Tavsiya etilgan LC-MS/MS va maʼlumotlar tahlili bosqichlari
Parchalash va kislotalashdan keyin namunalarni yuqori ajrata olish qobiliyatiga ega tandem mass-spektrometriyasi bilan birlashtirilgan nanooqimli teskari fazali LC yordamida tahlil qilish mumkin. Chop etilgan ish jarayonida peptidlar nano-LC tizimida ajratilgan va Orbitrap mass-spektrometrida maʼlumotlarga bogʻliq boʻlmagan maʼlumot olish usuli yordamida tahlil qilingan.
| Bosqich | Tavsiya | Maqsad |
|---|---|---|
| Namunani yuklash | C18 tutuvchi kolonkadan yoki unga teng peptid yuklash tizimidan foydalaning. | Peptidlarni konsentrlaydi va yuqori qutbli ifloslantiruvchi moddalarni chiqarib tashlaydi. |
| Peptidlarni ajratish | Nanooqimli teskari fazali LC dan foydalaning. | Peptidlarni ajratish va MS sezgirligini yaxshilaydi. |
| MS maʼlumotlarini olish | Tadqiqot tuzilishiga qarab DIA, DDA yoki maqsadli MS dan foydalaning. | Peptid darajasidagi spektral maʼlumotlarni hosil qiladi. |
| Maʼlumotlar bazasida qidirish | Biologik turga mos referens maʼlumotlar bazasidan foydalaning. | Peptidlar va oqsillarni identifikatsiya qilishga yordam beradi. |
| FDR nazorati | Peptidlar va oqsillar uchun yolgʻon aniqlash ulushi chegaralarini qoʻllang. | Identifikatsiyaning ishonchliligini nazorat qiladi. |
| Miqdoriy aniqlash | Peptidlar, prekursorlar va oqsillar miqdori jadvallarini eksport qiling. | Guruhlar oʻrtasida statistik taqqoslash imkonini beradi. |
Sifat nazorati tekshiruv roʻyxati
- Barcha namunalarda boshlangʻich EV oqsil-ekvivalent miqdori bir xilligini tasdiqlang.
- Namunalarga ishlov berishda tasodifiylashtirilgan yoki muvozanatlashtirilgan joylashtirish sxemalaridan foydalaning.
- Metanol hajmi, ultratovush bilan ishlov berish vaqti, quritish vaqti va parchalash hajmini bir xil saqlang.
- Peptid chiqishi va jami identifikatsiya qilingan oqsillar sonini kuzating.
- Amalga oshmagan kesilishlar ulushi va peptid uzunligi taqsimotini tekshiring.
- Xromatografik choʻqqi shakli va ushlanish vaqtining takrorlanuvchanligini tekshiring.
- Qoldiq moddalarning keyingi namunaga oʻtishini kuzatish uchun boʻsh nazorat namunalarini kiriting.
- Kattaroq tadqiqotlar uchun birlashtirilgan QC namunalaridan foydalaning.
- Takroriy namunalar variatsiya koeffitsiyentini baholang.
- Partiya taʼsirlarini yoki chetga ogʻuvchi namunalarni aniqlash uchun PCA yoki unga yaqin usullardan foydalaning.
Qayd etish boʻyicha tavsiyalar
Ushbu ish jarayonini chop etishda yoki hujjatlashtirishda boshlangʻich EV miqdori, plastinka formati, metanol hajmi, UIP400MTP amplitudasi va ultratovush bilan ishlov berish vaqti, sentrifugalash sharoitlari, quritish usuli, parchalash buferi, ferment konsentratsiyasi, parchalash vaqti, kislotalash sharoitlari, LC-MS/MS platformasi, maʼlumot olish rejimi, dasturiy taʼminot versiyasi, maʼlumotlar bazasi, FDR chegarasi, normallashtirish usuli va statistik ish jarayonini koʻrsating.
Barcha Hielscher mikroplastinka ultratovush qurilmalari amplituda, ultratovush bilan ishlov berish davomiyligi va harorat kabi muhim jarayon parametrlarini sana va vaqt belgisi bilan oʻrnatilgan SD-kartaga CVS fayli sifatida avtomatik qayd etadi. Takrorlanuvchanlik va sifat nazorati uchun maʼlumotlarni qayd etish hech qachon bunchalik oson boʻlmagan!
DIA proteomikasi uchun barcha namunalarda bir xil maʼlumot olish sozlamalaridan foydalaning va imkon boʻlganda birlashtirilgan QC namunalarini kiriting. Prekursorlar soni, ushlanish vaqtining barqarorligi va takroriy namunalar oʻzgaruvchanligini kuzating.
Ushbu ish jarayoni EV proteomikasi uchun laboratoriyada sinovdan oʻtgan misoldir. Boshqa namuna turlari uchun toʻliq tadqiqot koʻlamiga oʻtishdan oldin boshlangʻich miqdor, erituvchi sharoitlari, ultratovush bilan ishlov berish vaqti, parchalash hajmi va LC-MS/MS ga namuna kiritish strategiyasini optimallashtiring.
Tadqiqot tafsilotlari: PLA2G12A tadqiqotida EV shotgun proteomikasi
PLA2G12A tadqiqoti shotgun proteomikasi ish jarayonida UIP400MTP dan foydalanishning aniq misolini beradi. Biologik savol ajralib chiqadigan PLA2G12A fosfolipazasi Th17 hujayralaridan kelib chiqqan hujayradan tashqari vezikulalarni qanday oʻzgartirishi va shu orqali patogen T-hujayra differensiatsiyasiga qanday taʼsir qilishidan iborat edi. Mualliflar PLA2G12A EV membranalariga taʼsir qilib, jumladan 1-oleoil-lizofosfatidiletanolamin kabi lizofosfolipidlarni hosil qilishini va undan keyingi LPA2 orqali kechadigan lizofosfatid kislota signal uzatishi Th17 differensiatsiyasiga hissa qoʻshishini koʻrsatgan. Lipid signal uzatishidan tashqari, tadqiqotlarda EV tashiydigan moddalar, jumladan RNK va oqsil tarkibi ham tekshirilgan boʻlib, bu shotgun proteomikasini tavsiflash strategiyasining muhim tarkibiy qismiga aylantirgan.
EV tayyorlash ish jarayonida Th17 hujayralari ekzosomalardan tozalangan homilaviy qoramol zardobi boʻlgan muhitda oʻstirilgan. Kultura ustidagi suyuqliklar avval hujayralarni chiqarib tashlash uchun sentrifugalangan, 0,22 µm filtrdan oʻtkazilgan, ultrafiltratsiya/ultrasentrifugalash orqali konsentrlangan, yuvilgan, PBS da qayta suspenziyalangan va BCA oqsil tahlili orqali miqdori aniqlangan. Ushbu dastlabki EV tayyorlash bosqichi proteomika ish jarayoniga EV materialining belgilangan oqsil-ekvivalent miqdorini kiritish imkonini taʼminlagan.
Shotgun proteomik tahlili uchun mualliflar 5 µg oqsil ekvivalentiga mos EV namunalaridan foydalangan. Ushbu namunalar PCR probirkalarida quritilgan va 25 µL metanol qoʻshilgan. Soʻng namunalarga UIP400MTP mikroplastinka ultratovush qurilmasi yordamida 3 daqiqa davomida ultratovush bilan ishlov berilgan. Ultratovush bilan ishlov berishdan keyin namunalar 4°C haroratda 20 daqiqa davomida 19 000 × g da sentrifugalangan. Choʻkma ustidagi suyuqlikdan 20 µL olib tashlangach, namunalar quriguncha sentrifugalangan. Keyin oqsillar 50 mM ammoniy bikarbonatdagi 100 ng/µL konsentratsiyali tripsin/Lys-C eritmasining 4 µL hajmida ultratovush bilan ishlov berish orqali eritilgan. Parchalash 300 rpm da chayqatib, 37°C haroratda 2 soat davomida amalga oshirilgan. Parchalash mahsuloti 1 µL 1,25% triftorsirka kislotasi bilan kislotalangan va nanooqimli LC–yuqori ajrata olish qobiliyatiga ega tandem mass-spektrometriyasi tahliliga yuborilgan.
Ushbu ish jarayoni boshlangʻich miqdori kam boʻlgan EV proteomikasi uchun bir nechta foydali tamoyilni koʻrsatadi. Birinchidan, boshlangʻich miqdor oqsil ekvivalenti boʻyicha normallashtirilgan boʻlib, bu turli genotiplar yoki ishlovlardan olingan EV larni taqqoslashda muhimdir. Ikkinchidan, ultratovush bilan ishlov berishdan oldin metanol qoʻllanilgan; bu parchalash va ekstraksiyaga yordam berib, LC-MS/MS ni murakkablashtirishi mumkin boʻlgan detergent tizimlaridan foydalanmaslik imkonini bergan. Uchinchidan, ultratovush bilan ishlov berish bosqichi qisqa va standartlashtirilgan boʻlib, namunalarga parallel ishlov berishga mos keladi. Toʻrtinchidan, tripsin/Lys-C bilan parchalash juda kichik hajmda amalga oshirilgan, bu suyulishni kamaytirgan va boshlangʻich miqdori kam boʻlgan namunalardan peptidlarni ajratib olishga yordam bergan. Nihoyat, parchalashdan bevosita kislotalash va LC-MS/MS ga oʻtish keraksiz ishlov bosqichlarini imkon qadar kamaytirgan.
Keyingi LC-MS/MS usulida Q-Exactive HF Orbitrap mass-spektrometri bilan birlashtirilgan nanooqimli teskari fazali ajratish qoʻllanilgan. Namunalar C18 old kolonkada tutilgan, soʻng ichki diametri 50 µm boʻlgan analitik kolonkada 200 nL/min hajmiy oqim tezligida va 40°C haroratda ajratilgan. Gradiyent 60 daqiqa davomida organik erituvchi miqdori past darajadan 35% B erituvchigacha oshirilgan, undan keyin organik erituvchi miqdori yuqori boʻlgan eritma bilan yuvish va qayta muvozanatlash amalga oshirilgan. MS maʼlumotlari musbat ion rejimida, yuqoriroq energiyali toʻqnashuv dissotsiatsiyasi bilan maʼlumotlarga bogʻliq boʻlmagan maʼlumot olish usuli yordamida olingan. Dastlabki DIA fayllari in silico bashorat qilingan spektral kutubxona bilan DIA-NN 1.8 yordamida tahlil qilingan.
Yuqori unumdorlikda oqsil ekstraksiyasi UIP400MTP 96 quduqchali plastinka ultratovush qurilmasi yordamida
Koʻp beriladigan savollar
Shotgun proteomikasida mikroplastinkalarni ultratovush bilan ishlov berish kimlarga eng koʻp foyda keltiradi?
Mikroplastinkalarni ultratovush bilan ishlov berish bir nechta namunaga parallel ishlov beradigan proteomika laboratoriyalari, jumladan markaziy xizmat laboratoriyalari, proteom tadqiqot guruhlari, immunologiya laboratoriyalari, translyatsion tadqiqot jamoalari va yuqoriroq unumdorlikdagi LC-MS/MS ish jarayonlariga oʻtayotgan hayot haqidagi fanlar laboratoriyalari uchun ayniqsa foydalidir. Bu namunalar oʻrtasidagi takrorlanuvchanlik hal qiluvchi ahamiyatga ega boʻlganda ayniqsa dolzarbdir.
Nima uchun odatiy zondli ultratovush qurilmasi oʻrniga UIP400MTP dan foydalanish kerak?
Odatiy zondli ultratovush qurilmasi odatda namunalarga bittadan ishlov beradi va qoldiq moddalarning keyingi namunaga oʻtishini kamaytirish uchun namunalar orasida ehtiyotkorlik bilan tozalashni talab qiladi. Mikroplastinka ultratovush qurilmalarining UIP400MTP va UIP550MTP modellari plastinka asosidagi yoki kichik hajmli formatda parallel ultratovush bilan ishlov berishni qoʻllab-quvvatlab, qoʻlda bajariladigan amallarni kamaytirishga, bir xillikni yaxshilashga va koʻp namuna tayyorlashni soddalashtirishga yordam beradi. Ular avtomatlashtirilgan ish jarayonlariga ham oson integratsiya qilinadi.
Shotgun proteomikasi ish jarayonida ultratovush bilan ishlov berish qaysi bosqichda qoʻllaniladi?
Ultratovush bilan ishlov berish odatda parchalashdan oldingi namuna tayyorlash bosqichida qoʻllaniladi. U tripsin, Lys-C yoki tripsin/Lys-C aralashmasi bilan fermentativ parchalashdan oldin parchalash, ekstraksiya, gomogenizatsiya va qayta eritishga yordam berishi mumkin.
Bundan tashqari, oqsillarning fermentativ parchalanishini sezilarli tezlashtirish uchun parchalash davomida ham ultratovush bilan ishlov berish qoʻllanilishi mumkin. Tezkor proteomik ish jarayoni uchun ultratovush bilan ishlov berish yordamida yuqori unumdorlikda oqsil parchalash imkoniyatlarini kashf eting!
Mikroplastinkalarni ultratovush bilan ishlov berish hujayradan tashqari vezikulalar proteomikasi uchun foydalimi?
Ha. Hujayradan tashqari vezikulalar lipidlarga boy, membrana bilan oʻralgan zarrachalar boʻlib, ularga takrorlanuvchan tarzda ishlov berish qiyin boʻlishi mumkin. Havola qilingan PLA2G12A tadqiqotlarida EV namunalariga metanol bilan ishlov berilgan, UIP400MTP yordamida ultratovush bilan ishlov berilgan, ular quritilgan, tripsin/Lys-C bilan parchalangan va nano-LC/MS/MS yordamida tahlil qilingan.
Mikroplastinkalarni ultratovush bilan ishlov berish qaysi namuna turlari uchun foydali boʻlishi mumkin?
Mikroplastinkalarni ultratovush bilan ishlov berish hujayra lizatlari, organella fraksiyalari, immunopretsipitatlar, oqsil agregatlari, membranalarga boy namunalar, hujayradan tashqari vezikulalar va boshqa kichik hajmli biologik preparatlar uchun foydali boʻlishi mumkin. Har bir namuna turi uchun ultratovush bilan ishlov berish intensivligi va vaqti, erituvchi sharoitlari, boshlangʻich miqdor va parchalash strategiyasi optimallashtirilishi kerak.
Ultratovush bilan ishlov berish fermentativ parchalash oʻrnini bosadimi?
Yoʻq. Ultratovush bilan ishlov berish parchalash, ekstraksiya yoki qayta eritishni yaxshilash orqali namunani fermentativ parchalashga tayyorlashga yordam beradi. Bottom-up shotgun proteomikasi uchun peptidlar hosil qilishda proteolitik parchalash hali ham zarur.
Proteomik ish jarayonlarida ultratovush yordamida jadallashtiriladigan oqsil parchalash haqida batafsil oʻqing!
UIP400MTP boshlangʻich miqdori kam boʻlgan namunalar proteomikasiga mos keladimi?
Ha, mikroplastinka formati namunani saqlab qolish va bir xil ishlov berish muhim boʻlgan kichik hajmli ish jarayonlariga juda mos keladi. Chop etilgan EV ish jarayonida proteomika uchun tayyorlash 5 µg oqsil-ekvivalent boshlangʻich EV miqdori bilan amalga oshirilgan.
Mikroplastinkalarni ultratovush bilan ishlov berish takrorlanuvchanlikni yaxshilashi mumkinmi?
Hielscher ultratovush qurilmalari bir nechta namunaga standartlashtirilgan ultratovush bilan ishlov berish sharoitlarini qoʻllash orqali takrorlanuvchanlikni qoʻllab-quvvatlaydi. Biroq hujayralar yoki EV ni ajratish, boshlangʻich miqdorni normallashtirish, parchalash samaradorligi, LC-MS/MS barqarorligi, maʼlumotlarga ishlov berish va statistik tahlil kabi boshqa omillar ham proteomikaning umumiy takrorlanuvchanligiga hissa qoʻshadi.
Mikroplastinkalarni ultratovush bilan ishlov berish oqsillarni identifikatsiya qilish chuqurligini yaxshilaydimi?
Namunani parchalash yoki qayta eritish cheklovchi omil boʻlganda, u identifikatsiya chuqurligini yaxshilashga hissa qoʻshishi mumkin. Taʼsir namuna turi, oqsil kimyosi, tozalash strategiyasi, parchalash sharoitlari va LC-MS/MS usulining samaradorligiga bogʻliq.
Ish jarayonini muntazam qoʻllashdan oldin nimalarni optimallashtirish kerak?
Asosiy parametrlar boshlangʻich namuna miqdori, bufer yoki erituvchi tarkibi, plastinka formati, ultratovush amplitudasi va davomiyligi, quritish sharoitlari, parchalash hajmi, ferment konsentratsiyasi, inkubatsiya vaqti va LC-MS/MS ga kiritiladigan namuna miqdorini oʻz ichiga oladi. Ish jarayonini toʻliq tajriba toʻplamiga qoʻllashdan oldin dastlabki sinov oʻtkazish tavsiya etiladi.
Ushbu ish jarayonidan DIA proteomikasida foydalanish mumkinmi?
Ha. Havola qilingan EV ish jarayonida maʼlumotlarga bogʻliq boʻlmagan maʼlumot olish usuli va undan keyin DIA-NN tahlili qoʻllanilgan. Mikroplastinkalarni ultratovush bilan ishlov berish dastlabki namuna tayyorlash jarayonining bir qismi boʻlib, DIA, DDA yoki maqsadli proteomika usullari bilan integratsiya qilinishi mumkin.
Qaysi sifat nazorati koʻrsatkichlarini kuzatish kerak?
Tavsiya etilgan QC koʻrsatkichlari peptid chiqishi, identifikatsiya qilingan peptidlar va oqsil guruhlari soni, amalga oshmagan kesilishlar ulushi, peptid uzunligi taqsimoti, xromatografik choʻqqi shakli, ushlanish vaqtining barqarorligi, takroriy namunalar variatsiya koeffitsiyenti, qoldiq moddalarning keyingi namunaga oʻtishi va PCA yoki unga yaqin usullar orqali biologik guruhlarning ajralishini oʻz ichiga oladi.
Proteomika uchun namuna tayyorlashga UIP400MTP yoki UIP550MTP mikroplastinka ultratovush qurilmasi modellarini integratsiya qilishning asosiy afzalligi nima?
Asosiy afzallik kichik hajmli namunalarga standartlashtirilgan, parallel ishlov berishdir. Bu laboratoriyalarga qoʻlda ishlashdan kelib chiqadigan oʻzgaruvchanlikni kamaytirishga va murakkab biologik namunalarni parchalash, LC-MS/MS maʼlumotlarini olish hamda miqdoriy proteomik tahlil uchun yanada bir xil tarzda tayyorlashga yordam beradi.
Hielscher mikroplastinka ultratovush qurilmalarini avtomatlashtirilgan ish jarayonlariga uzluksiz integratsiya qilish mumkin.
Adabiyotlar / Manbalar
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Mochizuki-Ono C., Taketomi Y., Irie A., Kano K. et al. (2026): PLA2G12A-driven extracellular vesicle-lipid signaling amplifies pathogenic T cell responses in inflammatory diseases. Cell Reports 45, 2026.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Lischnig A., Bergqvist M., Ochiya T., Lässer C. (2023): Corrigendum for «Quantitative Proteomics Identifies Proteins Enriched in Large and Small Extracellular Vesicles». Molecular & Cellular Proteomics, 22; 2023.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
Hielscher Ultrasonics yuqori samarali ultratovushli gomogenizatorlarni laboratoriya oʻlchamidan tortib sanoat oʻlchamigacha ishlab chiqaradi.