Proteomik ish oqimlari yuqori samarali protein hazm qilish

Proteomika biologik jarayonlar va tizimlarni tushunish uchun muhim soha bo'lib, oqsil hazm qilish uning ish jarayonlarida muhim bosqichni tashkil qiladi. An'anaga ko'ra, oqsillarni hazm qilish proteolitik fermentlar, masalan, lizin va arginin qoldiqlarida peptid aloqalarini gidrolizlovchi tripsin yordamida amalga oshiriladi. Bu jarayon mass-spektrometriya (MS) ilovalarida ionlash va parchalanish uchun juda mos peptidlarni hosil qiladi. Biroq, an'anaviy hazm qilish usullari 12-24 soatni talab qiladi, bu esa proteomik ish oqimlarida sezilarli qiyinchiliklarni keltirib chiqaradi.
Ultrasonikatsiya ovqat hazm qilish vaqtini soatlardan atigi bir necha daqiqagacha qisqartiradigan kuchli alternativani taklif etadi. Hielscher CupHorn, VialTweeter va 96-quduqli plastinka sonikatori UIP400MTP kabi ilg'or ko'p namunali sonikatorlar bilan birlashganda, ultrasonikatsiya tezlashtirilgan, yuqori o'tkazuvchan proteomikani ta'minlaydi. Ushbu texnologiyalar ish jarayonlarini soddalashtiradi, namunani tayyorlash vaqtini qisqartiradi va takrorlanuvchanlik yoki ma'lumotlar sifatini buzmasdan samaradorlikni oshiradi.

Protein hazm qilishda ultratovush energiyasining roli

Ultrasonikatsiya kavitatsiyani yaratish uchun yo'naltirilgan ultratovush to'lqinlaridan foydalanadi - kuchli kesish kuchlarini hosil qilish uchun qulab tushadigan mahalliy mikro pufakchalar. Bu hodisa massa almashinuvini kuchaytiradi, fermentlarning substratlar bilan aralashishiga yordam beradi va oqsil tuzilmalarini ochadi, parchalanish joylarini tripsin kabi proteolitik fermentlarga ta'sir qiladi.
Natija? Samaradorlik yoki takrorlanuvchanlikni buzmasdan hazm qilish vaqtini sezilarli darajada qisqartirish.

Ultratovush bilan kengaytirilgan proteolitik hazm qilish: metodologiya va natijalar

Tezlashtirilgan hazm qilish protokoli

Ultratovush yordamida hazm qilish proteolitik fermentlarni va ultratovush energiyasini ish oqimlarini tezlashtirish uchun birlashtiradi. Masalan, Hielscher UP200St-CupHorn (200 Vt, 26 kHz) yordamida ovqat hazm qilish jarayoni quyidagicha davom etadi:

1. Kamaytirish: Protein namunalari (0,5 mg/ml, 20 mL) ammoniy bikarbonat tamponida (12,5 mM) DTT (2 mL, 110 mM) bilan ishlov beriladi. Sonikatsiya 5 daqiqa davomida 50% amplituda qo'llaniladi.
2. Alkillanish: IAA (2 µL, 400 mM) qo‘shgandan so‘ng, sonikatsiya bir xil sharoitlarda takrorlanadi.
3. Ovqat hazm qilish: Namunalar suyultiriladi va immobilizatsiyalangan tripsin nanopartikullari bilan inkubatsiya qilinadi. Sonikatsiyaning oxirgi bosqichi (5 daqiqa) hazm qilishni yakunlaydi. Peptidlar ajratiladi, quritiladi va MS tahlili uchun saqlanadi.

Ushbu ultratovush usuli umumiy tayyorgarlik vaqtini 12 soatdan 30 daqiqagacha qisqartiradi. Tezlashtirilgan jarayonga qaramay, peptid rentabelligi va sifati an'anaviy tungi usullarga mos keladi.

Ultrasonik oqsil hazm qilish samaradorligi

E. coli proteomalaridan foydalangan holda qiyosiy tadqiqotlarda:

• Proteinni aniqlash: Ultrasonik hazm qilingan namunalar 5 daqiqada 777 ta oqsilni aniqladi, 12 soat ichida 817 ta. Umumiy protein identifikatsiyasi 70% dan oshdi.
• Qayta ishlab chiqarish qobiliyati: Takroriy tahlillar har bir usulda 98% dan yuqori korrelyatsiya qiymatlarini ko'rsatdi va bu ishonchliligini ko'rsatdi.
• Selektivlik: Ba'zi oqsillar har bir usul bo'yicha afzallik bilan hazm qilingan, ultratovushli hazm qilish 65 oqsilni va bir kechada hazm qilish 54 oqsilni afzal ko'radi. Bunday nuanced farqlar maxsus ilovalar uchun ultrasonikatsiyaning noyob salohiyatini ta'kidlaydi.

Yorliqsiz protein miqdorini aniqlash natijalari yettita boshoqli oqsillarni E. coli ga aylantirdi
namuna. Quyidagi oqsillar ustunda qayd etilganidek, ikki xil darajada qo'shilgan
"Teo nisbati" deb nomlanadi. Teo nisbati - bunda ishlatiladigan ikki daraja o'rtasidagi nazariy nisbat
tajriba. Qoramol zardobi albumini (ALBU), b-laktoglobulin (LACB), a-S1 kazein (CASA1),
a-S2 kazein (CASA2), sitoxrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) va karbonat angidraz 2
(CAH2). Nisbatlar MaxQuant'dan olingan LFQ oqsil intensivligi yordamida hisoblab chiqilgan
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
O'rganish va grafik: © Martins va boshqalar, 2019)

Nanozarrachalar bilan immobilizatsiyalangan tripsin

Immobilizatsiyalangan tripsin nanozarrachalarining (masalan, T-FMNPs) ultratovush bilan integratsiyasi proteomika ish oqimlarini yanada kuchaytiradi. Ushbu nanozarrachalar ferment-substrat o'zaro ta'siri uchun yuqori sirt maydonini ta'minlaydi va samaradorlikni oshiradi. E. coli kabi murakkab proteomalarga qo'llanilganda, kombinatsiyalangan usul quyidagilarga erishadi:

• Tezlik: 5 daqiqa ichida to'liq ovqat hazm qilish.
• Aniqlik: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Masshtablilik: UIP400MTP kabi ko'p quduqli platformalarga moslashish yuqori mahsuldorlikka ega ishlov berish imkonini beradi.

Bosqichma-bosqich ko'rsatmalar bilan batafsil protokol uchun bu yerni bosing!
(Qarang: Martins va boshqalar, 2019)

Hielscher sonikatorlari yordamida yuqori tezlikda va yuqori ishlab chiqarishda proteolitik hazm qilish

Proteomika uchun eng yaxshi sonikator modellari

Hielscher Ultrasonics bir vaqtning o'zida ko'p namunali tayyorlash uchun turli sonikator modellarini taklif etadi, bu esa yuqori samarali ish oqimlarini osonlashtiradi. Flakonlar, probirkalar, ko‘p quduqli plitalar (masalan, 6, 24, 96 quduqli plitalar) yoki Petri idishlari bilan ishlaysizmi? – biz sizga tajribalaringiz uchun ideal sonikatorlarni taklif qilamiz.

UIP400MTP ko'p quduqli plastinka sonikatori

Yakuniy o'tkazuvchanlik uchun UIP400MTP 96 quduqli plitalarni ultratovush usulida qayta ishlash imkoniyatini beradi. Har qanday standart mikroplata bilan mos keladigan UIP400MTP qimmatbaho mulkiy bir martalik foydalanishni talab qilmaydi va tadqiqotingiz uchun eng yaxshi ko'p quduqli plastinkani tanlash erkinligini beradi. Plastinka bo'ylab bir xil energiya etkazib berish orqali u atigi 1 soat ichida 200 tagacha murakkab proteomalarning tez qisqarishi, alkillanishi va hazm bo'lishini ta'minlaydi. Ushbu avtomatlashtirish va samaradorlik darajasi yuqori ishlab chiqarish proteomikasi va klinik ilovalar uchun juda muhimdir. Ko'p quduqli plastinka sonikatori haqida ko'proq bilib oling!

VialTweeter

VialTweeter bir vaqtning o'zida 10 tagacha flakon yoki probirkaning sonikatsiyasini talab qiladigan laboratoriyalar uchun mo'ljallangan. Uning invaziv bo'lmagan yondashuvi o'zaro kontaminatsiya xavfini yo'q qiladi, shu bilan birga takrorlanadigan protein hazm bo'lishini ta'minlaydi. Ushbu qurilma cheklangan namuna hajmlari yoki turli xil namunalar bilan ishlaydigan tadqiqotchilar uchun ideal.
VialTweeter ko'p quvurli sonikator haqida ko'proq bilib oling!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn sonikatori muhrlangan konteynerlarda bir nechta namunalarni bir vaqtning o'zida qayta ishlash uchun mo'ljallangan kuchli qurilma. Bu ultratovushli energiyaning yagona taqsimlanishini va haroratni aniq nazorat qilishni ta'minlaydi. Bir vaqtning o'zida beshtagacha namunani qayta ishlash qobiliyati, uning qisqartirilgan, alkillangan va hazm qilingan ish oqimlari bilan mosligi CupHornni MS asosidagi proteomika uchun ishonchli vositaga aylantiradi.
CupHorn SonoReactor haqida ko'proq bilib oling!

Nanozarrachalar bilan immobilizatsiyalangan tripsin yordamida ultratovush yordamida proteolitik hazm qilish uchun bosqichma-bosqich protokol

Martins va boshqalar tomonidan tuzilgan ushbu protokol. (2019) ultratovush energiyasi va nanozarrachalar bilan immobilizatsiyalangan tripsin (T-FMNP) yordamida oqsillarni tez hazm qilish uchun optimallashtirilgan. Belgilangan qadamlar mass-spektrometriya (MS) ilovalari uchun mos keladigan samarali reduksiya, alkillanish va proteolizni ta'minlaydi.
Protokol bosqichlari

1. Disulfid aloqalarining qisqarishi
   • AmBic buferidagi 20 µL protein namunasiga (0,5 mg/ml) 2 µL DTT eritmasi (110 mM) qo‘shing.
   • Namuna trubkasini UP200St-CupHorn sonoreaktoriga joylashtiring.
   • Namunani 50% amplituda (200 Vt, 26 kHz) 2,5 daqiqa davomida sonikatsiya qiling.
   • Sovutish uchun qisqa vaqt oralig'ida pauza qiling, so'ngra xuddi shu sharoitda yana 2,5 daqiqa sonikatsiya qiling.
2. Reduksiyalangan sistein qoldiqlarining alkillanishi
   • Kamaytirilgan oqsil namunasiga 2 mkl IAA eritmasidan (400 mM) qo'shing.
   • Alkillanishni osonlashtirish uchun 50% amplituda 2,5 daqiqa davomida sonikatsiya qiling.
   • Sovutish uchun pauza qiling, keyin qo'shimcha 2,5 daqiqa davomida sonikatsiya qiling.

   Eslatma: IAA degradatsiyasini oldini olish uchun alkillangan namunaning yorug'lik ta'sirini minimallashtiring.

3. Namuna suyultirish
   • Alkillangan oqsil namunasini 4% asetonitril (v/v) o'z ichiga olgan 25 mM AmBic buferidan foydalanib, yakuniy hajm 100 µL gacha suyultiring.
   • Yumshoq pipetleme orqali yaxshilab aralashtiring.
4. Nanozarracha-immobilizatsiyalangan tripsin bilan proteolitik hazm qilish
   • Suyultirilgan oqsil namunasiga 20 µL T-FMNP eritmasi (3 mg/ml) qo‘shing.
   • Aralashmani sonoreaktorda 2,5 daqiqa davomida 50% amplituda sonikatsiya qiling.
   • Sovutish uchun pauza qiling, keyin bir xil sharoitda yana 2,5 daqiqa sonikatsiya qiling.
5. Tripsin nanozarrachalarini ajratish
   • T-FMNPlarni hazm qilingan peptidlarni o'z ichiga olgan supernatantdan ajratish uchun magnitdan foydalaning.
   • Supernatantni yangi mikrotsentrifuga naychasiga o'tkazing.
6. MS tahlili uchun peptid tayyorlash
   • Peptidlarni o'z ichiga olgan supernatantni vakuumli santrifugada quriting.
   • Quritilgan peptidlarni -20°C da massa-spektrometriya yordamida keyingi tahlilga qadar saqlang.