Oqsillarni yuqori unumdorlikda parchalash bilan proteomik ish jarayonlari

Proteomika biologik jarayonlar va tizimlarni tushunish uchun muhim soha boʻlib, oqsillarni parchalash uning ish jarayonlaridagi hal qiluvchi bosqichdir. Anʼanaviy ravishda oqsillar eritmada tripsin kabi proteolitik fermentlar yordamida parchalanadi; tripsin lizin va arginin qoldiqlaridagi peptid bogʻlarini oʻziga xos tarzda gidrolizlaydi. Bu jarayonda mass-spektrometriya (MS) qoʻllanmalarida ionlashtirish va fragmentatsiya uchun juda mos peptidlar hosil boʻladi. Biroq odatiy parchalash usullari toʻliq yakunlanishi uchun 12–24 soat talab qiladi, bu esa proteomik ish jarayonlarida sezilarli toʻsiqlarni yuzaga keltiradi.
Ultratovush bilan ishlov berish kuchli muqobil usul boʻlib, parchalash vaqtini soatlardan atigi bir necha daqiqagacha keskin qisqartiradi. Hielscher CupHorn, VialTweeter va 96 uyachali plastinka uchun UIP400MTP kabi ilgʻor, bir nechta namunaga ishlov beruvchi ultratovush qurilmalari bilan birgalikda ultratovush bilan ishlov berish tezlashtirilgan, yuqori unumdorlikdagi proteomikani amalga oshirish imkonini beradi. Bu texnologiyalar ish jarayonlarini soddalashtiradi, natijalarning takrorlanuvchanligi yoki maʼlumotlar sifatiga putur yetkazmasdan namunalarni tayyorlash vaqtini qisqartiradi va samaradorlikni oshiradi.

Oqsillarni parchalashda ultratovush energiyasining roli

Ultratovush bilan ishlov berishda fokuslangan ultratovush toʻlqinlari yordamida kavitatsiya hosil qilinadi – bunda mahalliy mikropufakchalar qulab, kuchli siljish kuchlarini yuzaga keltiradi. Bu hodisa massa almashinuvini kuchaytiradi, fermentlarning substratlar bilan aralashishiga yordam beradi va oqsil tuzilmalarini yoyib, parchalanish joylarini tripsin kabi proteolitik fermentlar uchun ochadi.
Natijasi qanday? Samaradorlik yoki natijalarning takrorlanuvchanligiga putur yetkazmasdan parchalash vaqtining sezilarli qisqarishi.

Ultratovush yordamida kuchaytirilgan proteolitik parchalash: metodologiya va natijalar

Tezlashtirilgan parchalash protokoli

Ultratovush yordamida parchalash ish jarayonlarini tezlashtirish uchun proteolitik fermentlar va ultratovush energiyasini birlashtiradi. Masalan, Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) yordamida parchalash ish jarayoni quyidagicha amalga oshiriladi:

1. Qaytarish: oqsil namunalariga (0,5 mg/mL, 20 µL) ammoniy bikarbonat buferida (12,5 mM) DTT (2 µL, 110 mM) bilan ishlov beriladi. Ultratovush bilan ishlov berish 50% amplitudada 5 daqiqa davomida amalga oshiriladi.
2. Alkillash: IAA (2 µL, 400 mM) qoʻshilgandan soʻng, ultratovush bilan ishlov berish xuddi shu sharoitlarda takrorlanadi.
3. Parchalash: namunalar suyultiriladi va tripsin immobilizatsiyalangan nanozarrachalar bilan inkubatsiya qilinadi. Ultratovush bilan ishlov berishning yakuniy bosqichi (5 daqiqa) parchalashni tugallaydi. Peptidlar ajratiladi, quritiladi va MS tahlili uchun saqlanadi.

Bu ultratovush usuli umumiy tayyorlash vaqtini 12 soatdan 30 daqiqadan kam vaqtgacha qisqartiradi. Jarayon tezlashtirilganiga qaramay, peptidlarning chiqish miqdori va sifati anʼanaviy, tun davomida amalga oshiriladigan usullarnikiga mos boʻlib qoladi.

Oqsillarni ultratovush yordamida parchalash samaradorligi

E. coli proteomlaridan foydalanilgan qiyosiy tadqiqotlarda:

• Oqsillarni aniqlash: Ultratovush yordamida parchalangan namunalarda 5 daqiqada 777 ta oqsil aniqlangan, 12 soatlik parchalashda esa 817 ta oqsil aniqlangan. Har ikkala usulda aniqlangan umumiy oqsillar ulushi 70% dan oshgan.
• Natijalarning takrorlanuvchanligi: Takroriy tahlillar har bir usul doirasida 98% dan yuqori korrelatsiya qiymatlarini koʻrsatib, ishonchlilikni namoyon qilgan.
• Selektivlik: Har bir usulda ayrim oqsillar afzalroq parchalangan: ultratovush yordamida parchalash 65 ta oqsil uchun, tun davomida parchalash esa 54 ta oqsil uchun afzal boʻlgan. Bunday nozik farqlar ultratovush bilan ishlov berishning muayyan qoʻllanmalar uchun oʻziga xos imkoniyatlarini taʼkidlaydi.

E. coli
namunasiga qoʻshilgan yettita oqsilning belgisiz miqdoriy tahlil natijalari. Quyidagi oqsillar
«Theo Ratio» deb nomlangan ustunda koʻrsatilganidek, ikki xil darajada qoʻshilgan. Theo Ratio – ushbu
tajribada ishlatilgan ikki daraja oʻrtasidagi nazariy nisbat. Qoramol zardobi albumini (ALBU), β-laktoglobulin (LACB), α-S1 kazein (CASA1),
α-S2 kazein (CASA2), sitoxrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) va karboangidraza 2
(CAH2). Nisbatlarni hisoblash uchun MaxQuant
tahlilidan olingan LFQ oqsil intensivliklari ishlatildi. Har bir usul bilan olingan qiymatlarni solishtirish uchun Styudentning t-testi qoʻllanildi (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Tadqiqot va grafik: © Martins et al., 2019)

Nanozarrachalarda immobilizatsiyalangan tripsin

Tripsin immobilizatsiyalangan nanozarrachalarni (masalan, T-FMNPs) ultratovush bilan ishlov berish bilan birlashtirish proteomika ish jarayonlarini yanada yaxshilaydi. Bu nanozarrachalar ferment va substrat oʻrtasidagi oʻzaro taʼsirlar uchun katta sirt maydonini taʼminlab, samaradorlikni oshiradi. E. coli kabi murakkab proteomlarga qoʻllanganda, birlashtirilgan usul quyidagi natijalarga erishadi:

• Tezlik: 5 daqiqa ichida toʻliq parchalash.
• Aniqlik: Anʼanaviy usullarnikiga qiyoslanadigan oqsil miqdorini aniqlash (p > 0,01, n=3).
• Koʻlamni kengaytirish imkoniyati: UIP400MTP kabi koʻp uyachali platformalarga moslashtirish yuqori unumdorlikda ishlov berish imkonini yaratadi.

Bosqichma-bosqich koʻrsatmalar berilgan batafsil protokol uchun bu yerni bosing!
(qarang: Martins et al., 2019)

Hielscher ultratovush qurilmalari bilan yuqori tezlik va yuqori unumdorlikda proteolitik parchalash

Proteomika uchun eng yaxshi ultratovush qurilmasi modellari

Hielscher Ultrasonics yuqori unumdorlikdagi ish jarayonlarini osonlashtiradigan, bir nechta namunani bir vaqtda tayyorlash uchun turli ultratovush qurilmasi modellarini taklif etadi. Flakonlar, probirkalar, koʻp uyachali plastinkalar (masalan, 6, 24, 96 uyachali plastinkalar) yoki Petri idishlari bilan ishlashingizdan qatʼi nazar – biz tajribalaringiz uchun ideal ultratovush qurilmalarini taklif etamiz.

Koʻp uyachali plastinka uchun UIP400MTP ultratovush qurilmasi

Eng yuqori namunaga ishlov berish unumdorligi uchun UIP400MTP 96 uyachali plastinkalarga ultratovush bilan ishlov berish imkoniyatini taʼminlaydi. Har qanday standart mikroplastinkaga mos keluvchi UIP400MTP qimmat, faqat muayyan ishlab chiqaruvchiga xos bir martalik sarf materiallarini talab qilmaydi va tadqiqotingiz uchun eng yaxshi koʻp uyachali plastinkani tanlash erkinligini beradi. Plastinka boʻylab bir tekis energiya yetkazib, u atigi 1 soat ichida 200 tagacha murakkab proteomni tez qaytarish, alkillash va parchalash imkonini beradi. Bunday avtomatlashtirish va samaradorlik darajasi yuqori unumdorlikdagi proteomika va klinik qoʻllanmalar uchun hal qiluvchi ahamiyatga ega. Koʻp uyachali plastinka uchun ultratovush qurilmasi haqida koʻproq bilib oling!

VialTweeter

VialTweeter 10 tagacha flakon yoki probirkaga bir vaqtda ultratovush bilan ishlov berish talab qilinadigan laboratoriyalar uchun moslashtirilgan. Uning noinvaziv yondashuvi oqsillarni parchalash natijalarining takrorlanuvchanligini taʼminlash bilan birga, oʻzaro ifloslanish xavflarini bartaraf etadi. Bu qurilma namuna hajmlari cheklangan yoki namuna turlari xilma-xil boʻlgan sharoitlarda ishlaydigan tadqiqotchilar uchun idealdir.
Bir nechta probirka uchun VialTweeter ultratovush qurilmasi haqida koʻproq bilib oling!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn ultratovush qurilmasi germetik yopilgan idishlardagi bir nechta namunaga bir vaqtda ishlov berish uchun moʻljallangan kuchli qurilmadir. U ultratovush energiyasining bir tekis taqsimlanishini va haroratni aniq nazorat qilishni taʼminlaydi. Bir vaqtning oʻzida beshtagacha namunaga ishlov berish imkoniyati hamda qaytarish, alkillash va parchalashni oʻz ichiga olgan ish jarayonlariga mosligi CupHorn qurilmasini MS asosidagi proteomika uchun ishonchli vositaga aylantiradi.
CupHorn SonoReactor haqida koʻproq bilib oling!

Nanozarrachalarda immobilizatsiyalangan tripsin yordamida ultratovush koʻmagida proteolitik parchalash boʻyicha bosqichma-bosqich protokol

Martins et al. (2019) tomonidan ishlab chiqilgan ushbu protokol ultratovush energiyasi va nanozarrachalarda immobilizatsiyalangan tripsin (T-FMNPs) yordamida oqsillarni tez parchalash uchun optimallashtirilgan. Bayon qilingan bosqichlar mass-spektrometriya (MS) qoʻllanmalariga mos samarali qaytarish, alkillash va proteolizni taʼminlaydi.
Protokol bosqichlari

1. Disulfid bogʻlarini qaytarish
   • AmBic buferidagi 20 µL oqsil namunasiga (0,5 mg/mL) 2 µL DTT eritmasini (110 mM) qoʻshing.
   • Namuna solingan probirkani UP200St-CupHorn sonoreaktoriga joylashtiring.
   • Namunaga 50% amplitudada (200 W, 26 kHz) 2,5 daqiqa davomida ultratovush bilan ishlov bering.
   • Sovishini taʼminlash uchun qisqa tanaffus qiling, soʻng xuddi shu sharoitlarda yana 2,5 daqiqa ultratovush bilan ishlov bering.
2. Qaytarilgan sistein qoldiqlarini alkillash
   • Qaytarilgan oqsil namunasiga 2 µL IAA eritmasini (400 mM) qoʻshing.
   • Alkillashga yordam berish uchun 50% amplitudada 2,5 daqiqa davomida ultratovush bilan ishlov bering.
   • Sovishi uchun tanaffus qiling, soʻng qoʻshimcha 2,5 daqiqa ultratovush bilan ishlov bering.

   Eslatma: IAA parchalanishining oldini olish uchun alkillangan namunaning yorugʻlik taʼsiriga uchrashini imkon qadar kamaytiring.

3. Namunani suyultirish
   • Tarkibida 4% atsetonitril (v/v) boʻlgan 25 mM AmBic buferi yordamida alkillangan oqsil namunasini yakuniy hajmi 100 µL boʻlguncha suyultiring.
   • Pipetka bilan ehtiyotkorlik bilan olib-qayta chiqarish orqali yaxshilab aralashtiring.
4. Nanozarrachalarda immobilizatsiyalangan tripsin bilan proteolitik parchalash
   • Suyultirilgan oqsil namunasiga 20 µL T-FMNP eritmasini (3 mg/mL) qoʻshing.
   • Aralashmaga sonoreaktorda 50% amplitudada 2,5 daqiqa davomida ultratovush bilan ishlov bering.
   • Sovishi uchun tanaffus qiling, soʻng xuddi shu sharoitlarda yana 2,5 daqiqa ultratovush bilan ishlov bering.
5. Tripsin immobilizatsiyalangan nanozarrachalarni ajratish
   • T-FMNPs ni parchalash natijasida hosil boʻlgan peptidlarni oʻz ichiga olgan supernatantdan ajratish uchun magnitdan foydalaning.
   • Supernatantni yangi mikrosentrifuga probirkasiga oʻtkazing.
6. Peptidlarni MS tahliliga tayyorlash
   • Peptidlarni oʻz ichiga olgan supernatantni vakuumli sentrifugada quriting.
   • Quritilgan peptidlarni keyingi mass-spektrometriya tahliligacha -20°C da saqlang.