DNKni ultratovush yordamida fragmentlash

DNK va RNKni fragmentlashda uzun DNK molekulalari kichikroq boʻlaklarga ajratiladi; bu yangi avlod sekvenslash (NGS) kutubxonasini yaratish uchun namunalarni tayyorlashdagi muhim bosqichdir. DNKni ultratovush yordamida fragmentlashda DNK yoki RNKni 100 bp dan 5 kb gacha boʻlgan fragmentlarga ajratish uchun akustik kavitatsiya kuchlaridan foydalaniladi. Bu usul fragment oʻlchamini aniq nazorat qilish imkonini beradi va sekvenslashning maqbul natijalariga erishish uchun kerakli DNK uzunligini moslashtirishni osonlashtiradi.

Ultratovush bilan ishlov berish orqali DNKni fragmentlash

Hielscher Ultrasonics DNK, RNK va xromatinni fragmentlash uchun ultratovushga asoslangan turli yechimlarni taklif etadi. Mikrouchlik yordamida bevosita ultratovush bilan ishlov berish uchun zond turidagi ultratovush qurilmasini (masalan, UP100H) tanlang yoki turli namunalardagi DNKni bir vaqtda bilvosita tayyorlash uchun VialTweeeter yoxud ultratovushli cuphorn qurilmasidan foydalaning. Hielscher ehtiyojlaringizni hisobga olib ideal qurilmani taklif etadi: sizda 1 ta yoki 10 tagacha namuna boʻlishidan, hajmlar mikrolitrdan litrgacha boʻlishidan qatʼi nazar, Hielscher ultratovush qurilmalari DNK, RNK va xromatin fragmentlarini kerakli uzunlikda tayyorlash boʻyicha talablaringizni qondiradi. Takrorlanuvchanlik, oson boshqarish va aniq nazorat yangi avlod sekvenslash uchun ishonchli kutubxona yaratish imkonini beradi.
DNKni fermentativ fragmentlashdan farqli ravishda, ultratovush yordamida fragmentlash hech qanday kimyoviy moddalar qoʻshmasdan sof mexanik siljish kuchlarini qoʻllaydi. Jarayon parametrlarini aniq sozlash orqali ultratovush yordamida fragmentlash yuqori molekulyar massali DNK fragmentlarini (plazmid va genom DNKsi) hosil qiladi.
Tozalangan nuklein kislotalarni fragmentlash bosqichidan oldin yoki keyin amplifikatsiya qilish mumkin.
Ultratovush bilan ishlov berish parametrlarini (quvvat, impuls sikli / impulslar seriyasi, vaqt va harorat) dasturiy sozlamalar orqali xavfsiz boshqarish mumkin.

DNKni ultratovush yordamida fragmentlash protokollari

Xromatin immunopretsipitatsiyasi tahlili uchun

Qisqacha, hujayralar diametri 60mm boʻlgan idishlarga ekildi (har bir idishga 400 000 ta) va RhoA siRNA bilan transfeksiya qilindi (taʼriflanganidek); 72 h dan keyin oqsillarni DNK bilan koʻndalang bogʻlash uchun ular formaldegid bilan (yakuniy konsentratsiya, 1%) 37°C da 10 min inkubatsiya qilindi. Koʻndalang bogʻlanish reaksiyasi hajmning oʻndan bir qismiga teng miqdorda 1,25 mol/L glitsin qoʻshib toʻxtatildi, bunda yakuniy konsentratsiya 125 mmol/L boʻldi. Hujayralar muzdek PBS bilan ikki marta yuvildi, tarkibida 1 mmol/L fenilmetilsulfonil ftorid, 1 Ag/mL aprotinin va 1 Ag/mL pepstatin A boʻlgan radioimmunopretsipitatsiya tahlili buferida [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% dezoksixolat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] qayta suspenziyalandi va muz ustida 30 min saqlandi. Soʻng hujayra lizatlariga muz ustida Hielscher UP200S ultratovush qurilmasi (3 x 40 s, amplituda 40%, sikl 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) yordamida koʻndalang bogʻlangan xromatinlar 200 dan 1 000 bp gacha boʻlgan DNK fragmentlarini hosil qilguncha ishlov berildi. Turli namunalardagi DNK miqdorini aniqlash uchun butun lizatning oʻndan bir qismi ishlatildi va u «jami kirish DNKsi» deb hisoblandi. Nospetsifik fonni kamaytirish uchun supernatantlar losos spermasi DNKsi/oqsil agaroza-50% suspenziyasi bilan inkubatsiya qilindi. Soʻng immunopretsipitatsiya 4°C da tun davomida 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) bilan yoki antitanasiz (manfiy nazorat) oʻtkazildi. Ushbu supernatantlarga 5 mol/L NaCl qoʻshildi va oqsil-DNK koʻndalang bogʻlarini qaytarish uchun 65°C da tun davomida qizdirildi. Immunokomplekslarga keyinchalik DNaza va RNazadan xoli proteinaza K bilan ishlov berildi, DNK esa fenol/xloroform ekstraksiyasi va etanol bilan choʻktirish orqali tozalandi. PCR inson iNOS genining promotor hududidagi ketma-ketlikka mos keluvchi maxsus praymerlar bilan bajarildi (p1 praymer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 praymer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP ekspressiyasi tadqiqotlari

Ekspressiya tadqiqotlari uchun EGFP (kuchaytirilgan yashil fluoressent oqsil) geni xromosomadagi ssu hududiga integratsiyalangan rekombinant L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 shtammi (Jena Bioscience, Germaniya) avval taʼriflanganidek turli muhitlarda oʻstirildi; muhitlarga qoʻshimcha ravishda 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Germaniya) qoʻshildi. Oʻstirish davomida 1 ml namunalar olindi, sentrifugalandi (2000 × g, 20°C, 10 min) va 0,9% NaCl eritmasi bilan yuvildi. Choʻkma buferda (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) qayta suspenziyalandi va ultratovush bilan ishlov berish orqali parchalandi; bunda ultratovush protsessori UP400S ishlatildi (qoʻllangan energiya ∼ 400 Ws). Hujayra qoldiqlari sentrifugalash orqali chiqarib tashlandi (6000 × g, 4°C, 5 min) va Laemmli (1970) usuliga muvofiq qaytaruvchi sharoitlarda 12,5% poliakrilamid gellari bilan natriy dodetsil sulfat – poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) yordamida tahlil qilindi. EGFP ekspressiyasi aralashtirib turilgan kulturada tekshirildi. (Fritsche et al. 2007)

Xromatin immunopretsipitatsiyasi

Xromatin immunopretsipitatsiyasi tahlili ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, AQSh) yordamida ishlab chiqaruvchining koʻrsatmalariga muvofiq, ayrim oʻzgartirishlar bilan oʻtkazildi. Qisqacha, differensiallashgan inson podotsitlari xona haroratida 10 min davomida 1% formaldegid bilan koʻndalang bogʻlandi. Hujayralar muzdek PBS bilan yuvildi va fiksatsiya reaksiyasi xona haroratida 5 min davomida 0,125 M glitsin qoʻshish orqali toʻxtatildi. Hujayralar yana muzdek PBS bilan yuvildi va idishdan qirib olindi. Hujayralar sentrifugalash orqali choʻktirildi va lizis buferida qayta suspenziyalandi. Sentrifugalashdan soʻng choʻktirilgan yadrolar fragmentlash buferida qayta suspenziyalandi, muz ustida 30 min inkubatsiya qilindi va xromatin ultratovush bilan ishlov berish orqali fragmentlandi, masalan, UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germaniya) yordamida muz ustida 25% quvvatda, har biri 20 sec boʻlgan 5 ta impuls bilan taxminan 200–600 bp fragmentlarga ajratildi. Soʻng fragmentlangan xromatin sentrifugalandi va supernatant yigʻib olindi. Immunopretsipitatsiya uchun 60 μl xromatin 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, AQSh), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Buyuk Britaniya) yoki NF-κB p50 (Abcam) antitanalari bilan yoxud manfiy nazorat sifatida quyon IgGsi (Zymed Laboratories) bilan 4°C da tun davomida sekin aylantirish bilan inkubatsiya qilindi. Magnit donachalarga bogʻlangan immunokomplekslar magnit stend yordamida yigʻib olindi, yaxshilab yuvildi, oqsil/DNK koʻndalang bogʻlari qaytarildi va DNK real vaqt PCR tahlili uchun elutsiya qilindi. (Ristola et al. 2009)

Chip matritsasi tahlili uchun EHEC DNKsini tayyorlash

Hujayra lizatlari va ekstraksiya qilingan DNKlarni tayyorlash
PBS da kerakli yakuniy konsentratsiyagacha suspenziyalangan bakterial choʻkmalarga ishlov berishda UP100H ultratovushli parchalash qurilmasi (Hielscher GmbH, Germaniya) ishlatildi; qurilma MS1 mikrouchligi (diametri 1 mm) bilan jihozlangan edi. Ish chastotasi 30 kHz, samarali chiqish quvvati esa 100 W edi. Ishlov berish davomida namunalar muzli suv hammomida sovutildi, aralashtirildi va sentrifugalandi. Namunalar oqim sitometriyasi tadqiqotlari uchun ishlatildi, keyingi ishlov berish uchun esa namunalarga issiqlik bilan ishlov berildi (95°C, 5 min). Xom hujayra lizatlariga fenol:xloroform:izoamil spirti aralashmasi (25:24:1) bilan ishlov berildi. Lizat namunasiga ushbu aralashmadan teng hajm qoʻshildi, eritma vorteksda 15 s davomida kuchli aralashtirildi va taxminan 22°C xona haroratida (RT) 15 000 x g da 2 min davomida sentrifugalandi. Genomik DNKni oʻz ichiga olgan yuqori suvli faza ehtiyotkorlik bilan ajratildi va yangi steril Eppendorf probirkasiga yigʻildi.
Keyinchalik, DNKni parchalash uchun namunalar sonikatsiya qilindi. Sonikatsiya bosqichi yuqorida tavsiflangan sharoitlarda amalga oshirildi. Genomik DNKga parchalanish ta’sirini baholash uchun namunalar agaroz gel elektroforezi yordamida tahlil qilindi.
(…) Avval 2,5 min davomida sonikatsiya qilingan namunalar issiqlik bilan ishlov berish va sentrifugalashdan soʻng ekstraksiya bosqichidan oʻtkazildi. Ajralib chiqqan DNK fenol:xloroform:izoamil spirti aralashmasi bilan ikki marta ekstraksiya qilindi, soʻngra 0 – 15 min davomida ikkinchi marta sonikatsiya qilindi. Ekstraksiyadan keyin ultratovush yordamida parchalangan DNKning oʻlchamlar boʻyicha taqsimotini aniqlash uchun agaroz gel elektroforezidan foydalanildi (yuqori oʻng tomondagi rasm). DNKning kuchli parchalanganligi yuqori molekulyar ogʻirlikdagi chiziqlar oʻrniga DNKning yoyilgan izi mavjudligidan yaqqol koʻrindi; bu chiziqlar 2,5 min yoki undan uzoqroq sonikatsiya qilingan namunalarda yoʻqolgan edi. Uzoqroq sonikatsiya fragmentlar uzunligini asta-sekin taxminan 150 – 600 bp gacha qisqartirdi, 15 min davomidagi sonikatsiya esa bu fragmentlarni yanada parchaladi, bu asosan izning yuqori qismida koʻrinadi. Shunday qilib, DNK fragmentlarining oʻrtacha oʻlchami ultratovushli ishlov berish davomiyligi ortishi bilan asta-sekin kamaydi va 5 min ishlov berish chip massivi tahlillari uchun eng mos DNK fragmentlari oʻlchamlarini olish imkonini berdi. Nihoyat, avval 2 min ultratovushli ishlov berish, DNK ekstraksiyasi (2×) va keyingi 5 min sonikatsiyadan iborat DNK analitini tayyorlash tartibi ishlab chiqildi. (Basselet et al. 2008)

Xromatin immunopretsipitatsiyasi (ChIP)

HEK293 hujayralari yuqorida taʼriflanganidek oʻstirildi va xona haroratida 45 min davomida 2 mM disuksinimidil-glutarat bilan fiksatsiya qilindi. Keyin hujayralar PBS bilan ikki marta yuvildi. Xromatin xona haroratida 10 min davomida 1% (v/v) formaldegid yordamida koʻndalang bogʻlandi va muzdek PBS bilan ikki marta yuvildi. Koʻndalang bogʻlanish reaksiyasi xona haroratida 5 min davomida yakuniy konsentratsiyasi 0,125 M boʻlgan glitsin bilan inkubatsiya qilish orqali toʻxtatildi. Tripsin bilan inkubatsiya qilingandan soʻng hujayralar hujayra kulturasi idishidan qirib olindi va PBS bilan ikki marta yuvildi. Hujayra choʻkmasi lizis buferida (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl va 0,5% (v/v) Nonidet P-40) qayta suspenziyalandi, muz ustida 10 min inkubatsiya qilindi va Dounce gomogenizatori bilan gomogenizatsiya qilindi. Keyin yadrolar sentrifugalash orqali choʻktirildi (3500 x g, 5 min, 4 °C) va yadrolar buferida (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA va 1% (w/v) SDS) qayta suspenziyalandi. Yadrolar ultratovush bilan uchta 20-s impuls yordamida parchalandi; bunda UP50H ultratovush qurilmasi (Hielscher Ultraschall Technologie) sikl 0,5 va amplituda 30% sozlamalarida ishlatildi, natijada fragmentlarning asosiy qismi oʻlchami 200 – 1000 bp boʻlgan genom DNKsi hosil boʻldi. ChIP uchun 50g DNK immunopretsipitatsiya buferida (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 va 0,01% (w/v) SDS) 4 baravar suyultirildi. (Weiske et al. 2006)

Xromatin immunopretsipitatsiyasi (ChIP) yordamida giston modifikatsiyalarini tahlil qilish

Qisqacha, 6 x 10⁶ ta hujayra PBS bilan ikki marta yuvildi va kultura plastinkasida xona haroratida 15 min davomida 0,5% formaldegid ishtirokida koʻndalang bogʻlandi. Koʻndalang bogʻlanish reaksiyasi 0,125 M glitsin qoʻshib toʻxtatildi. Barcha keyingi bosqichlar 48°C da bajarildi. Barcha buferlar oldindan sovitilgan va tarkibida proteaza ingibitorlari (Complete Mini, Roche) boʻlgan. Hujayralar PBS bilan ikki marta yuvildi va keyin qirib olindi. Yigʻilgan choʻkmalar 1 ml lizis buferida (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) eritildi va sovuq etanol hammomida 100% amplitudada 10 sikl davomida ultratovush bilan ishlov berildi; bunda UP50H ultratovush qurilmasi (Hielscher, Teltow, Germaniya) ishlatildi. Xromatin fragmentlanishi 1% agaroza gelida koʻrinarli holga keltirildi. Olingan fragmentlar 200–500pb oraligʻida boʻldi. Eruvchan xromatin ultratovush bilan ishlov berilgan namunalarni 48°C da 10 min davomida 14 000g da sentrifugalash orqali olindi. Eruvchan fraksiya suyultirish buferida (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) 1/10 nisbatda suyultirildi, keyin alikvotalarga boʻlindi va foydalanilguncha 80°C da saqlandi. (Rodriguez et al. 2008)