Ultrasonik DNKni kesish

DNK va RNKni kesish jarayonida uzun DNK molekulalari kichikroq bo'laklarga bo'linadi, bu keyingi avlod sekvensiyasi (NGS) kutubxonasini qurish uchun namunalar tayyorlashda muhim qadamdir. Ultrasonik DNKni kesish DNK yoki RNKni 100 bp dan 5 kb gacha bo'lgan qismlarga ajratish uchun akustik kavitatsiya kuchlarini ishlatadi. Ushbu usul fragment o'lchamini aniq nazorat qilish imkonini beradi va optimal ketma-ketlik natijalari uchun kerakli DNK uzunligiga moslashtirishni osonlashtiradi.

Ultrasonikatsiya yordamida DNKni kesish

Hielscher Ultrasonics DNK, RNK va xromatinni kesish uchun ultratovushga asoslangan turli xil echimlarni taklif qiladi. Mikrotip yordamida to'g'ridan-to'g'ri sonikatsiya qilish uchun zond tipidagi ultratovush apparatlarini (masalan, UP100H) tanlang yoki bir vaqtning o'zida turli xil namunalarning bilvosita DNKsini tayyorlash uchun VialTweeeter yoki ultratovushli kupadan foydalaning. Hielscher sizning ehtiyojlaringizni inobatga olgan holda ideal qurilmani taklif qiladi: sizda 1 yoki 10 ta namunaga ega bo'lasizmi, hajmi mikrolitrdan litrgacha. – Hielscher sonikatorlari to'g'ri uzunlikdagi DNK, RNK va xromatin parchalarini tayyorlash uchun sizning talablaringizga javob beradi. Qayta ishlab chiqarish, qulay foydalanish va aniq nazorat keyingi avlod ketma-ketligi uchun ishonchli kutubxonaga imkon beradi.
Enzimatik DNK parchalanishidan farqli o'laroq, ultratovushli kesish hech qanday kimyoviy moddalar qo'shmasdan sof mexanik kesish kuchlarini qo'llaydi. Jarayon parametrlarini aniq belgilash orqali ultratovushli kesish yuqori molekulyar og'irlikdagi DNK fragmentlarini (plazmid va genomik DNK) hosil qiladi.
Tozalangan nuklein kislotalar parchalanish bosqichidan oldin yoki undan keyin kuchaytirilishi mumkin.
Sonication parametrlari (quvvat, puls aylanishi / portlashlar, vaqt va harorat) dasturiy ta'minot sozlamalari orqali xavfsiz boshqarilishi mumkin.

Ultrasonik DNKni kesish uchun protokollar

Xromatin immunoprecipitatsiya tahlili uchun

Qisqacha aytganda, hujayralar 60 mm diametrli idishlarga solingan (har bir idish uchun 400 000 ta) va RhoA siRNK bilan transfekte qilingan (ta'riflanganidek); 72 soatdan so'ng, oqsillarni DNK bilan o'zaro bog'lash uchun formaldegid (yakuniy konsentratsiya, 1%) bilan 37 ° C da 10 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. O'zaro bog'lanish reaktsiyasi 125 mmol / L yakuniy konsentratsiyani beruvchi 1,25 mol / L glisinning o'ndan bir qismi qo'shilishi bilan o'chirildi. Hujayralar muzli sovuq PBS bilan ikki marta yuvildi, radioimmunopresipitasyon tahlili buferida qayta suspenziya qilindi [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksixolat, 0,1% SDS, 5 mmol/l EDTA, 50 mmol/L Tris-H80p. )] tarkibida 1 mmol/L fenilmetilsulfonil ftorid, 1 Ag/ml aprotinin va 1 Ag/ml pepstatin A va muz ustida 30 daqiqa ushlab turiladi. Keyin hujayra lizatlari muz ustida a Hielscher UP200S ultratovush sonikatori (3 x 40 s, amplituda 40%, sikl 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) o'zaro bog'langan kromatinlar 200 dan 1000 bp gacha bo'lgan DNK parchalarini olish uchun kesilgunga qadar. Turli namunalarda mavjud bo'lgan DNK miqdorini aniqlash uchun butun lizatning o'ndan bir qismi ishlatilgan va shunday deb hisoblangan. “umumiy kirish DNKsi”. Supernatantlar nonspesifik fonni kamaytirish uchun losos sperma DNK/protein agaroz-50% atala bilan inkubatsiya qilindi. Keyin immunoprecipitatsiya kechada 4°C da 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) bilan yoki antikorsiz (salbiy nazorat) amalga oshirildi. Ushbu supernatantlar 5 mol / L NaCl bilan to'ldirildi va oqsil-DNK o'zaro bog'lanishini qaytarish uchun kechasi 65 ° C da qizdirildi. Immunokomplekslar DNaz va RNazsiz proteinaz K bilan qo'shimcha ishlov berildi va DNK fenol / xloroform ekstraktsiyasi va etanol cho'kmasi bilan tozalandi. PCR inson iNOS genining promotor mintaqasidagi ketma-ketlikka mos keladigan maxsus primerlar bilan amalga oshirildi (p1 primeri: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primeri: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3¶). (Doublier va boshqalar, 2008)

EGFP ifodasini o'rganish

Ekspressiv tadqiqotlar uchun L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Germaniya) geni xromosomali ssu integratsiyalashgan EGFP (Kengaytirilgan yashil lyuminestsent oqsili) yuqorida tavsiflanganidek turli xil muhitlarda yetishtirildi. qo'shimcha ravishda 100 mg l bilan to'ldiriladi^-1 Nourseotritsin (Jena Bioscience, Germaniya). Kultivatsiya paytida 1 ml namunalar olindi, santrifüj qilindi (2000 × g, 20 ° C, 10 min) va 0,9% NaCl eritmasi bilan yuvildi. Pellet buferda (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) qayta to'xtatildi va ultratovushli protsessor bilan sonifikatsiya qilish orqali parchalandi. UP400S (energiyani qo'llash ~ 400 Vt). Hujayra qoldiqlari santrifüjlash (6000 × g, 4 ° C, 5 min) yo'li bilan olib tashlandi va 12,5% poliakralamid jellari bilan Laemmli (1970) usuli bo'yicha kamaytirish sharoitida natriy dodesil sulfat - poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) bilan tahlil qilindi. . EGFP-ifodasi hayajonlangan madaniyatda tekshirildi. (Fritsche va boshq. 2007)

kromatin immunopresipitsiyasi

Xromatin immunopresipitatsiyasi tahlili ChIP-IT yordamida amalga oshirildi^TM Ekspress (Active Motif, Carlsbad, CA, AQSH) ba'zi o'zgartirishlar bilan ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq. Qisqacha aytganda, differentsiatsiyalangan inson podotsitlari xona haroratida 10 daqiqa davomida 1% formaldegid bilan o'zaro bog'langan. Hujayralar muzli sovuq PBS bilan yuvildi va fiksatsiya reaktsiyasi xona haroratida 5 daqiqa davomida 0,125 M glisin qo'shilishi bilan to'xtatildi. Hujayralar yana muzdek sovuq PBS bilan yuvilib, idishdan qirib tashlandi. Hujayralar santrifüjlash yo'li bilan pelletlangan va lizis buferida qayta suspenziya qilingan. Santrifüjdan so'ng, granulalangan yadrolar kesish tamponida qayta suspenziya qilindi, muzda 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi va xromatin sonication bilan kesildi, masalan. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germaniya) 25% quvvatda har biri 20 sekundlik 5 impuls muz ustida taxminan 200-600 bp bo'laklarga. Keyin kesilgan xromatin santrifüj qilindi va supernatant yig'ildi. Immunopresipitatsiyalar uchun 60 mkl xromatin 1 mkg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, AQSH), NF-kB p65 (Abcam, Kembrij, Buyuk Britaniya) yoki NF-KB p50 (Abcam) antikorlari yoki quyon bilan inkubatsiya qilingan. IgG (Zymed Laboratories), salbiy nazorat sifatida, bir kechada 4 ° C yumshoq aylanish bilan. Magnit boncuklar bilan bog'langan immunokomplekslar magnit stend yordamida to'plangan, juda ko'p yuvilgan va oqsil / DNK o'zaro bog'liqliklari teskari va real vaqtda PCR tahlili uchun DNK elut qilingan. (Ristola va boshq. 2009)

Chip massivi tahlili uchun EHEC DNK tayyorlash

Hujayra lizatlari va olingan DNKlarning joylashishi
PBSda kerakli yakuniy konsentratsiyaga to'xtatilgan bakterial granulalar bilan ishlov berildi ultratovushni buzuvchi UP100H (Hielscher GmbH, Germaniya) mikrotipli MS1 (diametri 1 mm) bilan jihozlangan. Ishlash chastotasi 30 kHz va samarali chiqish quvvati 100 Vt edi. Amaliyot davomida namunalar muzli suv hammomida sovutilgan, aralashtiriladi va santrifüj qilinadi. Namunalar oqim sitometriyasini o'rganish uchun ishlatilgan, keyinchalik ishlov berish uchun namunalar issiqlik bilan ishlov berishdan o'tkazildi (95 ° C, 5 min). Xom hujayra lizatlari fenol: xloroform: izoamil spirti (25:24:1) aralashmasi bilan ishlangan. Ushbu aralashmaning teng hajmi lizat namunasiga qo'shildi, eritma 15 soniya davomida kuchli vortekslandi va xona haroratida (RT) 22 ° C atrofida 2 daqiqa davomida 15000 xg da santrifüj qilindi. Genomik DNKni o'z ichiga olgan yuqori suvli faza ehtiyotkorlik bilan ajratilgan va yangi steril Eppendorf trubkasida to'plangan.
Keyinchalik, DNKni parchalash uchun namunalar sonikatsiya qilindi. Sonikatsiya bosqichi yuqorida tavsiflangan sharoitlarda amalga oshirildi. Genomik DNKga parchalanish ta'sirini baholash uchun namunalar agaroz gel elektroforezi yordamida tahlil qilindi.
(…) Oldindan 2,5 daqiqa davomida soniklangan namunalar issiqlik bilan ishlov berish va santrifüjlashdan keyin ekstraksiya bosqichiga o'tkazildi. Chiqarilgan DNK ikki marta fenol: xloroform: izoamil spirti aralashmasi bilan ekstraksiya qilindi va keyin 0-15 daqiqa davomida ikkinchi sonikatsiyaga duchor bo'ldi. Agaroz gel elektroforezi ekstraksiyadan keyingi ultratovush parchalanishiga duchor bo'lgan DNKning o'lchamdagi taqsimotini aniqlash uchun ishlatilgan (yuqori o'ng tomondagi rasm). Yuqori darajada parchalangan DNK 2,5 daqiqa yoki undan ko'proq vaqt davomida ultratovush qilingan namunalardan olib tashlangan yuqori molekulyar og'irlikdagi chiziqlar emas, balki DNK smearining mavjudligidan aniq bo'ldi. Uzunroq sonikatsiya asta-sekin parcha uzunligini taxminan 150-600 bp ga qisqartirdi va 15 daqiqa davomida sonikatsiya bu parchalarni yanada yomonlashtirdi, buni asosan smearning yuqori qismida ko'rish mumkin. Shunday qilib, o'rtacha DNK fragmenti hajmi ultratovush vaqti bilan asta-sekin kamaydi va 5 minutlik davolash chip massivi tahlillari uchun eng mos bo'lgan DNK fragmentlarining o'lchamlarini olishga imkon berdi. Nihoyat, dastlabki 2 daqiqa ultratovush bilan ishlov berish, DNK ekstraktsiyasi (2 ×) va keyingi 5 daqiqa sonikatsiyani o'z ichiga olgan DNK tahlilini tayyorlash tartibi o'rnatildi. (Basselet va boshq. 2008)

Xromatin immunoprecipitatsiyasi (ChIP)

HEK293 xujayralari yuqorida ta'riflanganidek ekilgan va xona haroratida 45 daqiqa davomida 2 mM disuksinimidil-glutarat bilan mahkamlangan. Keyinchalik, hujayralar PBS bilan ikki marta yuvildi. Xromatin xona haroratida 1% (v/v) formaldegid yordamida 10 daqiqa davomida o'zaro bog'langan va muzli PBS bilan ikki marta yuvilgan. O'zaro bog'lanish reaktsiyasi xona haroratida 5 minut davomida 0,125 M yakuniy konsentratsiyada glitsin bilan inkubatsiya qilish orqali to'xtatildi. Tripsin bilan inkubatsiya qilingandan so'ng, hujayralar hujayra madaniyati idishidan qirib tashlandi va ikki marta PBS bilan yuvildi. Hujayra pelleti lizis buferida (5 mM quvurlar, pH 8,0, 85 mM KCl va 0,5% (v/v) Nonidet P-40) qayta suspenziya qilindi, 10 daqiqa davomida muzda inkubatsiya qilindi va Dounce gomogenizatori bilan homogenlashtirildi. Keyinchalik, yadrolar santrifüjlash (3500 xg, 5 min, 4 ° C) orqali granulalarga aylantirildi va yadro tamponida (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA va 1% (w/v) SDS) qayta suspenziya qilindi. Yadrolar soni 20 sekundlik uchta impuls bilan sonikatsiya bilan buzildi UP50H sonikator (Hielscher Ultraschall Technologie) tsikli 0,5 va amplitudasi 30% bo'lgan sharoitda, 200 - 1000 bp hajmdagi genomik DNK fragmentlarini beradi. ChIP uchun 50 g DNK immunoprecipitatsiya buferida 4 marta suyultirildi (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 va 0/01). v) SDS). (Weiske va boshq. 2006)

Xromatin immunoprecipitatsiyasi (ChIP) orqali giston modifikatsiyasini tahlil qilish

Qisqacha aytganda, 6 x 10⁶ hujayralar ikki marta PBS bilan yuvilgan va 0,5% formaldegid mavjudligida xona haroratida 15 daqiqa davomida madaniyat plastinkasida o'zaro bog'langan. O'zaro bog'lanish reaktsiyasi 0,125 M glitsin qo'shilishi bilan to'xtatildi. Barcha keyingi qadamlar 48 ° C da amalga oshirildi. Barcha tamponlar oldindan sovutilgan va tarkibida proteaz inhibitörleri (Complete Mini, Roche) mavjud edi. Hujayralar ikki marta PBS bilan yuvilgan va keyin qirib tashlangan. Yig'ilgan granulalar 1 ml lizis buferida (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) eritildi va sovuq etanol hammomida 10 tsikl davomida 100% amplitudada sonikatsiya qilindi. UP50H sonikator (Hielscher, Teltow, Germaniya). Xromatin parchalanishi 1% agaroz jelida ingl. Olingan qismlar 200-500pb oralig'ida edi. Eriydigan xromatin 48 ° C da 10 daqiqa davomida 14000 g da soniklangan namunalarni santrifüj qilish orqali olingan. Eriydigan fraksiya suyultirish tamponida 1/10 nisbatda suyultirildi (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), so'ngra alikotlangan va foydalanilgunga qadar 80 ° C da saqlanadi. (Rodriguez va boshq. 2008)