• DNK va RNK chiqib ketish paytida, DNK molekulalari kichik bo'laklarga bo'linadi. DNK / RNK bulish keyingi avlod sekanslama (NGS) uchun kutubxonalar yaratish zarur muhim namunasi prep qadamlardan biridir.
• Ultratovush DNK Qirqim 100 bo'laklarga DNK yoki RNK sindirish uchun akustik kavitasyonu kuchlarini foydalanadi – 5kb BP.
• Ultratovush Qirqim kerakli DNK uzunligi aniq DNK parchalanishiga va muvofiq uchun imkon beradi.

Ultratovush DNK Qirqim

Hielscher ultratovush DNK, RNK va kromatin chiqib ketish uchun turli ultratovush asoslangan echimlar taklif etadi. a mikrotip yordamida to'g'ridan-to'g'ri Sonikasyon bir tekshirish-turi ultrasonicators (masalan UP100H) o'rtasida tanlang, yoki VialTweeeter yoki bir vaqtning o'zida turli namunalarini bilvosita DNK tayyorlash uchun ultratovush cuphorn foydalaning. Hielscher sizning ehtiyojlaringizni hisobga olgan holda ideal qurilmani taqdim etadi: Agar 1 yoki 10 namunalarni, mikrotitre dan litr hajmi uchun hajmi havo – Hielscher ultratovush Protsessorlar o'ng uzunligi DNK, RNK va kromatin parchalarini tayyorlash ehtiyojlarini qondirish uchun mavjud. Yinelenebilirliği, oson foydalanish va aniq nazorat keyingi avlod sekanslama uchun ishonchli kutubxona uchun imkon beradi.
fermentativ DNK parchalanishiga farqli o'laroq, ultratovush Qirqim har qanday kimyoviy moddalar qo'shib holda sof mexanik kesish kuchlarini amal qiladi. jarayon parametrlarini aniq sozlash, ultratovush Qirqim yuqori molekulyar og'irligi DNK qismlari (plazmidi va genomik DNK) ishlab chiqaradi.
Toblangan nuklein kislotalar oldin yoki bir bulish qadam keyin amplifike mumkin.
Sonikasyon parametrlar (elektr, puls davr / yog'ilganda, vaqt va harorat) dasturiy ta'minot sozlash orqali xavfsiz nazorat qilinishi mumkin.

Ultrasonic DNK chiqib ketish protokollari

Kromatin Immunoprecipitation mesh uchun

Qisqacha aytganda, hujayralar 60 mm diametrli idishlarda (har bir taom uchun 400000 ta) plastinka bo'lib, RhoA siRNA bilan almashtirilgan (ta'rif etilganidek); 72 soatdan keyin ular DNKga o'zaro bog'laydigan oqsillarni 37 ° C da 10 daqiqada formaldehit (yakuniy konsentratsiyasi, 1%) bilan inkubatsiya qilindi. O'zaro o'zaro bog'liqlik reaktsiyasi 1.25 mol / L glisinning o'ndan bir hacminin qo'shilishi bilan söndürüldü va 125 mmol / L so'nggi konsantrasyonu berildi. Hujayralar ikki marta muzlatilgan PBS bilan yuvilib, radioimmunoprecipitatsiya tajriba tamponida [150 mmol / L NaCI, 1% NP40, 0,5% deoksikolat, 0,1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0 )] 1 mmol / L fenilmetilsulfonil florid, 1 Ag / ml aprotinin va 1 Ag / ml pepstatin A o'z ichiga olgan va 30 min davomida muz ustida saqlangan. Keyinchalik, hujayra lizatları, bir muz bilan muzlatildi Hielscher UP200S ultratovush sonikatörden (3 x 40 s, amplitudasi 40%, davr 1; Hielscher ultratovush GmbH) ko'ndalang bog'liq chromatins qadar 200 va 1000 BP o'rtasidagi DNK qismlari hosil makaslanmış edi. butun lizatının biri o'ninchi turli namunalari DNK Hozirgi miqdorini aniqlash uchun ishlatiladi va deb qabul qilindi “umumiy kiritish DNK”. Tantlar nomaxsus fon kamaytirish uchun, qizil ikra sperma DNK / protein agaroz-50% atala bilan kuluçkaya qilindi. Immunoprecipitation keyin 5 anti-SO-NB p65 ning Ag (Upstate) yoki Antikor holda (salbiy nazorat) bilan 4 ° C da kechada amalga oshirildi. Bu süpernatantlar 5 mol / L NaCl bilan to'ldirilsin va oqsil-DNK ko'ndalang yo'nalishlarga qaytish uchun 65 ° S da bir kechada isitiladi qilindi. immunocomplexes yanada DNase- va RNase-bepul proteinaz k bilan muomala qilindi, va DNK fenol / xloroform qazib olish va o'rganish çökeltme bilan saflaştırılmıştır. PCR, inson Extol geni Promouter viloyati ichidagi bir sekansa mos xos primer bilan amalga oshirildi (P1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier boshq., 2008)

EGFP-ifoda tadqiqotlar

Oldindan aytib ifoda tadqiqotlar, rekombinat turini L. tarentolae P10 :: # 12 F9Begfp1.4dBsat (Jena Bioscience, Germaniya) EGFP (Enhanced yashil floresan oqsili) uchun gen bilan, xromosomalari turli ommaviy axborot vositalarida yetishtirilgan edi, integratsiya ßu va Bundan tashqari 100 mg l bilan to'ldirilsin^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Germaniya). yetishtirish davomida 1 ml namunalari santrifüjlenmiştir, (2000 × g, 20 ° C, 10 min) olindi va 0,9% NaCl eritmasi bilan yuviladi. Shar bufer (20 mm HEPES, 5 mm EDTA, 2 mm DTT) ichida yana osildi va ultratovush protsessori bilan sonification tomonidan maydalanib ketgan edi UP400S (Energiya ariza ~ 400 WS). 12,5% polyacralamide aerozollar bilan Laemmli usuli (1970) ko'ra kamaytirish sharoitlarda poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) - Uyali iflos santrifüjleme (6000 × g, 4 ° C, 5 min) tomonidan olib va ​​natriy sulfat deodesil tomonidan tahlil qilindi . EGFP-ifoda hayajonlangan madaniyati ko'rib qilindi. (Fritsche va boshq., 2007)

Kromatin immünopresipitasyon

kromatin immünopresipitasyon sinov chip-u yordamida amalga oshirildi^TM ba'zi o'zgarishlar bilan ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga ko'ra (Active uzoqdan, Carlsbad, CA, USA) bildiraman. Qisqacha, tabaqalashtirilgan inson podocytes ko'ndalang bog'langan edi, xona haroratida 10 daqiqa davomida 1% formaldegid bilan. Hujayralar muz-sovuq PBS bilan yuvindi va mustahkamlash reaktsiya xona haroratida 0.125 M glisin 5 uchun min qo'shib to'xtatildi. Hujayralar muzdek sovuq PBS bilan yana yuviladi va idishga dan tashladilar qilindi. Xujayralari santrifüjleme bilan peletlenir va lizis tamponunda qayta süspanse qilindi. Santrifüjlemeden so'ng, urug yadrolari, chiqib ketish tamponunda qayta süspanse qilindi, 30 daqiqa davomida muz ustida inkübe va kromatin sonikasyon, masalan tomonidan kesilishi edi UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germaniya) 25% ga quvvatli 5 ta pushti 20 sekunddan iborat bo'lib, ularning har biri taxminan 200-600 bpgacha bo'lgan qismlarga aylanadi. Keyin kesilgan kromatin santrifüjlendi va süpernatant to'plandi. Immunoprecipitatsiyalar uchun 60 mg kromatin 1 mcg Sp1 (Santa Cruz Biotexnologiya, Santa Cruz, KA, AQSh), NF-KB p65 (Abkam, Kembrij, Buyuk Britaniya) yoki NF-kB p50 (Abcam) antikorlari yoki quyon IgG (Zymed laboratoriyalari, Saut San-Fransisko, KA, AQSh), salbiy nazorat sifatida, 4 ° C da zaif aylanish bilan kechada. Magnit naychalarga bog'lab qo'yilgan immunokomplekslar magnit tayanch yordamida yig'ilgan, keng tarqalgan bo'lib yuvilgan va oqsil / DNK o'zaro bog'liqligi teskari bo'lib, DNK real vaqtda PCR tahlillari uchun elimsizlangan. (Ristola va boshq., 2009)

chip array tahlil qilish uchun EHEC DNK tayyorlash

hujayra lizatları va qazib DNAlar tashkil etish
Kerakli final xamda PBS'de to'xtatib bakterial go'ngi bilan muomala qilindi ultratovush to'pi UP100H (Hielscher GmbH, Germaniya) mikrotip MS1 (diametri 1 mm) bilan jihozlangan. Operatsion chastotasi 30 kHz va samarali chiqish quvvati 100 Vt edi. Operatsiya davomida namunalar muzli suv hammomida sovutilib, aralashtirildi va santrifüj qilindi. Oqim sitometri ishlari uchun namunalar ishlatilgan, keyinroq qo'llash uchun namunalar issiqlik bilan ishlov berishga (95 ° C, 5 min) ta'sir qilingan. Xom hujayra lizatları fenol: xloroform: izoamil spirtli (25: 24: 1) aralashmasi bilan qayta ishlangan. Ushbu aralashmaning teng miqdori lizat namunasiga qo'shilgan, eritma 15 s uchun kuchli tarzda vortexed va xona haroratida (RT) 22 ° C atrofida 2 min davomida 15000 xgda santrifüj qilingan. Genomik DNKni o'z ichiga olgan eng yaxshi suvli faza diqqat bilan ajralib chiqdi va yangi steril Eppendorf trubkasida to'plandi.
Keyinchalik namunalar DNKni parchalash uchun sonikatsiyalangan. Sonication bosqichi yuqorida aytib o'tilgan sharoitlarda amalga oshirildi. Genomik DNKning parchalanish ta'sirini baholash uchun, agaroz jel elektroforezidan foydalanib, namunalar tahlil qilindi.
(…). Oldindan 2,5 daqiqa davomida sonikatlangan namunalar issiqlik bilan ishlov berish va santrifüjden so'ng ekstraksiya bosqichiga tushirildi. Chiqarilgan DNK ikki marta fenol: xloroform: izoamil spirtli aralashmasi bilan ekstrakte qilindi va keyinchalik 0 dan 15 daqiqa davomida ikkinchi sonikatsiyaga uchradi. Agarozdan keyin ekstraksiya ultratovush fragmentatsiyasiga tobe bo'lgan DNKning o'lchamini aniqlash uchun Agarozli gel elektroforez ishlatilgan (yuqoridagi rasm). Yuqori molekulyar vaznli bantlardan ko'ra DNKning tarqalishidan ancha ajratilgan DNK aniqlandi, natijada ular 2,5 soniya yoki undan ko'p sonikatlangan namunalardan yo'q qilindi. Uzunroq sonikatsiya bosqichma-bosqich parchalanish uzunligini taxminan 150-600 bpgacha kamaytirdi va 15 daqiqalik sonikatsiyada bu qismlarni yanada yomonlashdi, chunki ular asosan smearning yuqori qismi tomonidan ko'rish mumkin. Shunday qilib, ultrasonikasyon muddati bilan o'rtacha DNK fragmanı hajmi asta-sekin kamaydi va 5 daqiqa davolash, yonga qator tajribalari uchun eng munosib DNK fragmanlarının hajmini qo'lga kiritishga imkon berdi. Nihoyat, birinchi 2 min ultrasonik davolash, DNK ekstraktı (2 ×) va keyingi 5 daqiqa sonikasyonu o'z ichiga olgan DNK tahlil tayyorgarlik jarayoni tashkil etildi. (Basselet va boshq., 2008)

Kromatin Immunoprecipitation (chip)

HEK293 xujayralari yuqorida ta'riflangan tarzda madaniyatga ega va xona haroratida 45 min uchun 2 mm disuksinimidil-glutarat bilan biriktirildi. Keyinchalik hujayralar ikki marta PBS bilan yuvindi. Kromatin 1% (v / v) formaldegid yordamida xona haroratida 10 min davomida o'zaro bog'langan va muzli PBS bilan ikki marta yuvilgan. O'zaro bog'lanish reaktsiyasi xona haroratida 5 daqiqada 0,125 M yakuniy konsentratsiyada glisin bilan inkubatsiyalash orqali to'xtatildi. TRIP bilan inkubatsiyadan so'ng hujayralar hujayra madaniyati idishidan olingan va PBS bilan ikki marta yuvilgan. Hujayra pelleti liziz tamponida (5 mM quvurlar, pH 8.0, 85 mM KCl va 0.5% (v / v) Nonidet P-40) qayta suspenziyalangan, 10 daqiqada muzda inkubatsiya qilingan va Dounce homogenizatori bilan homogenlashtirilgan. Natijada yadrolar (3500 xg, 5 min, 4 ° C) santrifügasyon yo'li bilan pellet qilindi va yadro tamponunda (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mm EDTA va 1% (w / v) SDS) qayta süspanse qilindi. Nuclei sonication tomonidan buzilgan edi UP50H sonikatörden 1000 BP - tsikli 0.5 bir to'plamning (Hielscher Ultraschall Technologie) va 200 bir qismi hajmi bilan genom DNK qismlari yumshoq, 30% genlik. Chip uchun, DNK 50g immünopresipitasyon bufer (4-barobar seyreltilmiştir 16,7 mm Tris-HCl, pH 8.1, 167 mm NaCl, 1,2 mm EDTA, 1,1% (v / v) Triton X-100 va 0.01% (w / v) SDS). (Weiske va boshq., 2006)

kromatin immünopresipitasyon tomonidan histon o'zgartirish tahlil (chip)

Qisqacha, 6 x 10⁶ hujayralar PBS bilan ikki marta yuvindi va 0,5% formaldegid huzurida xona haroratida 15 daqiqa davomida madaniyat plastinka ustida ko'ndalang bog'liq. Xoch bog`lash reaktsiya 0.125 M glisini qo'shib to'xtatildi. Barcha keyingi qadamlar 48 ° S da amalga oshirildi. Barcha tamponlar oldindan sovutilgan va proteaz inhibitörlerinin (to'liq Mini, Roche) mavjud. Hujayralar PBS bilan ikki marta yuvib, keyin shilinib qilindi. To'plangan granulalar 1 ml lizis tamponu erigan edi (% 1 SDS, 5 mm EDTA, 50 mm Tris pH 8) va 100% amplitudali 10 ko'chadan bir foydalanish uchun bir sovuq o'rganish hammomida soniklendi, UP50H sonikatörden (Hielscher, Teltow, Germaniya). Kromatin bo'linishi 1% agaroz jel ingl edi. Olingan bo'laklari 200-500pb orasida edi. Eruvchan kromatin 48 ° C da 10 daqiqa davomida 14,000g da soniklendi namunalarini santrifüjleme olingan. eruvchan ulushi aralashtirish tampon bilan 1/10 suyultiriladi (1% Triton X-100, 2 mm EDTA, 20 mm Tris pH 8, 150 mm NaCl) keyin alikotlandı va foydalanish qadar 80 ° C da saqlanadi. (Rodriges va boshq., 2008)