Keyingi avlodlar uchun ultratovushli DNK parchalanishi
Keyingi avlodlar ketma -ketligi (NGS) genomik DNK zanjirlarini ketma -ket joylashtirish va genom kutubxonalarini yaratish uchun ishonchli qirqish va DNK parchalanishini talab qiladi. DNKning DNK bo'laklariga boshqariladigan bo'linishi - bu DNK ketma -ketligidan oldin namuna tayyorlashning muhim bosqichidir. Ultrasonikatsiya ma'lum uzunlikdagi DNK parchalanishining samarali va ishonchli usuli sifatida isbotlangan. Ultrasonik DNK parchalanish protokollari takrorlanadigan bo'linish natijalariga erishadi. Hielscher ultrasonikatorlari genomik DNK bo'laklari o'lchamining keng diapazonini ishlab chiqarishga qodir, ular ish parametrlari orqali aniq nazorat qilinadi. Hielscher ultratovushli DNKni qirqish tizimlari bitta va bir nechta flakonlarda, shuningdek mikroplakalarda mavjud bo'lgani uchun namunalarni tayyorlash yuqori samaradorlikka ega bo'ladi.
15 min ultrasonikleştirme - elektroforetik 0 bo'ysundirib, E. bobini EDL933 genomik DNK tahlil. L DNK merdiveninin ko'rsatadi. (Basselet va boshq., 2008)
- takrorlanadigan / takrorlanadigan natijalar
- ma'lum bir bo'lak uzunligini olish uchun aniq sozlanishi
- tez ishlash
- izchil DNK parchalanishi natijalari
- har qanday hajmdagi qurilmalar (masalan, bir nechta flakonlar yoki mikroplakalar)
- yuqori o'tkazuvchanlik
- haroratni aniq boshqarish
- oddiy, foydalanuvchilarga qulay operatsiya
Keyingi avlodlar ketma-ketligi: Kutubxonani tayyorlash uchun ultratovushli DNK parchalanishi
Keyingi avlod ketma-ketligini amalga oshirish uchun (1) kutubxona tayyorlash, (2) ketma-ketlik va (3) ma'lumotlarni tahlil qilishning uchta asosiy bosqichi bajarilishi kerak. Kutubxonaga tayyorgarlik jarayonida DNK bo'laklarga bo'linadi, so'ngra bo'laklarning uchlari bitta adenin asosini qo'shib tuzatiladi (parlatiladi) va maqsadli bo'laklar ikki qatorli DNKga aylanadi. Nihoyat, adapter deb ataladigan kiyimlar ligatsiya, PCR yoki tagmentatsiya yordamida biriktiriladi, shunda DNKning oxirgi mahsuloti ketma-ketlik uchun aniqlanishi mumkin.
Sonication yordamida DNK parchalanishi: Ayniqsa, Illumina kabi qisqa o'qiladigan ketma-ketlik texnologiyalari, DNKning uzunroq bo'laklarini oson o'qiy olmaganda, ultratovush yordamida ishonchli tarzda erishish mumkin bo'lgan DNK stendlari ma'lum hajmga bo'linishi kerak.
Ultrasonikatsiyani DNK, RNK va xromatinning parchalanishi uchun ishonchli ishlatish mumkin.
Ultrasonik DNK parchalanishi qanday ishlaydi?
Namunani akustik qayta ishlash deb ham ataladigan sonikatsiya DNKni parchalashda keng qo'llaniladigan usuldir. Ultrasonik DNKni kesish uchun namunalar nazorat ostida bo'lgan sharoitda ultratovush to'lqinlariga ta'sir qiladi. Ultrasonik DNK parchalanishining ishlash printsipi ultratovush to'lqinlari tomonidan hosil bo'ladigan tebranish va kavitatsiyaga asoslangan. Ultrasonik (akustik) kavitatsiya natijasida hosil bo'ladigan kesish kuchlari yuqori molekulyar og'irlikdagi DNK molekulalarini buzadi. Sonikatsiyaning intensivligi (amplitudasi, davomiyligi), pulsatsiya rejimi va harorati kabi sozlanishi DNK bo'laklarining ma'lum bir uzunligiga aniq DNK parchalanishiga imkon beradi. Ultrasonikatsiya yordamida DNK tez -tez 100 dan 600 bp gacha kamayadi, engil ultratovushli sharoitlar qo'llanilganda 1300 bp gacha bo'lgan uzunroq DNK bo'laklarini olish mumkin.
Chip paytida ultratovushli DNKni qirqish – Kromatin immünopresipitasyon
CC-BY-SA.03 ostida Jkwchui-dan moslashtirilgan
DNK degradatsiyasini oldini olish uchun haroratni nazorat qilish
DNKning ikki simli molekulyar shakli yuqori haroratga juda sezgir, shuning uchun namuna tayyorlash bosqichida haroratni aniq nazorat qilish ishonchli tahlil natijalari uchun hal qiluvchi omil hisoblanadi.
Siz Hielscherning zondli ultrasonikatorlaridan foydalanasizmi, VialTweeter yoki UIP400MTP – harorat sensori va aqlli qurilma dasturi tufayli haroratni doimiy nazorat qilish va nazorat qilish ta'minlanadi. Haroratni ma'lum bir chegarada ushlab turish uchun siz yuqori va pastki harorat chegarasini o'rnatishingiz mumkin. Shunday qilib, ultrasonikator harorat chegarasi oshib ketishi bilan pauza qiladi va harorat ∆T ga pasayganda avtomatik ravishda sonikatsiyani davom ettiradi.
Hielscher ultrasonikatorlarining murakkab dasturiy ta'minoti namunalarni davolash uchun ideal sharoitlarning ishonchli saqlanishini ta'minlaydi.
UIP400MTP ko'p quduqli plastinkali ultrasonikator yordamida DNKning ommaviy namunaviy parchalanishi
So'nggi o'n yil ichida hayot fanida namunalar soni sezilarli darajada oshdi. Bu shuni anglatadiki, taqqoslanadigan va to'g'ri natijalarga erishish uchun namunalarni tayyorlash va tahlil qilishda doimiy ravishda teng sharoitda juda ko'p miqdordagi namunalar (masalan, har bir mikroplakada 384, 1536 yoki 3456 quduq) qayta ishlanishi kerak. UIP400MTP yordamida Hielscher Ultrasonics namunalarni ommaviy qayta ishlash tendentsiyasini kuzatmoqda. UIP400MTP - mikroplakalar yordamida namuna tayyorlash uchun ultrasonikator. UIP400MTP 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 yoki 3456 quduqli plitalarni qayta ishlashi mumkin. Mikro plastinka turiga qarab, har bir quduq, odatda, o'nlab nanolitrdan bir necha millilitrgacha bo'lgan namunaviy hajmlarni ushlab turishi mumkin. UIP400MTP hayotni tadqiq qilishda keng qo'llaniladi, ELISA (ferment bilan bog'langan immunosorbent assay) yoki PCR kabi tahlillar oldidan, oqsil tahlilidan oldin, shuningdek CHiP va CHiP-seqoldan oldin xromatin tayyorlash uchun namuna tayyorlash uchun ishlatiladi. aniqlash va boshqa analitik muolajalar (masalan, gel elektroforez, mass -spektrometriya).
10 flakongacha namuna olish uchun VialTweeter
VialTweeter - bu bir vaqtning o'zida 10 tagacha flakonni samarali va qulay sonikatsiyalash imkonini beradigan, keng qo'llaniladigan laboratoriya ultrasoniklashtiruvchi VialTweeter. Shishalar va probirkalar (masalan, Eppendorf flakonlari, krio flakonlar, santrifüj naychalari) bilvosita sonikatsiya qilinganligi sababli, har qanday o'zaro kontaminatsiyani oldini oladi. Har bir namunaga bir xil ultratovush intensivligi etkazib berilgandek, sonikatsiyaning barcha natijalari bir hil va takrorlanadi. VialTweeter boshqa raqamli qurilmalarimiz kabi barcha aqlli funktsiyalarni taklif qiladi (masalan, aqlli menyu, dasturlashtiriladigan sozlamalar, haroratni nazorat qilish, masofadan boshqarish pulti va boshqalar), shuning uchun eng yuqori qulaylik ta'minlanadi.
Microwell plitalari uchun ko'p barmoqli problar
UP200Ht va UP200St ultrasonik zondli homogenizatorlar uchun mavjud, 4 yoki 8 barmoqli ko'p barmoqli problar bir xil namunalarda bir vaqtning o'zida sonikatsiya qilishning qulay variantidir. Masalan, sonotrode MTP-24-8-96-bu sakkiz barmoqli zond, bu avtomatlashtirilgan tizimlarga integratsiyalashish yoki ko'p quduqli plitalar quduqlarini qo'lda namuna tayyorlash uchun ideal. Ko'p barmoqli sonotrod laboratoriyalar uchun avtomatlashtirilgan uchun juda mos keladi, bu erda asosan standart ultrasonik sonotrod yordamida stakan va probirkalar qayta ishlanadi. Ko'p barmoqli va standart problar bir necha daqiqada tezda o'zgarishi mumkin, bitta probli ultrasonikatorni ko'p probli ultrasonik buzgichga aylantiradi.
Hielscher DNK parchalanishi uchun ultrasonikatorlar
Hielscher Ultrasonics DNK, RNK va xromatinning parchalanishi uchun turli xil ultratovushli platformalarni taklif qiladi. Bu turli xil platformalarga ultratovushli problar (sonotrodlar), bir vaqtning o'zida bir nechta naychalarni yoki ko'p quduqli plastinkalarni (masalan, 96 quduqli plastinkalar, mikrotiterli plitalar), sonoreaktorlar va ultrasonik krujkalarni namuna tayyorlash uchun bilvosita sonikatsiya echimlari kiradi. DNKni qirqish uchun barcha platformalar aniq boshqariladigan va takrorlanadigan natijalarni beradigan chastotali sozlangan, yuqori samarali ultratovushli protsessorlar bilan quvvatlanadi.
Har qanday namuna va o'lchamdagi ultratovushli protsessorlar
Hielscher-ning ko'p namunali ultrasonikatorlari VialTweeter (10 tagacha probirka uchun) va UIP400MTP (mikroto'lqinli plastinkalar/ ko'p qavatli plitalar uchun) yordamida DNK bo'laklarining kerakli o'lchamlari taqsimoti va hosilini olish bilan birga, intensiv va aniq nazorat qilinadigan ultrasonikatsiya tufayli namunalarni qayta ishlash vaqtini qisqartirish oson bo'ladi. . Ultrasonik DNK parchalanishi namuna tayyorlashni samarali, ishonchli va o'lchovli qiladi. Doimiy nazorat qilinadigan ultratovush yordamida protokollarni birdan bir nechta namunalarga chiziqli o'lchash mumkin.
Birdan besh barmoqli probli ultrasonikatorlar kichikroq namuna raqamlarini tayyorlash uchun idealdir. Hielscher laboratoriyasining ultratovush o'lchagichlari har xil o'lchamlarda mavjud, shuning uchun biz sizga ilovangiz va talablaringiz uchun ideal qurilmani tavsiya qila olamiz.
aniq jarayon nazorat qilish
To'liq sonifikatsiya DNK, RNK va xromatinni yo'q qilishi mumkin, lekin ultratovushni etarli darajada qirqish natijasida DNK va xromatin parchalari juda uzun bo'ladi, chunki aniq nazorat qilinadigan sonikatsiya parametrlari juda muhimdir. Hielscher raqamli ultrasonikatorlarini aniq sonikatsiya parametriga osongina o'rnatish mumkin. Maxsus sonikatsiya sozlamalari xuddi shu protsedurani tez takrorlash uchun dasturlashtirilgan sozlamalar sifatida saqlanishi mumkin.
Barcha sonikatsiya avtomatik tarzda protokollanadi va o'rnatilgan SD-kartada CSV fayli sifatida saqlanadi. Bu bajarilgan sinovlarni aniq hujjatlashtirishga imkon beradi va sonikatsiya jarayonlarini osongina qayta ko'rib chiqish imkonini beradi.
Brauzerni masofadan boshqarish pulti yordamida barcha raqamli ultrasonikatorlarni istalgan standart brauzer orqali boshqarish va nazorat qilish mumkin. Qo'shimcha dasturiy ta'minotni o'rnatish shart emas, chunki LAN ulanishi plagin-o'ynashni juda oddiy sozlash imkonini beradi.
Ultrasonik namuna tayyorlashda foydalanuvchilar uchun eng qulaylik
Hamma Hielscher ultrasonikatorlari yuqori samarali ultratovushni etkazib berish uchun mo'ljallangan, shu bilan birga har doim foydalanuvchilar uchun juda qulay va ishlatish oson. Barcha sozlamalar aniq menyuda yaxshi tuzilgan bo'lib, unga rangli sensorli displey yoki brauzerning masofadan boshqarish pulti orqali osongina kirish mumkin. Dasturlashtiriladigan sozlamalar va ma'lumotlarni avtomatik yozib oladigan aqlli dasturiy ta'minot ishonchli va takrorlanadigan natijalar uchun optimal sonikatsiya sozlamalarini ta'minlaydi. Toza va ishlatish uchun qulay menyu interfeysi Hielscher ultrasonikatorlarini foydalanuvchilar uchun qulay va samarali qurilmalarga aylantiradi.
Quyidagi jadvalda DNK va RNK parchalanishi, hujayra lizisi, shuningdek oqsil ekstraktsiyasi kabi namunalarni tayyorlash vazifalari uchun ideal bo'lgan laboratoriya ultrasonikatorlarining taxminiy ishlov berish quvvati ko'rsatilgan.
| Qurilma | Quvvat [V] | shrift | Volume [ml] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | mikroto'lqinlar uchun | 6 – 3456 ta quduq | VialTweeter | 200 | 10 flakongacha, shuningdek, qisish imkoniyati | 0.5 – 1,5 |
| UP50H | 50 | Tekshirish-turi | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | Tekshirish-turi | 0.01 – 500 |
| Uf200 ः t | 200 | Tekshirish-turi | 0.1 – 1000 |
| UP200St | 200 | Tekshirish-turi | 0.1 – 1000 |
| UP400St | 400 | Tekshirish-turi | 5.0 – 2000 yil |
| Cuphorn | 200 | CupHorn, sonoreactor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | ifloslanish-ochiq oqimi hujayra |
Biz bilan bog'lanish! Bizdan so'rang!
Ultrasonik ko'p namunali tayyorgarlik birligi VialTweeter bir vaqtning o'zida 10 flakongacha sonikatsiyalashga imkon beradi. VialPress mahkamlash moslamasi yordamida intensiv sonikatsiya qilish uchun 4 tagacha qo'shimcha naychani old tomonga bosish mumkin.
Sonotrode MTP-24-8-96 mikrotiter plitalarining quduqlarini ultratovush qilish uchun sakkizta ultratovushli proba mavjud.
Adabiyotlar / Adabiyotlar
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Bilishingiz kerak bo'lgan dalillar
Keyingi avlodlar ketma -ketligi nima?
Keyingi avlod ketma-ketligi, shuningdek, keyingi avlodlar ketma-ketligi (NGS), yuqori o'tkazuvchanlik ketma-ketligi yoki ikkinchi avlod ketma-ketligi, massiv parallel ketma-ketlikning yondashuvini bildiradi, bu erda millionlab bo'laklarning DNKlarining katta (massiv) miqdori bir vaqtning o'zida parallel ravishda ketma-ketlikda joylashtiriladi. har yugurish uchun.
Keyingi avlod ketma-ketligini amalga oshirish uchun (1) kutubxona tayyorlash, (2) ketma-ketlik va (3) ma'lumotlarni tahlil qilishning uchta asosiy bosqichi bajarilishi kerak. Kutubxonaga tayyorgarlik jarayonida DNK iplari ma'lum uzunlikdagi DNK bo'laklariga bo'linishi kerak. Sonikatsiya DNKni parchalashning afzal qilingan usullaridan biridir.
DNK ketma -ketligi jarayonida DNKdagi nukleotidlarning tartibi – nuklein kislotasi ketma -ketligi deb nomlanadi - aniqlanadi. Nuklein kislotasi ketma -ketligi to'rtta nukleotid asosidan iborat - adenin, sitozin, guanin, timin – ma'lumot uchun qaysi kod.
DNK va RNK ketma-ketligi genomik tadqiqotlar, saraton kasalliklari tadqiqotlari, noyob va murakkab kasalliklarni tadqiq qilish, mikrobial tadqiqotlar, agrigenomika va boshqa ko'plab tadqiqot sohalarida keng qo'llanilganligi sababli, keyingi avlod sekvensiyasi hayotiy fan va shaxsiylashtirilgan tibbiyotda izlanishlar olib bormoqda.
Yangi avlod ketma -ketligi va Sanger ketma -ketligi
Yangi avlod ketma -ketligi (NGS) yordamida ko'p sonli genomik namunalarni ketma -ketlikda tartiblash mumkin, Sanger ketma -ketligi (zanjirni tugatish usuli yoki Birinchi avlod ketma -ketligi deb ham ataladi) faqat kichik sonli raqamlarni ketma -ketlikda yozish imkoniyatiga ega. Sanger bir vaqtning o'zida faqat bitta DNK fragmentini ketma -ketlikda ajratadi va uni bir kunda bajarish mumkin. Aniqligi tufayli Sanger sekventsiyasi, shuningdek, keyingi avlod sekansirovkasi natijasida olingan natijalarni tekshirish uchun ishlatiladigan oltin standartli texnologiya hisoblanadi.
Sanger ketma-ketligi o'qish uzunligi taxminan 800 ot kuchiga etadi (odatda boyitilmagan DNK bilan 500-600 bp). Sanger ketma -ketligidagi o'qish uzunliklari, boshqa ketma -ketlik usullariga nisbatan, ayniqsa, genomning takrorlanuvchi hududlarini ketma -ketligi jihatidan muhim afzalliklarga ega. Qisqa o'qiladigan ketma-ketlik ma'lumotlarining muammosi, ayniqsa, yangi genomlarni (de novo) va saraton genomlari yoki strukturaviy o'zgaruvchanlik ko'rsatadigan xromosomalar hududlarida uchraydigan, yuqori darajadagi qayta joylashtirilgan genom segmentlarini ketma-ketlikda tartibga solish masalasidir. [cp. Morozova va Marra, 2008 yil.
Hielscher Ultrasonics kompaniyasi yuqori samarali ultratovushli homogenizatorlarni ishlab chiqaradi laboratoriya uchun sanoat hajmi.